自体荧光检测技术是目前新兴的癌症诊断技术, 它与传统白光内窥镜相比, 在癌前病变和早期癌症的诊断上有很大的优势。本文总结了国内外关于自体荧光检测技术的研究现状和进展, 重点阐述了生物组织的内源性荧光分子、正常和异常生物组织荧光信号差异的来源、荧光激发光光源和波长的选择, 以及荧光图像和光谱信号的处理方法。最后, 本文分析并讨论了自体荧光成像与光谱技术在癌前病变和早期癌症诊断中的不足和发展方向。
引用本文： 刘刚, 颜国正. 自体荧光诊断技术的研究进展及发展方向. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(6): 1348-1353. doi: 10.7507/1001-5515.20150238 复制
0 引言
随着经济的增长、生活节奏的加快，癌症已经成为人类健康的“头号杀手”。全世界每年癌症发病人数约为1 300万，死亡人数约为800万，且有逐年上升的趋势[1]。其中，肺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、女性宫颈癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤，也是今后防控恶性肿瘤的重点。众所周知，当恶性肿瘤出现临床症状而被确诊时，多处于进展期，已经错失了最佳治疗时机[2]，因此及时发现和治疗癌前病变是有效预防恶性肿瘤发展和降低死亡率的关键。目前，临床上诊断恶性肿瘤的一项主要手段是白光内镜(white light endoscopy, WLE)，但是WLE检查只能诊断出黏膜表面较大的病变，难以发现微小的组织病变和黏膜下的癌前病变，容易出现漏诊甚至误诊。研究者们一直致力于寻找新的诊断方法以有效、正确地指导或代替手术活检[3-5]。自体荧光内镜(autofluorescence endoscopy, AFE)作为一种新型内镜检查技术，可以检测包括口腔、上消化道、结肠、宫颈、支气管等不同腔道甚至视网膜中WLE尚无法诊断的特殊微小结构的变化[6-7]，这促进了早期癌症诊断技术的微观化进程。在分子水平上，AFE以安全、无创、实时和灵敏度高等特点受到临床医生和研究者们越来越多的关注[8-9]。
生物组织的细胞和基质中含有许多分子，如氨基酸、卟啉、结构蛋白等，它们在一定波长的激发光照射下，能够产生与其吸收光谱相对应的自体荧光辐射信号。这种荧光现象不依赖于任何外源性物质，在体内固有存在，故被称为“自体荧光”。在激发光的照射下，生物组织中各种不同的内源性荧光分子可产生自体荧光辐射。这些自体荧光通过换能器的采集和处理，会显示出特有的荧光图像或光谱。组织的生物化学特性和形态结构以及组织的吸收和散射均会影响荧光图像的色彩和荧光光谱曲线。根据分子生物学研究，从正常细胞转化为恶性细胞要经历多个步骤。在这个过程中周边生化环境会产生质的变化，如内源性荧光基团的浓度、黏膜厚度、微血管分布和血液浓度等。因此，我们可根据不同组织自体荧光图像或光谱信号所表现出来的差异，区分正常组织和不同阶段的异常组织[10-12]。
为了实现自体荧光诊断技术对癌前病变和早期癌症的有效筛查，我们的研究工作主要有：①深入研究生物组织内源性荧光分子以及正常和异常生物组织自体荧光信号差异的来源；②研发自体荧光信号采集和显示系统，以获取正常和异常组织的自体荧光信号；③采用活检取样方法对可疑病灶进行病理学分析，结合自体荧光图像和光谱，制定更精确的癌变组织诊断标准；④开发智能算法，处理和分析采集到的自体荧光图像和光谱数据，更加快速、有效地鉴别不同类型的癌变组织。本文总结了国内外自体荧光检测技术的研究现状和进展，重点阐述了生物组织的内源性荧光分子、正常和异常生物组织荧光信号差异的来源、荧光激发光光源和波长的选择，以及荧光图像和光谱信号的处理方法。在此基础上，分析讨论自体荧光成像与光谱技术在癌前病变和早期癌症诊断中的不足，并预测其发展方向。
1 自体荧光诊断技术原理
1.1 内源性荧光物质及其荧光特性
Policard等早在1924年就已报道，离体肿瘤组织在紫外线的照射下可以发出荧光。此后，生物学家开始研究细胞中各种分子的荧光，证实了各种分子的荧光特性与其理化性质有关[13-14]。MIT光谱实验室的Georgakoudi等[15]认为：人体内主要的荧光物质是NADPH和胶原；人体局部组织产生异常变化会引起去氧化代谢过程，从而造成自体荧光信号强度的变化；异常组织中胶原诱发的荧光强度比正常组织强，而NADPH诱发的荧光强度则相反, 因此正常组织与异常组织的荧光特性有明显差异。此外，Pandey等[16]通过体外实验研究自体荧光的机制，发现氨基酸、酶和辅酶等也能激发出荧光。Thekkek等[17]在分子水平上全面概括和解释了人体内的荧光物质。他们提出，不同分子产生不同荧光光谱的原因是其分子结构及自身共价键能量不同，因此表现出不同的能级。生物体内各种荧光物质及其对应的激发波长和荧光峰值如表 1所示。
表1
内源性荧光物质的荧光特性
Table1.
