引用本文： 王小东, 王彤, 张红兵. 非动脉炎性前部缺血性视神经病变患者高密度脂蛋白胆固醇和胆固醇酯转运蛋白TaqⅠB基因多态性研究. 中华眼底病杂志, 2016, 32(6): 587-590. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.006 复制
非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NA-AION)是一种视盘循环障碍性疾病，由于供应视盘的睫状后短动脉供血不足，导致视盘的缺血性改变；其发病机制与缺血性脑卒中相似[1]。已有研究表明，胆固醇酯转运蛋白(CETP) TaqⅠB基因多态性B1等位基因和血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)功能异常是缺血性脑卒中的危险因素[2, 3]。但CETP TaqⅠB基因多态性和HDL-C是否在NA-AION发生发展中发挥作用目前并不清楚。为此，我们对一组NA-AION患者的CETPTaqⅠB基因多态性和血浆HDL-C进行了检测，以观察CETPTaqⅠB基因多态性和血浆HDL-C与NA-AION之间的相关性。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为经医院伦理委员会批准并获受检者知情同意的配比病例对照研究；所有受检者均为陕西籍并长期居住在陕西的汉族人，个体间无血缘关系。
2008年2月到2015年8月我院检查确诊的NA-AION患者45例(NA-AION组)纳入研究。其中，男性34例，女性11例。年龄48~74岁，平均年龄(60.0±6.9)岁。患者均主诉视力突然下降。行眼底、眼压、视野、视觉电生理、光相干断层扫描、荧光素眼底血管造影检查，其结果符合NA-AION临床诊断标准[1]。除外糖尿病、严重心脑血管疾病、肝肾功能不全等影响血脂水平疾病者。采用1 :1配比法, 选择年龄、性别与NA-AION患者相匹配的健康体检者作为对照组。
实验室检测在我院陕西省眼科重点实验室完成。抽取受检者安静状态下静脉血5 ml, 1 :6枸橼酸钠抗凝, 离心半径10 cm，2000 r/min离心10 min, 收集血细胞、血浆。应用日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪酶联免疫一步法检测血浆总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、HDL-C浓度；按试剂盒参考值，HDL-C浓度低于1.20 mmol/L为低HDL-C血症。采用低渗溶血-盐析法提取外周血白细胞基因组DNA，应用Primer 5.0软件设计针对CETP) TaqⅠB基因的序列引物，由上海生物工程公司合成。聚合酶链反应(PCR)扩增相应CETP目的片断, 引物1(P1)：5′-CACTAGCCCAGA GAGAGGAGTGCC-3′, 引物2(P2)：5′-CTGAGCCC AGCCGCACACTAA-3′[4]。反应体系25.00 μl中，10倍PCR反应缓冲液5.00 μl，MgCl2 4.00 μl，10 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸1.00 μl，P1、P2各2.00 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，基因组DNA 5.00 μl。PCR反应条件及时间，95℃预变性5 min, 95℃变性30 s；62℃退火30 s；72℃延伸60 s；循环35次, 72℃延伸7 min。PCR扩增产物TaqⅠ酶切, 采用限制性片段长度多态性PCR (PCR-RFLP)方法进行基因分型，以2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片断，仅出现535碱基对(bp)1条荧光带者为B2B2基因型；出现361、174 bp 2条荧光带者为B1B1基因型；出现535、361、174 bp 3条荧光带者为B1B2基因型[4](图 1)。
图1
CETP酶切电泳图。M:Marker；1、4:B1B2基因型；2、3、6:B2B2基因型；5:B1B1基因型
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析处理。计量资料符合正态分布的以均数±标准差(x±s)表示, 计数资料采用M(QR)表示。受检者血脂样本均数间比较行t检验；基因型频率及等位基因频率之间比较和两组基因型Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验行χ2检验。Logistics回归分析基因型及HDL-C对疾病发生的相对危险度。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
