引用本文： 焦明菲, 李辉, 曹靖靖, 寇振宇, 吴桂佳, 刘爱华, 东莉洁. 糖尿病小鼠视网膜p21活化激酶4表达上调及其对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响. 中华眼底病杂志, 2023, 39(5): 401-407. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220418-00224 复制
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糖尿病视网膜病变（DR）的发展过程中，视网膜血管内皮细胞功能障碍是多因素病理学的重要启动因素，这取决于代谢异常和炎症。新的研究证据表明，视网膜血管内皮细胞代谢异常和炎症与损伤的发生和进展有关[1-2]。然而，没有有效的药物可用于治疗血管内皮细胞损伤。线粒体是细胞能量代谢的核心参与者，其功能障碍会诱发呼吸紊乱、产能异常、代谢失调，进而触发相关疾病[3]。DR可见视网膜线粒体肿胀，膜完整性受损，超氧化物水平升高等一系列病理改变[4]。这提示保护线粒体功能与DR的发生发展密切相关。p21活化激酶4（PAK4）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，在细胞粘附、迁移和增生调控中均有作用体现[5-6]。既往文献报道，PAK4高表达通过代谢重编程促进结肠癌细胞增生，并在病毒介导的神经炎症中调节促炎因子的表达[7]。鉴于PAK4本身的作用，我们推测PAK4的异常表达可能对糖尿病微环境下视网膜内皮细胞功能发挥具有潜在影响。本研究重点关注糖尿病状态下PAK4在视网膜中的表达以及对视网膜血管内皮细胞线粒体功能的作用，并检测其对细胞迁移和白细胞粘附的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
动物模型建立和分组。健康C57BL/6J雄性小鼠12只，7日龄，体重（3.52±0.35）g，清洁级，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。本研究由天津医科大学眼科医院动物伦理委员会批准（动物伦理批号：TJYY20190103002）。小鼠随机分为糖尿病组、正常对照组，每组6只。小鼠8周龄时，禁食12 h，糖尿病组小鼠按体重腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素，连续5 d，2周后小鼠尾静脉平均血糖＞16.7 mmol/L为建模成功[8]。对照组小鼠腹腔注射等体积柠檬酸钠溶液（pH 4.5）。建模后8周进行后续实验。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测糖尿病组、正常对照组小鼠视网膜中PAK4蛋白表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，分离视网膜。收集各组视网膜总蛋白，调整蛋白浓度。取40 μg蛋白样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V 恒压0.5 h，分离胶100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，牛血清白蛋白封闭，一抗PAK4（英国Abcam公司） 4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，3次； 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（美国Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化学发光底物进行曝光并拍照。以β-肌动蛋白为内参照，采用Bio-Rad软件进行半定量灰度分析。实验重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测糖尿病组、正常对照组小鼠视网膜中PAK4 mRNA表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，分离视网膜。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，应用Primer Premier软件设计引物序列。PAK4正向引物：GGACATCAAGAGCGACTCGAT，反向引物：CGACCAGCGACTTCCTTCG；GAPDH正向引物：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向引物：CGCCCCACTTGATTTTGG。384孔板中依此加入2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，以离心半径32.65 cm、1 500 r/min离心5 min。应用实时荧光qPCR进行检测，通过2−△△CT计算mRNA相对表达量。实验重复3次。
1.2 体外细胞实验
细胞培养和分组。人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC，本实验室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。3～5 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。细胞分为N+糖基化终末产物（AGE）组（N组）、空载体+AGE组（Vector组）、PAK4过表达+AGE组（PAK4组）。N组为常规培养细胞加入150 μg/ml AGE处理诱导细胞；Vector组转染空载质粒，同时联合AGE诱导；PAK4组应用转染试剂脂质体2000将pcDNA-PAK4真核表达质粒导入细胞中，同时联合AGE诱导。Vector组、PAK4组细胞转染24 h后，加入AGE诱导，浓度同N组。采用Western blot、qPCR检测PAK4的转染效率达到过表达。实验重复3次。