Characteristics of fluorescent materials
生物组织的自体荧光信号是在激发光照射下，各种不同内源性荧光分子诱发荧光信号的叠加。当采用不同波长的激发光时，起主要作用的内源性荧光物质各不相同。此外，不同生物体腔道中所包含的内源性荧光物质也不相同，这为不同腔道癌前病变诊断的激发光波长的选择提供了指导。
2.2 正常和异常生物组织荧光信号差异的来源
自体荧光诊断技术是根据正常和异常的生物组织呈现出来的荧光信号差异实现医学疾病诊断的。近几年研究表明，正常与异常生物组织自体荧光信号差异的来源主要有:生物组织的黏膜厚度和层结构；生物组织中内源性荧光分子的浓度和分布。
2.2.1 黏膜厚度增加或者层结构被破坏
Cothren等[18]采用370 nm的光激发肠道组织的自体荧光，分别采集结肠正常、增生和腺瘤组织的荧光光谱。他们发现390 nm和460 nm的荧光峰在不同组织中都存在，但在460 nm处增生组织的荧光强度只有正常组织的1/3，腺瘤组织的荧光强度则更低，而且只有腺瘤组织中存在630 nm和690 nm的荧光峰。Schomacker等[19]采用337 nm的激发光，得出结论：390 nm和460 nm荧光峰分别来自胶原和NADH，FAD只产生大约5%的荧光。他们还认为，黏膜层厚度增加使异常组织黏膜下层中胶原诱发的荧光发射受阻，造成荧光强度减弱。此外，Kobayashi等采用437 nm的激发光，采集异常组织及其周围正常组织的荧光图像。他们认为异常组织的黏膜层结构遭到破坏，进而组织中血管增加，血红素吸收更多绿色荧光，使得荧光图像呈现红色。
2.2.2 内源性荧光物质浓度的改变
刘丽娜等[8, 20]选取337、375、405、460 nm的激发光波长，分别采集离体结肠正常组织和腺瘤组织的荧光光谱，发现腺瘤组织荧光光谱出现特有的635 nm荧光峰。他们运用时间分辨光谱技术得出PpIX的浓度比正常组织高很多。Banerjee等[10]测量了纯品内源性荧光物质的荧光光谱以及正常、增生和腺瘤组织的荧光光谱。他们发现自体荧光光谱的形状没有变化，但荧光物质的相对浓度不同导致荧光峰值强度不同，新陈代谢较快的组织细胞密集、细胞核质较多，而结缔组织的密度较低(胶原变少)。由此表明，不同组织由于新陈代谢不同，造成组织中荧光物质不同，从而导致自体荧光光谱产生明显差异。
当然，也有学者认为，正常组织和异常组织的自体荧光信号差异是组织结构改变和内源性荧光物质浓度改变二者综合作用的结果。Su等[21]认为不同类型组织自体荧光强度的不同不仅取决于组织中DADH、FAD浓度的变化，还取决于组织黏膜厚度的变化。异常组织黏膜层厚度增加，降低了激发光和荧光的穿透率，从而降低了荧光强度。
3 自体荧光诊查系统
3.1 荧光激发光光源和波长的选择
荧光激发光光源及其波长的选择是研制自体荧光诊查系统的重要步骤。为了最大限度地诱发生物组织的自体荧光，提高自体荧光诊查系统的可靠性，我们应该选择合适的光源和最佳的激发波长。
3.1.1 激发光源的选择
激发光源的性能关乎诊断结果的准确性，所以选择一种合适的激发光源对自体荧光诊查仪器的研制十分关键。选择激发光源应综合考虑激发光的单色性、均匀性、稳定性、功率密度，还有体积、寿命、价格等多种因素。研究者的相关实验指出，激发光源的功率密度必须大于0.1 mJ/cm2。如果采用激光器，其单次脉冲功率应该大于5 mJ。如表 2所示，本文总结了目前国内外常用的激发光源，并对其性能做了一个调研。
表2
自体荧光激发光源及其性能
Table2.
