引用本文： 李陈香, 艾诗蓓, 陈忠平, 周旭霞. 普罗布考对高糖培养人视网膜Müller细胞特化蛋白1/细胞骨架相关蛋白/核因子E2相关因子2/半胱氨酸连接酶催化亚基表达的影响. 中华眼底病杂志, 2019, 35(2): 187-191. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2019.02.015 复制
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病微血管病变最常见眼部并发症[1]。既往研究表明，高糖诱导的神经元和神经胶质细胞损伤通常发生在微血管病变之前，其机制可能与氧化应激有关[2]。Müller细胞在DR的氧化应激、视网膜炎症等中起重要作用。此外，作为氧化应激的关键因子核因子E2相关因子2（Nrf2）也主要表达于Müller细胞及星形胶质细胞[3-4]。氧化应激在DR发病中的作用一直是近年国内外研究的焦点[5-6]。Nrf2信号通路是最为重要的内源性抗氧化应激通路，主要受细胞骨架相关蛋白（Keap1）调控，而特化蛋白1（SP1）则可通过调控Keap1在氧化应激中发挥作用；Nrf2能进入细胞核内与抗氧化反应元件（ARE）相结合，启动下游抗氧化基因转录，进行下游相关靶基因γ谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）等的转录，而半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）正是γ-GCL的催化亚单位，调控谷胱甘肽（GSH）的合成发挥抗氧化作用[7-8]。普罗布考为临床常用调脂药物，并具有强大的抗氧化应激作用[9]。Duan等[10]发现普罗布考通过抗氧化作用延缓糖尿病肾病的发生、发展。但其对DR作用的研究较少。本研究观察了普罗布考对高糖诱导人Müller细胞中SP1/Keap1/Nrf2/GCLC表达的影响，初步探讨普罗布考通过上述通路发挥其抗氧化作用的可能机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
意外死亡正常人供体眼球，由长沙爱尔眼科医院眼库中心提供。鼠来源谷氨酰胺合成酶（GS）多克隆抗体、兔来源SP1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），DAPI（中国Solarbio公司），兔来源Nrf2单克隆抗体、鼠来源Keap1单克隆抗体、兔来源GCLC单克隆抗体（英国Abcam公司），羊抗鼠/羊抗兔CY3二抗（美国Molecular Probe公司），Dulbecco改良Eagle培养基、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Gibico公司），Trizol试剂、CO2培养箱（美国Thermo公司），SYBR GreenⅠ（中国Vazyme公司），普罗布考（中国食品药品检定研究院），DMSO（美国Sigma公司），倒置显微镜（德国Zeiss公司），正置荧光显微镜（日本Olympus公司），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（瑞士Roche公司）。
意外死亡正常人供体眼球，采用组织块悬浮法原代培养视网膜Müller细胞，待80%细胞融合后以1∶2比例传代培养，取第3～5代细胞用于实验。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞及检测细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC的蛋白表达。GS抗体、DAPI染色观察Müller细胞形态。细胞接种于4孔板的盖玻片上，细胞爬片至80%时，弃去培养液，洗涤3次。4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入1%Triton X-100室温下孵育20 min，加入5%牛血清白蛋白37 ℃恒温箱中封闭60 min。分别加入一抗（GS 1∶100，SP1 1∶50，Nrf2 1∶500，Keap1 1∶100，GCLC 1∶100，GS 1∶100），4 ℃冰箱中孵育过夜。PBS洗涤盖玻片，加入对应荧光二抗（CY3 1∶100，异硫氰酸荧光素 1∶500）室温下避光孵育1 h，PBS洗涤后，加入DAPI（1∶4 000）室温下避光孵育5～10 min，PBS洗涤后封片，荧光正置显微镜观察。