细胞划痕实验检测N组、Vector组、PAK4组hRMEC内细胞迁移情况。以细胞密度6×105个/孔将细胞接种于6孔板，每孔最终体系为2 ml，待生长融合为单层细胞后，用100～1 000 μl微量加样枪头于每孔中央行“十”字形划痕，PBS冲洗后拍照。按实验分组予干预刺激，常规培养24 h后于相同位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区的迁移情况，采用CellSens Standard软件测量裸区面积。实验重复3次，按以下公式计算迁移率。迁移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸区面积，St：各时间点裸区面积）。实验重复3次。
白细胞粘附实验检测N组、Vector组、PAK4组hRMEC上白细胞粘附情况。取C57BL/6J雄性小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心脏处取血并与等体积PBS混合，Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。部分PBMC与hRMEC共培养，4', 6-二脒基-2 -苯基吲哚染色，荧光显微镜观察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的无血清RPMI 1640培养基中，羧基荧光素乙酰氧基甲酯（目录号：76823-03-5）标记45 min；汉可氏平衡盐溶液洗涤去除游离染料，与AGE诱导且经肿瘤坏死因子-α处理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附细胞并细胞重悬后，流式细胞仪采集荧光信号，FlowJo软件定量分析粘附的白细胞数量。实验重复3次。
Seahorse XFe 96细胞能量代谢仪检测hRMEC线粒体压力。以细胞密度2×104个/孔将细胞接种于XFe 96孔微孔板中，各组进行相应处理后，依次添加寡霉素、羰基氰-4、鱼藤酮、抗霉素A，测定线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸与备用呼吸能力（图1）。
图1
线粒体压力测量示意图
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析。采用Graph-prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 糖尿病小鼠视网膜中PAK4表达升高
与正常对照组小鼠比较，糖尿病组小鼠视网膜中PAK4 mRNA、蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（t=22.419、25.372，P＜0.01、＜0.001）（图2）。
图2
正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜中PAK4表达比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌动蛋白。2A示两组PAK4 mRNA相对表达量结果，**P＜0.01；2B、2C分别示两组PAK4电泳图和PAK4蛋白相对量表达结果，***P＜0.001
2.2 PAK4诱导hRMEC迁移
与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相对表达量和细胞迁移率均显著升高，差异有统计学意义（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.01）（图3，4）。
图3
N组、Vector组、PAK4组细胞转染PAK4后PAK4表达比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌动蛋白；N组：常规培养细胞，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。3A、3B分别示3组电泳图、PAK4蛋白相对表达量结果，**P＜0.01；3C示3组PAK4 mRNA相对表达量结果，**P＜0.01
图4
N组、Vector组、PAK4组细胞迁移情况比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。4A～4C分别示N组、Vector组、PAK4组细胞显微镜像， N组、Vector组仅有少量细胞迁移进入裸区，PAK4组可见大量细胞迁移进入裸区，标尺：100 μm；4D示3组细胞迁移率比较，**P＜0.01
2.3 PAK4可诱导白细胞粘附于hRMEC
流式细胞仪检测结果显示，与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC上白细胞粘附数量明显升高，差异有统计学意义（F=39.649，P＜0.01）（图5）。
图5
N组、Vector组、PAK4组共培养hRMEC上白细胞粘附情况比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。5A～5C分别示N组、Vector组、PAK4组流式细胞仪检测像；5D示3组共培养hRMEC上白细胞粘附检测结果，**P＜0.01
2.4 PAK4可抑制hRMEC线粒体氧化磷酸化
线粒体压力测量结果显示，N组、Vector组、PAK4组hRMEC内线粒体基础呼吸分别为2.21、2.31、1.51，ATP产生分别为1.62、1.64、1.23，最大呼吸分别为3.22、3.21、1.27，备用呼吸能力分别为1.26、1.29、0.14。与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC内线粒体基础呼吸、ATP生成、最大呼吸与备用呼吸能力均减弱，差异有统计学意义（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）（图6）。
图6