NA-AION组、对照组受检者血浆TC、TG浓度比较，差异无统计学意义(t=1.907、1.877，P=0.063、0.067)；NA-AION组受检者血浆HDL-C浓度明显低于对照组受检者，差异有统计学意义(t=2.367，P=0.022)(表 1)。Logistics回归分析结果显示，低HDL-C浓度为NA-AION发病的危险因素[比值比(OR)=6.143，95%可信区间(CI)为1.262~29.895，χ2=27.676；P=0.013]。
表1
NA-AION组、对照组受检者TC、TG、HDL-C检测结果
PCR-RFLP分析结果显示，总受检者中B1B1、B1B2、B2B2基因型频率分别为38.9%、42.2%、18.9%。等位基因B1、B2频率分别为60.0%、40.0%。NA-AION组、对照组受检者基因型频率观察数和期望数均无明显差异(χ2=0.61、0.05，P > 0.05)，受检者符合Hardy-Weinberg遗传平衡。NA-AION组受检者B1B1基因型频率高于对照组受检者，B1B2、B2B2基因型频率低于对照组受检者，差异均有统计学意义(χ2=17.289、14.706、38.444，P < 0.05)；NA-AION组受检者B1等位基因频率高于对照组受检者，B2等位基因频率低于对照组受检者，差异有统计学意义(χ2=15.648，P < 0.05)(表 2, 3)。Logistics回归分析结果显示，B1B1基因型在NA-AION患者中显著增多(OR=2.24，95%CI为2.427~36.323，χ2=10.526；P=0.001)。
表2
NA-AION组、对照组受检者基因型频率(例，%)
表3
NA-AION组、对照组受检者等位基因频率(例，%)
B1B1、B1B2、B2B2基因型者血浆TC浓度比较，差异无统计学意义(t=2.54、1.28、0.04，P > 0.05)；血浆TG浓度比较，B1B1基因型者与B1B2基因型者差异有统计学意义(t=4.50，P=0.04)，B1B1基因型者与B2B2基因型者、B1B2基因型者与B2B2基因型者比较，差异无统计学意义(t=2.62、0.02，P > 0.05)；不同基因型者之间HDL-C浓度比较，差异有统计学意义(t=3.04、4.87、5.41，P < 0.05)，B1B1基因型者血浆HDL-C浓度最低，B2B2基因型者血浆HDL-C浓度最高(表 4)。
表4
不同基因型者血浆TC、TG、HDL-C浓度检测结果
3 讨论
人类CETP基因位于第16号长臂(16q12-21)，其范围超过25×103 bp，由16个外显子和15个内含子组成，其外显子大小从32~250 bp, TaqⅠB多态性是CETP基因第一内含子中第277核苷酸突变，腺嘌呤被鸟嘌呤取代[5]。本研究结果显示，陕西汉族人群B1B1、B1B2、B2B2基因型频率分别为38.9%、42.2%、18.9%，B1、B2等位基因频率分别为60.0%和40.0%；以B1等位基因为主，与刘静等[4]对北京市自然人群及其他人群的研究结果一致[6-9]。NA-AION组受检者B1B1基因型频率高于对照组受检者，经logistics回归分析，B1B1基因型为NA-AION发病的独立危险因素。目前多数研究认为CETP TaqⅠB基因多态性与血浆HDL-C浓度有关，B2等位基因纯合子血浆HDL-C浓度最高，B1等位基因纯合子血浆HDL-C浓度最低[10, 11]。而Corella等[12]对西班牙人群、Miltiadous等[13]对瑞士正常血脂人群的研究结果却发现CETP TaqⅠB基因多态性与HDL-C浓度无关。另外Cuchel等[14]对非裔美国人群与高加索地区人群的比较研究和Mitchell等[15]对澳大利亚的意大利移民与希腊移民人群的比较研究，发现CETP TaqⅠB基因多态性与HDL-C浓度作用存在种族差异。本研究结果显示，陕西汉族人群B2B2基因型HDL-C浓度最高，B1B2基本型次之，B1B1基因型最低，三者之间差异有统计学意义。提示CETP TaqⅠB基因多态性与血浆HDL-C浓度有关。
本研究结果显示，NA-AION组、对照组受检者血浆TC、TG浓度差异无统计学意义，与王润生等[16]研究结果一致。我们进一步观察了HDL-C对NA-AION的影响，发现NA-AION组受检者HDL-C浓度低于对照组受检者，差异有统计学意义。提示低浓度HDL-C为NA-AION发病的一个危险因素。HDL-C可以增强血管壁一氧化氮的生物利用度来恢复内皮细胞的功能，抑制血管内血栓的形成[17]，其机制可能和HDL-C在mRNA水平和蛋白水平抑制细胞间黏附分子-1、血管细胞间黏附分子-1、内皮细胞选择素的表达，并抑制鞘氨醇激酶、细胞外信号调节激酶、核因子-κB信号级联反应有关[18]。HDL-C通过其抗炎、抗氧化、抗血栓作用来保护血管内皮细胞，保证睫状后动脉血液供应充足，防止NA-AION的发生。