Autofluorescence excitation light sources and performance
如表 2所示，现有的激发光源各有不足，我们仍需寻找更好的替代光源，要求其单色性能更高，稳定性能更好，光功率密度适中，成本更加低廉。当然，为了迎合未来自体荧光检测设备的微型化趋势，激发光源的体积和重量还应该更加小巧。
3.1.2 激发光波长的选择
为了最大限度地激发内源性荧光物质，以有效地反映正常组织和不同阶段癌变组织荧光信号的差异，选择激发光波长应主要考虑激发光对生物组织的穿透深度、激发内源性荧光物质产生荧光的效率等因素。根据相关的实验研究，波长大于300 nm时，光对人体的损伤相对较小，这是自体荧光激发光波长的下限。根据自体荧光激发原理，激发光的波长小于所诱发的荧光的波长。而目前能分析处理的自体荧光的波长在可见光区域内，即400~700 nm。因此，激发光波长不能大于700 nm，这是自体荧光激发光波长的上限。当前，国内外的研究人员普遍选择的自体荧光的激发波长为325~480 nm。在此范围内，波长越长，激发光穿透生物组织的深度越大，如波长为442 nm的激发光穿透生物组织的深度约为600μm，而337 nm的激发光穿透生物组织深度只有约200μm。另外，不同波长的激发光激发的荧光物质不同，对组织的穿透深度也不同。
自体荧光激发-发射矩阵(excitation-emission matrix, EEM)是寻找最佳自体荧光激发波长的主要途径。刘丽娜等[20]采用260~540 nm、间隔20 nm的激发光检测结肠组织的荧光光谱，得到结肠组织EEM矩阵，通过对比不同组织在不同激发波长下的自体荧光光谱，得出诊查结肠病变的最佳激发波长为340、380、460和540 nm。Angelova等[22]利用280~440 nm的激发光分别诱发胃肠道正常组织和癌变组织的自体荧光光谱，采集两种组织在300~800 nm波段的自体荧光，做出激发光与发射光对应的准三维EEM彩图，并且利用EEM彩图的差异辨别正常和癌变组织。Luo等[23]则利用(400±50) nm的激发光测量结肠正常、增生、癌变组织的自体荧光光谱，通过比较460 nm处荧光光谱的强度，得出最佳激发波长为380 nm。
此外，在实际应用中，不同腔道含有的内源性荧光物质及其浓度不同，而且不同的组织癌变阶段需要不同的穿透深度。所以，针对不同腔道和不同阶段的癌变诊断，需要的最佳激发波长也不同。
3.2 荧光信号的数据处理方法
正确采集和提取有效的荧光信号信息对于提高癌前病变和早期癌症诊断的灵敏度和特异度至关重要。目前，自体荧光信号的采集和数据处理方法主要分为两大类：荧光图像法(表 3中1~4)和荧光光谱法(表 3中5~10)。
表3
不同波长激发光和不同算法的自体荧光诊断结果
Table3.