N组、Vector组、PAK4组hRMEC内线粒体压力检测（n=3） OCR：耗氧率；PAK4：p21活化激酶4； hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ATP：三磷酸腺苷；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入 150 μg/ml AGE诱导。*P＜0.05
3 讨论
视网膜是中枢神经系统的一部分，需消耗大量葡萄糖和氧气，通过线粒体氧化磷酸化产生ATP，以实现其光转导和视觉功能[9]。糖代谢产物AGE在人体内的积累可能诱发氧化应激，导致线粒体发生损伤，紊乱氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循环之间的动态平衡，诱发氧化应激与炎症的发生，导致血管内皮细胞的增生迁移，引发内皮细胞功能障碍，最终导致新生血管形成，加重DR进展[10-11]。因此，维持视网膜血管内皮细胞线粒体稳态，保护线粒体的正常代谢对于改善DR至关重要。
PAK4作为丝氨酸/苏氨酸激酶家族一员，其表达水平的增加与多种类型的疾病密切相关[12-13]。PAK4可促进结肠癌细胞对葡萄糖的摄入和脂质生物合成，启动结肠癌细胞的线粒体功能异常，导致癌细胞代谢重编程，进而促进结肠癌细胞的增生[14]。PAK4过表达可以促进细胞增生、侵袭和迁移，调节细胞骨架组织并增加细胞粘附力[15]。在神经炎症中，PAK4的激活与脑炎病毒介导的炎性因子的表达增加有关[7]，而抑制PAK4可抑制胶质母细胞瘤的肿瘤内皮细胞粘附蛋白的生成，减少血管异常，同时抑制白细胞对内皮细胞的粘附[16-17]。本研究首先构建糖尿病小鼠模型并明确其视网膜中PAK4表达水平显著高于正常对照组，提示PAK4与DR的发生发展可能存在潜在关联。
为进一步明确PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞生物学行为及线粒体功能的影响。本研究将PAK4真核表达质粒导入hRMEC以实现PAK4高表达，并在此基础上通过相关实验评价PAK4在糖尿病微环境下的作用，发现PAK4可显著促进视网膜血管内皮细胞的迁移以及白细胞粘附。在糖尿病早期粘附分子及炎性因子表达上调可促进白细胞与血管内皮的粘附[18]。作为炎症反应中的关键步骤，白细胞粘附损伤视网膜血管内皮细胞，破坏血视网膜屏障完整性[19]。此外，本研究采用细胞能量代谢分析仪（Seahorse），通过线粒体应激压力实验分析PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞线粒体功能的影响。Seahorse是检测线粒体功能和细胞代谢的工具，可以实时且以不需要任何染料或标记物的非侵入性方式测量线粒体呼吸，并以基础呼吸、ATP生成、质子漏、最大呼吸值、能量储备能力等多方面数据输出结果[20-21]。线粒体压力测试结果显示，PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞基础呼吸值、ATP生成、最大呼吸值、呼吸储备能力有明显抑制作用。
本研究通过观察动物及细胞模型中PAK4的表达水平及线粒体呼吸变化，初步判断PAK4可能通过影响线粒体稳态诱导白细胞粘附以及视网膜血管内皮细胞迁移。今后应进一步完善实验方案，后续研究希望以PAK4抑制剂为干预手段，开发其药用价值为治疗DR提供新的策略。更加深刻地解读PAK4的炎症调控作用，包括PAK4抑制剂对视网膜血管内皮细胞粘附分子及炎性介质表达的影响，对线粒体氧化应激及能量代谢的调控等。
糖尿病视网膜病变（DR）的发展过程中，视网膜血管内皮细胞功能障碍是多因素病理学的重要启动因素，这取决于代谢异常和炎症。新的研究证据表明，视网膜血管内皮细胞代谢异常和炎症与损伤的发生和进展有关[1-2]。然而，没有有效的药物可用于治疗血管内皮细胞损伤。线粒体是细胞能量代谢的核心参与者，其功能障碍会诱发呼吸紊乱、产能异常、代谢失调，进而触发相关疾病[3]。DR可见视网膜线粒体肿胀，膜完整性受损，超氧化物水平升高等一系列病理改变[4]。这提示保护线粒体功能与DR的发生发展密切相关。p21活化激酶4（PAK4）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，在细胞粘附、迁移和增生调控中均有作用体现[5-6]。既往文献报道，PAK4高表达通过代谢重编程促进结肠癌细胞增生，并在病毒介导的神经炎症中调节促炎因子的表达[7]。鉴于PAK4本身的作用，我们推测PAK4的异常表达可能对糖尿病微环境下视网膜内皮细胞功能发挥具有潜在影响。本研究重点关注糖尿病状态下PAK4在视网膜中的表达以及对视网膜血管内皮细胞线粒体功能的作用，并检测其对细胞迁移和白细胞粘附的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
动物模型建立和分组。健康C57BL/6J雄性小鼠12只，7日龄，体重（3.52±0.35）g，清洁级，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。本研究由天津医科大学眼科医院动物伦理委员会批准（动物伦理批号：TJYY20190103002）。小鼠随机分为糖尿病组、正常对照组，每组6只。小鼠8周龄时，禁食12 h，糖尿病组小鼠按体重腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素，连续5 d，2周后小鼠尾静脉平均血糖＞16.7 mmol/L为建模成功[8]。对照组小鼠腹腔注射等体积柠檬酸钠溶液（pH 4.5）。建模后8周进行后续实验。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测糖尿病组、正常对照组小鼠视网膜中PAK4蛋白表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，分离视网膜。收集各组视网膜总蛋白，调整蛋白浓度。