qRT-PCR检测Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC mRNA的表达。Müller细胞均匀接种于6孔板上进行爬片，细胞覆盖面积达到80%时吸去培养液，PBS洗涤3次，排除血清对结果的干扰。按照培养液中葡萄糖的浓度，采用单纯随机方法将细胞分正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25.0 mmol/L葡萄糖）、正常糖+普罗布考组、高糖+普罗布考组。干预组细胞培养液中分别加100 μmol/L普罗布考。干预24 h后，PBS洗涤3次，采用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以β-actin作为内参照。SYBR GreenⅠ嵌合荧光法扩增相应基因。SP1：正向引物5′-CAGAGGGTCAGTGGGCTACA-3′，反向引物5′-GAGGGTTTCCTGGGAGATGG-3′；Keap1：正向引物5′-TGGCCAAGCAAGAGGAGTTC-3′，反向游引物5′-GGCTGATGAGGGTCACCAGTT-3′；Nrf2：正向引物5′-TCAGCCAGCCCAGCACATCC-3′，反向引物5′-′TCTGCGCCAAAAGCTGCATGC-3′；GCLC：正向引物5′-GCAAGGCCCAGAACAGCACG-3′，反向引物5′-TCCCTCATCCATCTGGCAACTGT-3′；β-actine正向引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。退火温度50 ℃，40个循环后形成扩增曲线，嵌合荧光法基因扩增达到阈值时所经历的循环阈值（Ct值）。Ct值采用Light Cycle R 96软件进行分析，结果以2−△△Ct计算。
采用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析。两组间数据比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，培养的Müller细胞呈梭形生长，形态狭长，胞质丰富，胞核较大，其中可见1～2个核仁（图1A）。正置荧光显微镜观察发现，95%以上的细胞GS染色阳性，红色荧光均匀一致；DAPI标记的细胞核呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致（图1B～1D）。
图1
体外培养的人Müller细胞显微镜像。1A示倒置显微镜像。细胞基本融合，形态狭长，胞质丰富，胞核较大，其中可见1～2个核仁 标尺：15 μm。1B～1D示正置荧光显微镜像。1B示GS染色呈阳性，表现为细胞内红色荧光；1C示DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光；1D示1B、1C共定位像，Müller细胞GS染色阳性率＞95% 标尺：15 μm
免疫荧光染色结果显示，Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC蛋白均呈阳性表达（图2）。
图2
体外培养的人Müller细胞免疫荧光显微镜像。2A示GCLC免疫荧光染色阳性，呈绿色荧光；2B示GS免疫染色阳性，呈红色荧光；2C示细胞内DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2D示2A～2C共定位像 标尺：10 μm。2E示Nrf2免疫荧光染色阳性，呈绿色荧光；2F示Keap1免疫荧光染色阳性，呈红色荧光；2G示DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2H示2E～2G共定位像 标尺：10μm。2I示SP1免疫荧光染色阳性，呈红色荧光；2J示细胞内DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2K示2I～2J共定位像 标尺：15 μm