Diagnosis results using different excitation wavelengths and algorithms
3.2.1 荧光图像法
荧光图像法通过CCD图像传感器采集不同组织的自体荧光图像，直接根据图像颜色差异进行诊断。其优点是简单、直观，诊查范围大，可以实时诊断，并且不需要复杂的设备，这对于临床应用十分有利。曾堃等[24]通过研究数万例离体癌症标本，制定了自体荧光图像诊断的诊断标准。他们认为正常组织荧光图像呈蓝白色，良性病变荧光图像呈橘黄色，重度不典型增生的荧光图像呈紫红色，中度不典型增生的荧光图像呈暗紫色，轻度不典型增生的荧光图像呈暗色。Takeuchi等[25]采用伪彩色图像处理方法将复合的自体荧光图像显示出来，通过图像差异区分正常组织和癌变组织，诊断的灵敏度和特异度分别达到95%和64%。
当然，荧光图像法也存在许多缺点，例如图像判断的主观性强，实时性判断耗费医生大量的时间；图像质量容易受到周围环境的影响，以致带来诊断误差甚至误诊。因此，荧光图像诊断方法有待进一步改进以减少医生的工作时间，降低诊断结果对医生个人经验的依赖性。更智能、更有效的图像识别算法还有待于研究人员开发。
3.2.2 荧光光谱法
荧光光谱法是按“点”采集不同组织的自体荧光光谱，根据荧光强度差异进行诊断的方法。与荧光图像法相比，荧光光谱法更为严谨，而且光谱信号的信息量很大，几乎涵盖了已知的各种异常信息，包括不同的病变、癌变的分化程度、基因突变等。曾堃等[24]在制定自体荧光图像诊断标准的同时，还制定了自体荧光光谱诊断标准。他们假设正常组织的自体荧光光谱强度为100%，得出良性病变组织的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值大于70%，重度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%，并且有400 nm和680 nm的荧光峰，中度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%，并且有400 nm的荧光峰，轻度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%。目前，常用的自体荧光光谱采集和处理方法有：逐步回归分析法[19]、双峰比值法[29]、主成分分析法(principal component analysis, PCA)[8, 23]、人工神经网络法(artificial neural network, ANN)[23]和模式识别法[8]等。
与荧光图像法一样，荧光光谱法也存在许多缺点，其设备成本较高、结构复杂，不能直观地显示病变，而且在指导组织活检时不如荧光图像法精确、方便。因此，荧光光谱法的推广使用仍有一定局限。在自体荧光诊查技术的实际临床应用，有时会将荧光图像法和荧光光谱法结合使用，使二者在诊断过程中相互补充。
4 自体荧光技术的发展方向
自体荧光诊断技术在临床上对于癌症疾病的及时发现和治疗具有非常重要的意义。同时，它在临床上还可以引导甚至替代组织活检，为异常组织的病理学分析提供有利条件。但是，在现有阶段，自体荧光技术还存在着有多不足之处，它在临床上的广泛应用还需要研究者们付出更多的努力。
4.1 深入研究自体荧光诊断机制
随着研究的深入，我们知道生物组织不同的荧光物质与自体荧光光谱峰值的对应关系，并利用自体荧光信号的差异区分正常组织和癌变组织。但是，如何根据这种差异诊断不同分化程度的癌变还没有统一的标准。另外，不同腔道的生物组织，还有激发光的波长及入射角度等参数对自体荧光信号的测量结果都有很大影响。因此，针对不同腔道和不同阶段的癌前病变，选择合适的参数和制定精确的诊断标准具有十分重要的意义。这也是未来自体荧光技术发展的一个新趋势。
4.2 优化自体荧光检测系统
现有的自体荧光检测设备分辨率低、体积重大、价格昂贵，很难在普通医院推广应用。而且激发光源要通过有线光纤深入诊断部位，这只适用于各种短腔道和上消化道的诊断，难以实现全消化道的检查，容易造成漏检。因此，选择分辨率更高的荧光信号采集设备，选用性能更好的激发光源，同时减小设备的体积，实现更加全面的检查是自体荧光诊断技术发展的一个新趋势。
4.3 与外源性荧光技术结合
自体荧光检测技术在诊断平坦型肿瘤时的灵敏度和特异度不高，对于肿瘤边界定位的准确度也较低。随着高分辨率成像技术和荧光探针的发展，荧光标记分子成像技术在临床上越来越受到关注。将荧光标记的外源性探针靶向到癌变组织的过表达生物分子，利用荧光成像系统观察组织病变的生物过程，可以提高平坦型肿瘤诊断的灵敏度和肿瘤边界定位的精度。Zhang等[30]采用玫瑰红作为标记，检测活体动物的癌前病变，使用比值法判别不同程度的癌变组织，取得了积极的效果。因此，将自体荧光检测技术与外源荧光分子标记法结合起来，对于癌前病变和早期癌症的诊断具有非常重要的意义。
4.4 开发更精确和智能的诊断算法