陕西汉族人群中CETP TaqⅠB基因多态性B1等位基因对NA-AION发病有一定作用，其中B1B1基因型为NA-AION发病的危险因素，这可能与B1B1基因型下调血浆HDL-C浓度有关。另外，血浆低HDL-C浓度为陕西汉族NA-AION患者发病的独立危险因素，为进一步研究HDL-C对视网膜血管的作用提供临床支持。
非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NA-AION)是一种视盘循环障碍性疾病，由于供应视盘的睫状后短动脉供血不足，导致视盘的缺血性改变；其发病机制与缺血性脑卒中相似[1]。已有研究表明，胆固醇酯转运蛋白(CETP) TaqⅠB基因多态性B1等位基因和血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)功能异常是缺血性脑卒中的危险因素[2, 3]。但CETP TaqⅠB基因多态性和HDL-C是否在NA-AION发生发展中发挥作用目前并不清楚。为此，我们对一组NA-AION患者的CETPTaqⅠB基因多态性和血浆HDL-C进行了检测，以观察CETPTaqⅠB基因多态性和血浆HDL-C与NA-AION之间的相关性。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为经医院伦理委员会批准并获受检者知情同意的配比病例对照研究；所有受检者均为陕西籍并长期居住在陕西的汉族人，个体间无血缘关系。
2008年2月到2015年8月我院检查确诊的NA-AION患者45例(NA-AION组)纳入研究。其中，男性34例，女性11例。年龄48~74岁，平均年龄(60.0±6.9)岁。患者均主诉视力突然下降。行眼底、眼压、视野、视觉电生理、光相干断层扫描、荧光素眼底血管造影检查，其结果符合NA-AION临床诊断标准[1]。除外糖尿病、严重心脑血管疾病、肝肾功能不全等影响血脂水平疾病者。采用1 :1配比法, 选择年龄、性别与NA-AION患者相匹配的健康体检者作为对照组。
实验室检测在我院陕西省眼科重点实验室完成。抽取受检者安静状态下静脉血5 ml, 1 :6枸橼酸钠抗凝, 离心半径10 cm，2000 r/min离心10 min, 收集血细胞、血浆。应用日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪酶联免疫一步法检测血浆总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、HDL-C浓度；按试剂盒参考值，HDL-C浓度低于1.20 mmol/L为低HDL-C血症。采用低渗溶血-盐析法提取外周血白细胞基因组DNA，应用Primer 5.0软件设计针对CETP) TaqⅠB基因的序列引物，由上海生物工程公司合成。聚合酶链反应(PCR)扩增相应CETP目的片断, 引物1(P1)：5′-CACTAGCCCAGA GAGAGGAGTGCC-3′, 引物2(P2)：5′-CTGAGCCC AGCCGCACACTAA-3′[4]。反应体系25.00 μl中，10倍PCR反应缓冲液5.00 μl，MgCl2 4.00 μl，10 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸1.00 μl，P1、P2各2.00 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，基因组DNA 5.00 μl。PCR反应条件及时间，95℃预变性5 min, 95℃变性30 s；62℃退火30 s；72℃延伸60 s；循环35次, 72℃延伸7 min。PCR扩增产物TaqⅠ酶切, 采用限制性片段长度多态性PCR (PCR-RFLP)方法进行基因分型，以2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片断，仅出现535碱基对(bp)1条荧光带者为B2B2基因型；出现361、174 bp 2条荧光带者为B1B1基因型；出现535、361、174 bp 3条荧光带者为B1B2基因型[4](图 1)。
图1
CETP酶切电泳图。M:Marker；1、4:B1B2基因型；2、3、6:B2B2基因型；5:B1B1基因型
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析处理。计量资料符合正态分布的以均数±标准差(x±s)表示, 计数资料采用M(QR)表示。受检者血脂样本均数间比较行t检验；基因型频率及等位基因频率之间比较和两组基因型Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验行χ2检验。Logistics回归分析基因型及HDL-C对疾病发生的相对危险度。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