qRT-PCR检测结果显示，正常糖组、正常糖+普罗布考组Müller细胞中SP1（t=0.106 0）、Nrf2（t=0.663 8）、Keap1（t=1.487）、GCLC（t=1.786）mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常糖组比较，高糖组Müller细胞中SP1（t=28.30，P＜0.000）、Keap1（t=5.369，P=0.006）、Nrf2（t=10.59，P=0.001）mRNA表达显著上调，GCLC显著下调（t=4.633，P=0.010），差异均有统计学意义。与高糖组比较，高糖+普罗布考组Müller细胞中SP1（t=12.60，P=0.000）、Keap1（t=4.076，P=0.015）mRNA表达显著下调，Nrf2（t=12.90，P=0.000）、GCLC（t=15.96，P＜0.000）mRNA表达显著上调，差异有统计学意义（图3）。
图3
各组Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC mRNA表达情况。*高血糖组与高血糖+普罗布考组比较，P＜0.05
3 讨论
GS是公认的Müller细胞分子标记[11]。本研究通过免疫荧光化学法，证实了通过组织块悬浮法培养得到的细胞为视网膜Müller细胞。高血糖是DR发生、发展的始动因素，体外培养时25 mmol/L高糖水平，近似于糖尿病患者体内的高血糖状态[12]。研究表明，高糖诱导的神经元和神经胶质细胞损伤通常发生在微血管病变之前，其机制可能与氧化应激有关[2]。Müller细胞在DR的氧化应激、视网膜炎症、新生血管生成、血管渗漏及蛋白质缺失、修饰中起重要作用[3]。但Müller细胞具体的抗氧化应激机制仍是未知。
高血糖环境下ROS增加，导致氧化还原体系失衡，氧化应激发生。氧化应激在DR的发生和发展中起着重要作用。Nrf2信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，氧化应激损伤反应主要通过Nrf2/ARE通路实现，而Nrf2主要受Keap1调控[13-15]。SP1在细胞的生长、分化、新城代谢和凋亡中起着重要作用[16]。Guo等[17]发现在肺癌细胞中SP1是Keap1的转录激活因子，其对Keap1的表达发挥重要作用。Mishra等[18]研究发现在DR中转录因子SP1和Keap1表达显著增加，转录因子SP1通过作用于Keap1的启动子影响Keap1的表达。本研究结果显示，Müller细胞中SP1、Nrf2、Keap1、GCLC蛋白均呈阳性表达；同时，高糖条件下Müller细胞中的Nrf2、Keap1、SP1 mRNA表达量均增高，而GCLC mRNA表达降低。结果与Zhong等[7]、Mishra等[19]的研究结果一致。在高糖刺激下Müller细胞中Nrf2表达量增加，SP1通过调控Keap1的表达，Keap1表达也上调。Nrf2可能主要被Keap1瞄定在细胞质中，进入细胞核内的Nrf2可能下降，所以导致GCLC的表达下调。而GCLC是GSH合成的关键酶，GCLC的减少会导致GSH合成减少，从而使细胞内抗氧化作用减弱[18]。Nrf2、Keap1之间的影响作用原因可能是高糖条件下Nrf2、Keap1之间的表观遗传学修饰作用或者是Nrf2、Keap1翻译后修饰作用[20-22]。但其中具体调节机制仍未知。上述结果表明SP1/Keap1/Nrf2/GCLC信号通路在Müller细胞中可能发挥着重要作用。
普罗布考因其独特的酚羟基分子结构，使其具有抗氧化作用；并且还可以抑制血细胞外ROS，有效减少氧化应激损伤导致的血管内皮细胞凋亡。Fu等[23]、Duan等[10]发现普罗布考通过抗氧化作用抑制糖尿病大鼠心室重建、延缓糖尿病肾病的发生和发展。糖尿病动物模型中，普罗布考通过调节抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化、增加血浆胰岛素水平、减少胰岛素抵抗、降低血糖浓度及抑制免疫成熟相关的树突状细胞CD11c，以缓解DR的发病[24-25]。Agardh等[26]发现普罗布考能促进GSH的代谢作用，这可能与普罗布考的抗氧化作用相关。因此，普罗布考可能通过调节Nrf2/ARE通路，促进下游抗氧化基因GCL的表达，从而激活GSH生成系统。我们前期的研究表明，普罗布考可降低高血脂DR患者氧化应激水平，改善患者视功能、减轻黄斑水肿及硬性渗出[27-28]。本研究结果发现，在普罗布考作用下，SP1、Keap1 mRNA表达均下调，而Nrf2、GCLC mRNA表达均上调，并且正常血糖组与正常血糖+普罗布考组差异无统计学意义，表明普罗布考可能是通过Nrf2/GCLC通路保护Müller细胞，并抑制SP1和Keap1的表达。但普罗布考对高糖条件下人视网膜Müller细胞具体的保护作用机制仍有待进一步研究。