在诊断过程中，自体荧光图像的颜色辨别主要依赖医生的个人经验，造成自体荧光技术对癌前病变和早期癌症的诊断特异度较低(＜67%)，这制约着自体荧光技术在临床上的推广应用。针对这一难题，开发更智能的图像处理算法以增强荧光图像的对比度是提高早期癌症诊断灵敏度和特异度的重要方向。而前文提到，荧光光谱信号的信息量很大，几乎涵盖了已知的各种异常信息，具有较高的诊断特异性。因此，将荧光光谱算法和图像处理算法相结合是提高诊断灵敏度和特异度的另一种发展趋势。
5 结论
自体荧光技术作为诊断癌前病变和早期癌症的新兴技术，对于真正实现癌症的及时发现与治疗具有重要意义。本文总结了国内外关于自体荧光检测技术的研究现状和进展，对自体荧光技术的检测原理和诊断系统组成作了详细地概括和分析。最后指出自体荧光成像和光谱技术在癌前病变和早期癌症诊断中的不足和发展方向。希望能为未来自体荧光诊断技术的研究和进一步改进提供有价值的参考。
0 引言
随着经济的增长、生活节奏的加快，癌症已经成为人类健康的“头号杀手”。全世界每年癌症发病人数约为1 300万，死亡人数约为800万，且有逐年上升的趋势[1]。其中，肺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、女性宫颈癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤，也是今后防控恶性肿瘤的重点。众所周知，当恶性肿瘤出现临床症状而被确诊时，多处于进展期，已经错失了最佳治疗时机[2]，因此及时发现和治疗癌前病变是有效预防恶性肿瘤发展和降低死亡率的关键。目前，临床上诊断恶性肿瘤的一项主要手段是白光内镜(white light endoscopy, WLE)，但是WLE检查只能诊断出黏膜表面较大的病变，难以发现微小的组织病变和黏膜下的癌前病变，容易出现漏诊甚至误诊。研究者们一直致力于寻找新的诊断方法以有效、正确地指导或代替手术活检[3-5]。自体荧光内镜(autofluorescence endoscopy, AFE)作为一种新型内镜检查技术，可以检测包括口腔、上消化道、结肠、宫颈、支气管等不同腔道甚至视网膜中WLE尚无法诊断的特殊微小结构的变化[6-7]，这促进了早期癌症诊断技术的微观化进程。在分子水平上，AFE以安全、无创、实时和灵敏度高等特点受到临床医生和研究者们越来越多的关注[8-9]。
生物组织的细胞和基质中含有许多分子，如氨基酸、卟啉、结构蛋白等，它们在一定波长的激发光照射下，能够产生与其吸收光谱相对应的自体荧光辐射信号。这种荧光现象不依赖于任何外源性物质，在体内固有存在，故被称为“自体荧光”。在激发光的照射下，生物组织中各种不同的内源性荧光分子可产生自体荧光辐射。这些自体荧光通过换能器的采集和处理，会显示出特有的荧光图像或光谱。组织的生物化学特性和形态结构以及组织的吸收和散射均会影响荧光图像的色彩和荧光光谱曲线。根据分子生物学研究，从正常细胞转化为恶性细胞要经历多个步骤。在这个过程中周边生化环境会产生质的变化，如内源性荧光基团的浓度、黏膜厚度、微血管分布和血液浓度等。因此，我们可根据不同组织自体荧光图像或光谱信号所表现出来的差异，区分正常组织和不同阶段的异常组织[10-12]。
为了实现自体荧光诊断技术对癌前病变和早期癌症的有效筛查，我们的研究工作主要有：①深入研究生物组织内源性荧光分子以及正常和异常生物组织自体荧光信号差异的来源；②研发自体荧光信号采集和显示系统，以获取正常和异常组织的自体荧光信号；③采用活检取样方法对可疑病灶进行病理学分析，结合自体荧光图像和光谱，制定更精确的癌变组织诊断标准；④开发智能算法，处理和分析采集到的自体荧光图像和光谱数据，更加快速、有效地鉴别不同类型的癌变组织。本文总结了国内外自体荧光检测技术的研究现状和进展，重点阐述了生物组织的内源性荧光分子、正常和异常生物组织荧光信号差异的来源、荧光激发光光源和波长的选择，以及荧光图像和光谱信号的处理方法。在此基础上，分析讨论自体荧光成像与光谱技术在癌前病变和早期癌症诊断中的不足，并预测其发展方向。
1 自体荧光诊断技术原理
1.1 内源性荧光物质及其荧光特性
Policard等早在1924年就已报道，离体肿瘤组织在紫外线的照射下可以发出荧光。此后，生物学家开始研究细胞中各种分子的荧光，证实了各种分子的荧光特性与其理化性质有关[13-14]。MIT光谱实验室的Georgakoudi等[15]认为：人体内主要的荧光物质是NADPH和胶原；人体局部组织产生异常变化会引起去氧化代谢过程，从而造成自体荧光信号强度的变化；异常组织中胶原诱发的荧光强度比正常组织强，而NADPH诱发的荧光强度则相反, 因此正常组织与异常组织的荧光特性有明显差异。此外，Pandey等[16]通过体外实验研究自体荧光的机制，发现氨基酸、酶和辅酶等也能激发出荧光。Thekkek等[17]在分子水平上全面概括和解释了人体内的荧光物质。他们提出，不同分子产生不同荧光光谱的原因是其分子结构及自身共价键能量不同，因此表现出不同的能级。生物体内各种荧光物质及其对应的激发波长和荧光峰值如表 1所示。
表1
内源性荧光物质的荧光特性
Table1.