NA-AION组、对照组受检者血浆TC、TG浓度比较，差异无统计学意义(t=1.907、1.877，P=0.063、0.067)；NA-AION组受检者血浆HDL-C浓度明显低于对照组受检者，差异有统计学意义(t=2.367，P=0.022)(表 1)。Logistics回归分析结果显示，低HDL-C浓度为NA-AION发病的危险因素[比值比(OR)=6.143，95%可信区间(CI)为1.262~29.895，χ2=27.676；P=0.013]。
表1
NA-AION组、对照组受检者TC、TG、HDL-C检测结果
PCR-RFLP分析结果显示，总受检者中B1B1、B1B2、B2B2基因型频率分别为38.9%、42.2%、18.9%。等位基因B1、B2频率分别为60.0%、40.0%。NA-AION组、对照组受检者基因型频率观察数和期望数均无明显差异(χ2=0.61、0.05，P > 0.05)，受检者符合Hardy-Weinberg遗传平衡。NA-AION组受检者B1B1基因型频率高于对照组受检者，B1B2、B2B2基因型频率低于对照组受检者，差异均有统计学意义(χ2=17.289、14.706、38.444，P < 0.05)；NA-AION组受检者B1等位基因频率高于对照组受检者，B2等位基因频率低于对照组受检者，差异有统计学意义(χ2=15.648，P < 0.05)(表 2, 3)。Logistics回归分析结果显示，B1B1基因型在NA-AION患者中显著增多(OR=2.24，95%CI为2.427~36.323，χ2=10.526；P=0.001)。
表2
NA-AION组、对照组受检者基因型频率(例，%)
表3
NA-AION组、对照组受检者等位基因频率(例，%)
B1B1、B1B2、B2B2基因型者血浆TC浓度比较，差异无统计学意义(t=2.54、1.28、0.04，P > 0.05)；血浆TG浓度比较，B1B1基因型者与B1B2基因型者差异有统计学意义(t=4.50，P=0.04)，B1B1基因型者与B2B2基因型者、B1B2基因型者与B2B2基因型者比较，差异无统计学意义(t=2.62、0.02，P > 0.05)；不同基因型者之间HDL-C浓度比较，差异有统计学意义(t=3.04、4.87、5.41，P < 0.05)，B1B1基因型者血浆HDL-C浓度最低，B2B2基因型者血浆HDL-C浓度最高(表 4)。
表4
不同基因型者血浆TC、TG、HDL-C浓度检测结果
3 讨论
人类CETP基因位于第16号长臂(16q12-21)，其范围超过25×103 bp，由16个外显子和15个内含子组成，其外显子大小从32~250 bp, TaqⅠB多态性是CETP基因第一内含子中第277核苷酸突变，腺嘌呤被鸟嘌呤取代[5]。本研究结果显示，陕西汉族人群B1B1、B1B2、B2B2基因型频率分别为38.9%、42.2%、18.9%，B1、B2等位基因频率分别为60.0%和40.0%；以B1等位基因为主，与刘静等[4]对北京市自然人群及其他人群的研究结果一致[6-9]。NA-AION组受检者B1B1基因型频率高于对照组受检者，经logistics回归分析，B1B1基因型为NA-AION发病的独立危险因素。目前多数研究认为CETP TaqⅠB基因多态性与血浆HDL-C浓度有关，B2等位基因纯合子血浆HDL-C浓度最高，B1等位基因纯合子血浆HDL-C浓度最低[10, 11]。而Corella等[12]对西班牙人群、Miltiadous等[13]对瑞士正常血脂人群的研究结果却发现CETP TaqⅠB基因多态性与HDL-C浓度无关。另外Cuchel等[14]对非裔美国人群与高加索地区人群的比较研究和Mitchell等[15]对澳大利亚的意大利移民与希腊移民人群的比较研究，发现CETP TaqⅠB基因多态性与HDL-C浓度作用存在种族差异。本研究结果显示，陕西汉族人群B2B2基因型HDL-C浓度最高，B1B2基本型次之，B1B1基因型最低，三者之间差异有统计学意义。提示CETP TaqⅠB基因多态性与血浆HDL-C浓度有关。
本研究结果显示，NA-AION组、对照组受检者血浆TC、TG浓度差异无统计学意义，与王润生等[16]研究结果一致。我们进一步观察了HDL-C对NA-AION的影响，发现NA-AION组受检者HDL-C浓度低于对照组受检者，差异有统计学意义。提示低浓度HDL-C为NA-AION发病的一个危险因素。HDL-C可以增强血管壁一氧化氮的生物利用度来恢复内皮细胞的功能，抑制血管内血栓的形成[17]，其机制可能和HDL-C在mRNA水平和蛋白水平抑制细胞间黏附分子-1、血管细胞间黏附分子-1、内皮细胞选择素的表达，并抑制鞘氨醇激酶、细胞外信号调节激酶、核因子-κB信号级联反应有关[18]。HDL-C通过其抗炎、抗氧化、抗血栓作用来保护血管内皮细胞，保证睫状后动脉血液供应充足，防止NA-AION的发生。
陕西汉族人群中CETP TaqⅠB基因多态性B1等位基因对NA-AION发病有一定作用，其中B1B1基因型为NA-AION发病的危险因素，这可能与B1B1基因型下调血浆HDL-C浓度有关。另外，血浆低HDL-C浓度为陕西汉族NA-AION患者发病的独立危险因素，为进一步研究HDL-C对视网膜血管的作用提供临床支持。