志谢 中南大学爱尔眼科学院陈建苏教授和徐和平教授对课题及论文修改的精心指导和帮助；爱尔眼科研究所其他各位老师和长沙爱尔眼库对实验方案实施过程的指导和帮助。
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病微血管病变最常见眼部并发症[1]。既往研究表明，高糖诱导的神经元和神经胶质细胞损伤通常发生在微血管病变之前，其机制可能与氧化应激有关[2]。Müller细胞在DR的氧化应激、视网膜炎症等中起重要作用。此外，作为氧化应激的关键因子核因子E2相关因子2（Nrf2）也主要表达于Müller细胞及星形胶质细胞[3-4]。氧化应激在DR发病中的作用一直是近年国内外研究的焦点[5-6]。Nrf2信号通路是最为重要的内源性抗氧化应激通路，主要受细胞骨架相关蛋白（Keap1）调控，而特化蛋白1（SP1）则可通过调控Keap1在氧化应激中发挥作用；Nrf2能进入细胞核内与抗氧化反应元件（ARE）相结合，启动下游抗氧化基因转录，进行下游相关靶基因γ谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）等的转录，而半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）正是γ-GCL的催化亚单位，调控谷胱甘肽（GSH）的合成发挥抗氧化作用[7-8]。普罗布考为临床常用调脂药物，并具有强大的抗氧化应激作用[9]。Duan等[10]发现普罗布考通过抗氧化作用延缓糖尿病肾病的发生、发展。但其对DR作用的研究较少。本研究观察了普罗布考对高糖诱导人Müller细胞中SP1/Keap1/Nrf2/GCLC表达的影响，初步探讨普罗布考通过上述通路发挥其抗氧化作用的可能机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
意外死亡正常人供体眼球，由长沙爱尔眼科医院眼库中心提供。鼠来源谷氨酰胺合成酶（GS）多克隆抗体、兔来源SP1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），DAPI（中国Solarbio公司），兔来源Nrf2单克隆抗体、鼠来源Keap1单克隆抗体、兔来源GCLC单克隆抗体（英国Abcam公司），羊抗鼠/羊抗兔CY3二抗（美国Molecular Probe公司），Dulbecco改良Eagle培养基、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Gibico公司），Trizol试剂、CO2培养箱（美国Thermo公司），SYBR GreenⅠ（中国Vazyme公司），普罗布考（中国食品药品检定研究院），DMSO（美国Sigma公司），倒置显微镜（德国Zeiss公司），正置荧光显微镜（日本Olympus公司），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（瑞士Roche公司）。
意外死亡正常人供体眼球，采用组织块悬浮法原代培养视网膜Müller细胞，待80%细胞融合后以1∶2比例传代培养，取第3～5代细胞用于实验。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞及检测细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC的蛋白表达。GS抗体、DAPI染色观察Müller细胞形态。细胞接种于4孔板的盖玻片上，细胞爬片至80%时，弃去培养液，洗涤3次。4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入1%Triton X-100室温下孵育20 min，加入5%牛血清白蛋白37 ℃恒温箱中封闭60 min。分别加入一抗（GS 1∶100，SP1 1∶50，Nrf2 1∶500，Keap1 1∶100，GCLC 1∶100，GS 1∶100），4 ℃冰箱中孵育过夜。PBS洗涤盖玻片，加入对应荧光二抗（CY3 1∶100，异硫氰酸荧光素 1∶500）室温下避光孵育1 h，PBS洗涤后，加入DAPI（1∶4 000）室温下避光孵育5～10 min，PBS洗涤后封片，荧光正置显微镜观察。