Characteristics of fluorescent materials
生物组织的自体荧光信号是在激发光照射下，各种不同内源性荧光分子诱发荧光信号的叠加。当采用不同波长的激发光时，起主要作用的内源性荧光物质各不相同。此外，不同生物体腔道中所包含的内源性荧光物质也不相同，这为不同腔道癌前病变诊断的激发光波长的选择提供了指导。
2.2 正常和异常生物组织荧光信号差异的来源
自体荧光诊断技术是根据正常和异常的生物组织呈现出来的荧光信号差异实现医学疾病诊断的。近几年研究表明，正常与异常生物组织自体荧光信号差异的来源主要有:生物组织的黏膜厚度和层结构；生物组织中内源性荧光分子的浓度和分布。
2.2.1 黏膜厚度增加或者层结构被破坏
Cothren等[18]采用370 nm的光激发肠道组织的自体荧光，分别采集结肠正常、增生和腺瘤组织的荧光光谱。他们发现390 nm和460 nm的荧光峰在不同组织中都存在，但在460 nm处增生组织的荧光强度只有正常组织的1/3，腺瘤组织的荧光强度则更低，而且只有腺瘤组织中存在630 nm和690 nm的荧光峰。Schomacker等[19]采用337 nm的激发光，得出结论：390 nm和460 nm荧光峰分别来自胶原和NADH，FAD只产生大约5%的荧光。他们还认为，黏膜层厚度增加使异常组织黏膜下层中胶原诱发的荧光发射受阻，造成荧光强度减弱。此外，Kobayashi等采用437 nm的激发光，采集异常组织及其周围正常组织的荧光图像。他们认为异常组织的黏膜层结构遭到破坏，进而组织中血管增加，血红素吸收更多绿色荧光，使得荧光图像呈现红色。
2.2.2 内源性荧光物质浓度的改变
刘丽娜等[8, 20]选取337、375、405、460 nm的激发光波长，分别采集离体结肠正常组织和腺瘤组织的荧光光谱，发现腺瘤组织荧光光谱出现特有的635 nm荧光峰。他们运用时间分辨光谱技术得出PpIX的浓度比正常组织高很多。Banerjee等[10]测量了纯品内源性荧光物质的荧光光谱以及正常、增生和腺瘤组织的荧光光谱。他们发现自体荧光光谱的形状没有变化，但荧光物质的相对浓度不同导致荧光峰值强度不同，新陈代谢较快的组织细胞密集、细胞核质较多，而结缔组织的密度较低(胶原变少)。由此表明，不同组织由于新陈代谢不同，造成组织中荧光物质不同，从而导致自体荧光光谱产生明显差异。
当然，也有学者认为，正常组织和异常组织的自体荧光信号差异是组织结构改变和内源性荧光物质浓度改变二者综合作用的结果。Su等[21]认为不同类型组织自体荧光强度的不同不仅取决于组织中DADH、FAD浓度的变化，还取决于组织黏膜厚度的变化。异常组织黏膜层厚度增加，降低了激发光和荧光的穿透率，从而降低了荧光强度。
3 自体荧光诊查系统
3.1 荧光激发光光源和波长的选择
荧光激发光光源及其波长的选择是研制自体荧光诊查系统的重要步骤。为了最大限度地诱发生物组织的自体荧光，提高自体荧光诊查系统的可靠性，我们应该选择合适的光源和最佳的激发波长。
3.1.1 激发光源的选择
激发光源的性能关乎诊断结果的准确性，所以选择一种合适的激发光源对自体荧光诊查仪器的研制十分关键。选择激发光源应综合考虑激发光的单色性、均匀性、稳定性、功率密度，还有体积、寿命、价格等多种因素。研究者的相关实验指出，激发光源的功率密度必须大于0.1 mJ/cm2。如果采用激光器，其单次脉冲功率应该大于5 mJ。如表 2所示，本文总结了目前国内外常用的激发光源，并对其性能做了一个调研。
表2
自体荧光激发光源及其性能
Table2.