取40 μg蛋白样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V 恒压0.5 h，分离胶100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，牛血清白蛋白封闭，一抗PAK4（英国Abcam公司） 4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，3次； 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（美国Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化学发光底物进行曝光并拍照。以β-肌动蛋白为内参照，采用Bio-Rad软件进行半定量灰度分析。实验重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测糖尿病组、正常对照组小鼠视网膜中PAK4 mRNA表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，分离视网膜。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，应用Primer Premier软件设计引物序列。PAK4正向引物：GGACATCAAGAGCGACTCGAT，反向引物：CGACCAGCGACTTCCTTCG；GAPDH正向引物：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向引物：CGCCCCACTTGATTTTGG。384孔板中依此加入2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，以离心半径32.65 cm、1 500 r/min离心5 min。应用实时荧光qPCR进行检测，通过2−△△CT计算mRNA相对表达量。实验重复3次。
1.2 体外细胞实验
细胞培养和分组。人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC，本实验室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。3～5 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。细胞分为N+糖基化终末产物（AGE）组（N组）、空载体+AGE组（Vector组）、PAK4过表达+AGE组（PAK4组）。N组为常规培养细胞加入150 μg/ml AGE处理诱导细胞；Vector组转染空载质粒，同时联合AGE诱导；PAK4组应用转染试剂脂质体2000将pcDNA-PAK4真核表达质粒导入细胞中，同时联合AGE诱导。Vector组、PAK4组细胞转染24 h后，加入AGE诱导，浓度同N组。采用Western blot、qPCR检测PAK4的转染效率达到过表达。实验重复3次。
细胞划痕实验检测N组、Vector组、PAK4组hRMEC内细胞迁移情况。以细胞密度6×105个/孔将细胞接种于6孔板，每孔最终体系为2 ml，待生长融合为单层细胞后，用100～1 000 μl微量加样枪头于每孔中央行“十”字形划痕，PBS冲洗后拍照。按实验分组予干预刺激，常规培养24 h后于相同位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区的迁移情况，采用CellSens Standard软件测量裸区面积。实验重复3次，按以下公式计算迁移率。迁移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸区面积，St：各时间点裸区面积）。实验重复3次。
白细胞粘附实验检测N组、Vector组、PAK4组hRMEC上白细胞粘附情况。取C57BL/6J雄性小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心脏处取血并与等体积PBS混合，Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。部分PBMC与hRMEC共培养，4', 6-二脒基-2 -苯基吲哚染色，荧光显微镜观察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的无血清RPMI 1640培养基中，羧基荧光素乙酰氧基甲酯（目录号：76823-03-5）标记45 min；汉可氏平衡盐溶液洗涤去除游离染料，与AGE诱导且经肿瘤坏死因子-α处理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附细胞并细胞重悬后，流式细胞仪采集荧光信号，FlowJo软件定量分析粘附的白细胞数量。实验重复3次。
Seahorse XFe 96细胞能量代谢仪检测hRMEC线粒体压力。以细胞密度2×104个/孔将细胞接种于XFe 96孔微孔板中，各组进行相应处理后，依次添加寡霉素、羰基氰-4、鱼藤酮、抗霉素A，测定线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸与备用呼吸能力（图1）。
图1
线粒体压力测量示意图
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析。采用Graph-prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 糖尿病小鼠视网膜中PAK4表达升高
与正常对照组小鼠比较，糖尿病组小鼠视网膜中PAK4 mRNA、蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（t=22.419、25.372，P＜0.01、＜0.001）（图2）。
图2
正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜中PAK4表达比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌动蛋白。2A示两组PAK4 mRNA相对表达量结果，**P＜0.01；2B、2C分别示两组PAK4电泳图和PAK4蛋白相对量表达结果，***P＜0.001
2.2 PAK4诱导hRMEC迁移