qRT-PCR检测Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC mRNA的表达。Müller细胞均匀接种于6孔板上进行爬片，细胞覆盖面积达到80%时吸去培养液，PBS洗涤3次，排除血清对结果的干扰。按照培养液中葡萄糖的浓度，采用单纯随机方法将细胞分正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25.0 mmol/L葡萄糖）、正常糖+普罗布考组、高糖+普罗布考组。干预组细胞培养液中分别加100 μmol/L普罗布考。干预24 h后，PBS洗涤3次，采用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以β-actin作为内参照。SYBR GreenⅠ嵌合荧光法扩增相应基因。SP1：正向引物5′-CAGAGGGTCAGTGGGCTACA-3′，反向引物5′-GAGGGTTTCCTGGGAGATGG-3′；Keap1：正向引物5′-TGGCCAAGCAAGAGGAGTTC-3′，反向游引物5′-GGCTGATGAGGGTCACCAGTT-3′；Nrf2：正向引物5′-TCAGCCAGCCCAGCACATCC-3′，反向引物5′-′TCTGCGCCAAAAGCTGCATGC-3′；GCLC：正向引物5′-GCAAGGCCCAGAACAGCACG-3′，反向引物5′-TCCCTCATCCATCTGGCAACTGT-3′；β-actine正向引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。退火温度50 ℃，40个循环后形成扩增曲线，嵌合荧光法基因扩增达到阈值时所经历的循环阈值（Ct值）。Ct值采用Light Cycle R 96软件进行分析，结果以2−△△Ct计算。
采用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析。两组间数据比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，培养的Müller细胞呈梭形生长，形态狭长，胞质丰富，胞核较大，其中可见1～2个核仁（图1A）。正置荧光显微镜观察发现，95%以上的细胞GS染色阳性，红色荧光均匀一致；DAPI标记的细胞核呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致（图1B～1D）。
图1
体外培养的人Müller细胞显微镜像。1A示倒置显微镜像。细胞基本融合，形态狭长，胞质丰富，胞核较大，其中可见1～2个核仁 标尺：15 μm。1B～1D示正置荧光显微镜像。1B示GS染色呈阳性，表现为细胞内红色荧光；1C示DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光；1D示1B、1C共定位像，Müller细胞GS染色阳性率＞95% 标尺：15 μm
免疫荧光染色结果显示，Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC蛋白均呈阳性表达（图2）。
图2
体外培养的人Müller细胞免疫荧光显微镜像。2A示GCLC免疫荧光染色阳性，呈绿色荧光；2B示GS免疫染色阳性，呈红色荧光；2C示细胞内DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2D示2A～2C共定位像 标尺：10 μm。2E示Nrf2免疫荧光染色阳性，呈绿色荧光；2F示Keap1免疫荧光染色阳性，呈红色荧光；2G示DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2H示2E～2G共定位像 标尺：10μm。2I示SP1免疫荧光染色阳性，呈红色荧光；2J示细胞内DAPI免疫荧光染色阳性，呈蓝色荧光；2K示2I～2J共定位像 标尺：15 μm
qRT-PCR检测结果显示，正常糖组、正常糖+普罗布考组Müller细胞中SP1（t=0.106 0）、Nrf2（t=0.663 8）、Keap1（t=1.487）、GCLC（t=1.786）mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常糖组比较，高糖组Müller细胞中SP1（t=28.30，P＜0.000）、Keap1（t=5.369，P=0.006）、Nrf2（t=10.59，P=0.001）mRNA表达显著上调，GCLC显著下调（t=4.633，P=0.010），差异均有统计学意义。与高糖组比较，高糖+普罗布考组Müller细胞中SP1（t=12.60，P=0.000）、Keap1（t=4.076，P=0.015）mRNA表达显著下调，Nrf2（t=12.90，P=0.000）、GCLC（t=15.96，P＜0.000）mRNA表达显著上调，差异有统计学意义（图3）。