Autofluorescence excitation light sources and performance
如表 2所示，现有的激发光源各有不足，我们仍需寻找更好的替代光源，要求其单色性能更高，稳定性能更好，光功率密度适中，成本更加低廉。当然，为了迎合未来自体荧光检测设备的微型化趋势，激发光源的体积和重量还应该更加小巧。
3.1.2 激发光波长的选择
为了最大限度地激发内源性荧光物质，以有效地反映正常组织和不同阶段癌变组织荧光信号的差异，选择激发光波长应主要考虑激发光对生物组织的穿透深度、激发内源性荧光物质产生荧光的效率等因素。根据相关的实验研究，波长大于300 nm时，光对人体的损伤相对较小，这是自体荧光激发光波长的下限。根据自体荧光激发原理，激发光的波长小于所诱发的荧光的波长。而目前能分析处理的自体荧光的波长在可见光区域内，即400~700 nm。因此，激发光波长不能大于700 nm，这是自体荧光激发光波长的上限。当前，国内外的研究人员普遍选择的自体荧光的激发波长为325~480 nm。在此范围内，波长越长，激发光穿透生物组织的深度越大，如波长为442 nm的激发光穿透生物组织的深度约为600μm，而337 nm的激发光穿透生物组织深度只有约200μm。另外，不同波长的激发光激发的荧光物质不同，对组织的穿透深度也不同。
自体荧光激发-发射矩阵(excitation-emission matrix, EEM)是寻找最佳自体荧光激发波长的主要途径。刘丽娜等[20]采用260~540 nm、间隔20 nm的激发光检测结肠组织的荧光光谱，得到结肠组织EEM矩阵，通过对比不同组织在不同激发波长下的自体荧光光谱，得出诊查结肠病变的最佳激发波长为340、380、460和540 nm。Angelova等[22]利用280~440 nm的激发光分别诱发胃肠道正常组织和癌变组织的自体荧光光谱，采集两种组织在300~800 nm波段的自体荧光，做出激发光与发射光对应的准三维EEM彩图，并且利用EEM彩图的差异辨别正常和癌变组织。Luo等[23]则利用(400±50) nm的激发光测量结肠正常、增生、癌变组织的自体荧光光谱，通过比较460 nm处荧光光谱的强度，得出最佳激发波长为380 nm。
此外，在实际应用中，不同腔道含有的内源性荧光物质及其浓度不同，而且不同的组织癌变阶段需要不同的穿透深度。所以，针对不同腔道和不同阶段的癌变诊断，需要的最佳激发波长也不同。
3.2 荧光信号的数据处理方法
正确采集和提取有效的荧光信号信息对于提高癌前病变和早期癌症诊断的灵敏度和特异度至关重要。目前，自体荧光信号的采集和数据处理方法主要分为两大类：荧光图像法(表 3中1~4)和荧光光谱法(表 3中5~10)。
表3
不同波长激发光和不同算法的自体荧光诊断结果
Table3.
Diagnosis results using different excitation wavelengths and algorithms
3.2.1 荧光图像法
荧光图像法通过CCD图像传感器采集不同组织的自体荧光图像，直接根据图像颜色差异进行诊断。其优点是简单、直观，诊查范围大，可以实时诊断，并且不需要复杂的设备，这对于临床应用十分有利。曾堃等[24]通过研究数万例离体癌症标本，制定了自体荧光图像诊断的诊断标准。他们认为正常组织荧光图像呈蓝白色，良性病变荧光图像呈橘黄色，重度不典型增生的荧光图像呈紫红色，中度不典型增生的荧光图像呈暗紫色，轻度不典型增生的荧光图像呈暗色。Takeuchi等[25]采用伪彩色图像处理方法将复合的自体荧光图像显示出来，通过图像差异区分正常组织和癌变组织，诊断的灵敏度和特异度分别达到95%和64%。
当然，荧光图像法也存在许多缺点，例如图像判断的主观性强，实时性判断耗费医生大量的时间；图像质量容易受到周围环境的影响，以致带来诊断误差甚至误诊。因此，荧光图像诊断方法有待进一步改进以减少医生的工作时间，降低诊断结果对医生个人经验的依赖性。更智能、更有效的图像识别算法还有待于研究人员开发。
3.2.2 荧光光谱法