与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相对表达量和细胞迁移率均显著升高，差异有统计学意义（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.01）（图3，4）。
图3
N组、Vector组、PAK4组细胞转染PAK4后PAK4表达比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌动蛋白；N组：常规培养细胞，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。3A、3B分别示3组电泳图、PAK4蛋白相对表达量结果，**P＜0.01；3C示3组PAK4 mRNA相对表达量结果，**P＜0.01
图4
N组、Vector组、PAK4组细胞迁移情况比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。4A～4C分别示N组、Vector组、PAK4组细胞显微镜像， N组、Vector组仅有少量细胞迁移进入裸区，PAK4组可见大量细胞迁移进入裸区，标尺：100 μm；4D示3组细胞迁移率比较，**P＜0.01
2.3 PAK4可诱导白细胞粘附于hRMEC
流式细胞仪检测结果显示，与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC上白细胞粘附数量明显升高，差异有统计学意义（F=39.649，P＜0.01）（图5）。
图5
N组、Vector组、PAK4组共培养hRMEC上白细胞粘附情况比较（n=3） PAK4：p21活化激酶4；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导。5A～5C分别示N组、Vector组、PAK4组流式细胞仪检测像；5D示3组共培养hRMEC上白细胞粘附检测结果，**P＜0.01
2.4 PAK4可抑制hRMEC线粒体氧化磷酸化
线粒体压力测量结果显示，N组、Vector组、PAK4组hRMEC内线粒体基础呼吸分别为2.21、2.31、1.51，ATP产生分别为1.62、1.64、1.23，最大呼吸分别为3.22、3.21、1.27，备用呼吸能力分别为1.26、1.29、0.14。与N组、Vector组比较，PAK4组hRMEC内线粒体基础呼吸、ATP生成、最大呼吸与备用呼吸能力均减弱，差异有统计学意义（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）（图6）。
图6
N组、Vector组、PAK4组hRMEC内线粒体压力检测（n=3） OCR：耗氧率；PAK4：p21活化激酶4； hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ATP：三磷酸腺苷；N组：常规培养细胞组，加入150 μg/ml糖基化终末产物（AGE）诱导；Vector组：转染空载质粒组，加入150 μg/ml AGE诱导；PAK4组：转染PAK4质粒组，加入 150 μg/ml AGE诱导。*P＜0.05
3 讨论
视网膜是中枢神经系统的一部分，需消耗大量葡萄糖和氧气，通过线粒体氧化磷酸化产生ATP，以实现其光转导和视觉功能[9]。糖代谢产物AGE在人体内的积累可能诱发氧化应激，导致线粒体发生损伤，紊乱氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循环之间的动态平衡，诱发氧化应激与炎症的发生，导致血管内皮细胞的增生迁移，引发内皮细胞功能障碍，最终导致新生血管形成，加重DR进展[10-11]。因此，维持视网膜血管内皮细胞线粒体稳态，保护线粒体的正常代谢对于改善DR至关重要。
PAK4作为丝氨酸/苏氨酸激酶家族一员，其表达水平的增加与多种类型的疾病密切相关[12-13]。PAK4可促进结肠癌细胞对葡萄糖的摄入和脂质生物合成，启动结肠癌细胞的线粒体功能异常，导致癌细胞代谢重编程，进而促进结肠癌细胞的增生[14]。PAK4过表达可以促进细胞增生、侵袭和迁移，调节细胞骨架组织并增加细胞粘附力[15]。在神经炎症中，PAK4的激活与脑炎病毒介导的炎性因子的表达增加有关[7]，而抑制PAK4可抑制胶质母细胞瘤的肿瘤内皮细胞粘附蛋白的生成，减少血管异常，同时抑制白细胞对内皮细胞的粘附[16-17]。本研究首先构建糖尿病小鼠模型并明确其视网膜中PAK4表达水平显著高于正常对照组，提示PAK4与DR的发生发展可能存在潜在关联。
为进一步明确PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞生物学行为及线粒体功能的影响。本研究将PAK4真核表达质粒导入hRMEC以实现PAK4高表达，并在此基础上通过相关实验评价PAK4在糖尿病微环境下的作用，发现PAK4可显著促进视网膜血管内皮细胞的迁移以及白细胞粘附。在糖尿病早期粘附分子及炎性因子表达上调可促进白细胞与血管内皮的粘附[18]。作为炎症反应中的关键步骤，白细胞粘附损伤视网膜血管内皮细胞，破坏血视网膜屏障完整性[19]。此外，本研究采用细胞能量代谢分析仪（Seahorse），通过线粒体应激压力实验分析PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞线粒体功能的影响。Seahorse是检测线粒体功能和细胞代谢的工具，可以实时且以不需要任何染料或标记物的非侵入性方式测量线粒体呼吸，并以基础呼吸、ATP生成、质子漏、最大呼吸值、能量储备能力等多方面数据输出结果[20-21]。线粒体压力测试结果显示，PAK4高表达对视网膜血管内皮细胞基础呼吸值、ATP生成、最大呼吸值、呼吸储备能力有明显抑制作用。
本研究通过观察动物及细胞模型中PAK4的表达水平及线粒体呼吸变化，初步判断PAK4可能通过影响线粒体稳态诱导白细胞粘附以及视网膜血管内皮细胞迁移。今后应进一步完善实验方案，后续研究希望以PAK4抑制剂为干预手段，开发其药用价值为治疗DR提供新的策略。更加深刻地解读PAK4的炎症调控作用，包括PAK4抑制剂对视网膜血管内皮细胞粘附分子及炎性介质表达的影响，对线粒体氧化应激及能量代谢的调控等。