图3
各组Müller细胞中SP1、Keap1、Nrf2、GCLC mRNA表达情况。*高血糖组与高血糖+普罗布考组比较，P＜0.05
3 讨论
GS是公认的Müller细胞分子标记[11]。本研究通过免疫荧光化学法，证实了通过组织块悬浮法培养得到的细胞为视网膜Müller细胞。高血糖是DR发生、发展的始动因素，体外培养时25 mmol/L高糖水平，近似于糖尿病患者体内的高血糖状态[12]。研究表明，高糖诱导的神经元和神经胶质细胞损伤通常发生在微血管病变之前，其机制可能与氧化应激有关[2]。Müller细胞在DR的氧化应激、视网膜炎症、新生血管生成、血管渗漏及蛋白质缺失、修饰中起重要作用[3]。但Müller细胞具体的抗氧化应激机制仍是未知。
高血糖环境下ROS增加，导致氧化还原体系失衡，氧化应激发生。氧化应激在DR的发生和发展中起着重要作用。Nrf2信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，氧化应激损伤反应主要通过Nrf2/ARE通路实现，而Nrf2主要受Keap1调控[13-15]。SP1在细胞的生长、分化、新城代谢和凋亡中起着重要作用[16]。Guo等[17]发现在肺癌细胞中SP1是Keap1的转录激活因子，其对Keap1的表达发挥重要作用。Mishra等[18]研究发现在DR中转录因子SP1和Keap1表达显著增加，转录因子SP1通过作用于Keap1的启动子影响Keap1的表达。本研究结果显示，Müller细胞中SP1、Nrf2、Keap1、GCLC蛋白均呈阳性表达；同时，高糖条件下Müller细胞中的Nrf2、Keap1、SP1 mRNA表达量均增高，而GCLC mRNA表达降低。结果与Zhong等[7]、Mishra等[19]的研究结果一致。在高糖刺激下Müller细胞中Nrf2表达量增加，SP1通过调控Keap1的表达，Keap1表达也上调。Nrf2可能主要被Keap1瞄定在细胞质中，进入细胞核内的Nrf2可能下降，所以导致GCLC的表达下调。而GCLC是GSH合成的关键酶，GCLC的减少会导致GSH合成减少，从而使细胞内抗氧化作用减弱[18]。Nrf2、Keap1之间的影响作用原因可能是高糖条件下Nrf2、Keap1之间的表观遗传学修饰作用或者是Nrf2、Keap1翻译后修饰作用[20-22]。但其中具体调节机制仍未知。上述结果表明SP1/Keap1/Nrf2/GCLC信号通路在Müller细胞中可能发挥着重要作用。
普罗布考因其独特的酚羟基分子结构，使其具有抗氧化作用；并且还可以抑制血细胞外ROS，有效减少氧化应激损伤导致的血管内皮细胞凋亡。Fu等[23]、Duan等[10]发现普罗布考通过抗氧化作用抑制糖尿病大鼠心室重建、延缓糖尿病肾病的发生和发展。糖尿病动物模型中，普罗布考通过调节抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化、增加血浆胰岛素水平、减少胰岛素抵抗、降低血糖浓度及抑制免疫成熟相关的树突状细胞CD11c，以缓解DR的发病[24-25]。Agardh等[26]发现普罗布考能促进GSH的代谢作用，这可能与普罗布考的抗氧化作用相关。因此，普罗布考可能通过调节Nrf2/ARE通路，促进下游抗氧化基因GCL的表达，从而激活GSH生成系统。我们前期的研究表明，普罗布考可降低高血脂DR患者氧化应激水平，改善患者视功能、减轻黄斑水肿及硬性渗出[27-28]。本研究结果发现，在普罗布考作用下，SP1、Keap1 mRNA表达均下调，而Nrf2、GCLC mRNA表达均上调，并且正常血糖组与正常血糖+普罗布考组差异无统计学意义，表明普罗布考可能是通过Nrf2/GCLC通路保护Müller细胞，并抑制SP1和Keap1的表达。但普罗布考对高糖条件下人视网膜Müller细胞具体的保护作用机制仍有待进一步研究。
志谢 中南大学爱尔眼科学院陈建苏教授和徐和平教授对课题及论文修改的精心指导和帮助；爱尔眼科研究所其他各位老师和长沙爱尔眼库对实验方案实施过程的指导和帮助。