荧光光谱法是按“点”采集不同组织的自体荧光光谱，根据荧光强度差异进行诊断的方法。与荧光图像法相比，荧光光谱法更为严谨，而且光谱信号的信息量很大，几乎涵盖了已知的各种异常信息，包括不同的病变、癌变的分化程度、基因突变等。曾堃等[24]在制定自体荧光图像诊断标准的同时，还制定了自体荧光光谱诊断标准。他们假设正常组织的自体荧光光谱强度为100%，得出良性病变组织的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值大于70%，重度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%，并且有400 nm和680 nm的荧光峰，中度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%，并且有400 nm的荧光峰，轻度不典型增生的自体荧光光谱在470 nm的光谱峰值小于50%。目前，常用的自体荧光光谱采集和处理方法有：逐步回归分析法[19]、双峰比值法[29]、主成分分析法(principal component analysis, PCA)[8, 23]、人工神经网络法(artificial neural network, ANN)[23]和模式识别法[8]等。
与荧光图像法一样，荧光光谱法也存在许多缺点，其设备成本较高、结构复杂，不能直观地显示病变，而且在指导组织活检时不如荧光图像法精确、方便。因此，荧光光谱法的推广使用仍有一定局限。在自体荧光诊查技术的实际临床应用，有时会将荧光图像法和荧光光谱法结合使用，使二者在诊断过程中相互补充。
4 自体荧光技术的发展方向
自体荧光诊断技术在临床上对于癌症疾病的及时发现和治疗具有非常重要的意义。同时，它在临床上还可以引导甚至替代组织活检，为异常组织的病理学分析提供有利条件。但是，在现有阶段，自体荧光技术还存在着有多不足之处，它在临床上的广泛应用还需要研究者们付出更多的努力。
4.1 深入研究自体荧光诊断机制
随着研究的深入，我们知道生物组织不同的荧光物质与自体荧光光谱峰值的对应关系，并利用自体荧光信号的差异区分正常组织和癌变组织。但是，如何根据这种差异诊断不同分化程度的癌变还没有统一的标准。另外，不同腔道的生物组织，还有激发光的波长及入射角度等参数对自体荧光信号的测量结果都有很大影响。因此，针对不同腔道和不同阶段的癌前病变，选择合适的参数和制定精确的诊断标准具有十分重要的意义。这也是未来自体荧光技术发展的一个新趋势。
4.2 优化自体荧光检测系统
现有的自体荧光检测设备分辨率低、体积重大、价格昂贵，很难在普通医院推广应用。而且激发光源要通过有线光纤深入诊断部位，这只适用于各种短腔道和上消化道的诊断，难以实现全消化道的检查，容易造成漏检。因此，选择分辨率更高的荧光信号采集设备，选用性能更好的激发光源，同时减小设备的体积，实现更加全面的检查是自体荧光诊断技术发展的一个新趋势。
4.3 与外源性荧光技术结合
自体荧光检测技术在诊断平坦型肿瘤时的灵敏度和特异度不高，对于肿瘤边界定位的准确度也较低。随着高分辨率成像技术和荧光探针的发展，荧光标记分子成像技术在临床上越来越受到关注。将荧光标记的外源性探针靶向到癌变组织的过表达生物分子，利用荧光成像系统观察组织病变的生物过程，可以提高平坦型肿瘤诊断的灵敏度和肿瘤边界定位的精度。Zhang等[30]采用玫瑰红作为标记，检测活体动物的癌前病变，使用比值法判别不同程度的癌变组织，取得了积极的效果。因此，将自体荧光检测技术与外源荧光分子标记法结合起来，对于癌前病变和早期癌症的诊断具有非常重要的意义。
4.4 开发更精确和智能的诊断算法
在诊断过程中，自体荧光图像的颜色辨别主要依赖医生的个人经验，造成自体荧光技术对癌前病变和早期癌症的诊断特异度较低(＜67%)，这制约着自体荧光技术在临床上的推广应用。针对这一难题，开发更智能的图像处理算法以增强荧光图像的对比度是提高早期癌症诊断灵敏度和特异度的重要方向。而前文提到，荧光光谱信号的信息量很大，几乎涵盖了已知的各种异常信息，具有较高的诊断特异性。因此，将荧光光谱算法和图像处理算法相结合是提高诊断灵敏度和特异度的另一种发展趋势。
5 结论
自体荧光技术作为诊断癌前病变和早期癌症的新兴技术，对于真正实现癌症的及时发现与治疗具有重要意义。本文总结了国内外关于自体荧光检测技术的研究现状和进展，对自体荧光技术的检测原理和诊断系统组成作了详细地概括和分析。最后指出自体荧光成像和光谱技术在癌前病变和早期癌症诊断中的不足和发展方向。希望能为未来自体荧光诊断技术的研究和进一步改进提供有价值的参考。
