引用本文： 谢晓英, 郭勇, 向兵. 联合使用免疫抑制剂治疗难治性原发免疫性血小板减少症的疗效及其对血小板相关抗体水平影响的研究. 华西医学, 2014, 29(4): 616-619. doi: 10.7507/1002-0179.20140186 复制
原发免疫性血小板减少症（ITP）的发病机制至今仍未明确，但自身免疫因素导致血小板破坏增加已成为共识，而破坏途径涉及多重免疫学异常。目前认为ITP的一种发病机制为：体液免疫异常状态下，自身抗体介导的血小板被巨噬细胞系统破坏及血小板的生成受抑[1, 2]，这类抗体被称为血小板相关抗体（PAIG）。临床上有大约不到10%的ITP患者为难治性ITP，存在着极高的死亡风险和严重的治疗相关并发症。目前关于难治性ITP的具体治疗措施尚不确定，不同医疗单位及医学研究机构针对难治性ITP还在做着大量的尝试[3]。近年来，有国外学者尝试联合使用多种免疫抑制剂治疗难治性ITP，并取得了较好的疗效，为我们治疗难治性ITP提供了另一个思路[4]。我们在临床中联合使用2～3种免疫抑制剂治疗难治性ITP取得较好疗效，同时运用流式细胞术检测患者治疗前后的血清PAIG水平变化情况，以探讨免疫抑制剂对PAIG的影响和逆转作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2009年2月－2013年2月期间我科收治难治性ITP患者22例，其中男6例，女16例，中位年龄42岁。所有患者按入院号顺序随机分为联合治疗组（单数）和单药治疗组（双数），其中联合治疗组男2例，女9例，中位年龄44岁；单药治疗组男4例，女7例，中位年龄41岁。
所有患者曾接受的治疗方法平均有5种，均接受过脾切除及糖皮质激素治疗，且无效或者复发。治疗前血小板计数（1～30）×109/L，均有不同程度的脏器或黏膜出血。ITP诊断标准及难治性患者的判断标准均参照2011年新修订的ITP国内专家共识修订版[5]的标准。其中难治性ITP的标准：维持血小板计数需使用大剂量糖皮质激素口服，缓慢减用激素用量后血小板计数不能稳定于30×109/L以上者、ITP患者接受脾切除后无效或者复发。排除标准：年龄＜18岁的青少年，及＞60岁的老年人；孕妇；合并肿瘤者。
1.2 主要仪器及试剂
仪器：流式细胞仪（NAVIOS美国Beckman Coulter公司），低温离心机（Allegra X-12R美国Beckman Coulter公司）。试剂：小鼠抗人CD61-FITC（Biolegend公司），小鼠抗人IgG-PE（美国Biolegend公司），小鼠IgG-PE（美国Biolegend公司）。
1.3 方法
1.3.1 治疗方法
联合治疗组：第1阶段先予甲泼尼龙1 g/d静脉滴注，共3 d，免疫球蛋白0.4 g/（kg·d）静脉滴注，共5 d，以期获得外周血小板计数快速有效升高（＞30×109/L）；随后安排口服2～3种不同组合的免疫抑制剂（包括：环孢素A 50 mg，2次/d，口服；达那唑200 mg，2次/d，口服；吗替麦考酚酯1 g，2次/d，口服）维持治疗。单药治疗组：第1阶段治疗同联合治疗组；第2阶段，给予1种免疫抑制剂（单用环孢素A 50 mg，2次/d，口服；单用达那唑200 mg，2次/d，口服；单用吗替麦考酚酯1 g，2次/d，口服）维持治疗。所有患者住院期间若有出血表现均输注血小板及止血药物等治疗，严密观察出血情况及药物相关不良反应，定期检测血常规、电解质、肝肾功能指标。口服免疫抑制剂维持治疗3～6个月，每2周至1个月门诊随访。观察随访期6～24个月。
1.3.2 检测方法
了解不同治疗状态ITP患者抗血小板自身抗体的具体情况：分别于治疗前后采集上述患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管，置室温20℃。取上述标本150 μL于含有1.85 mL磷酸盐缓冲液的离心管中，200 g离心3次后重悬细胞。取3支流式细胞专用塑料试管，分别标记为ISO（对照管）、A（联合治疗）、B（单药治疗）。在ISO管中加入小鼠IgG-PE，及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL；A、B管中分别加入小鼠抗人IgG-PE及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL。上述各管中分别加入制备的细胞悬液50 μL，混匀后置室温，避光并反应30 min。运用流式细胞仪检测每份标本，设阈值为FL1（FITC），根据FITC与侧向角散射设定血小板门，测定5 000～10 000个血小板，分析阳性血小板的百分率。
1.3.3 疗效评定
参考全国血液学学术会议拟定的《血液病诊断及疗效标准（第3版）》[6]。显效：血小板恢复正常，无出血症状，持续3个月以上；维持2年以上无复发为基本治愈。良效：血小板升至50×109/L 或较原水平上升30×109/L以上，无或基本无出血症状，持续2个月以上。进步：血小板有所上升，出血症状改善，持续2周以上。无效：血小板计数及出血症状无改善或恶化。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较用t检验；等级资料以例数和百分比表示，组间比较用秩和检验。P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床治疗反应
经治疗后联合治疗组患者中显效6例（54.5%），良效2例（18.2%），进步1例（9.2%），无效2例（18.2%），总有效率为81.8%。单药治疗组11例患者中显效0例，良效2例（18.2%），进步1例（18.2%），无效7例（63.6%），总有效率为36.4%。两组治疗反应比较差异有统计学意义（Z=-2.796，P=0.005）。
2.2 两组治疗前后阳性血小板百分率的比较
联合治疗组阳性血小板治疗前为（33.55 ± 9.68）%，治疗后为（14.15 ± 13.03）%，较治疗前明显降低，差异有统计学意义（t=2.55，P＜0.05）；单药治疗组阳性血小板治疗前为（31.49 ± 11.07）%，治疗后为（25.19 ± 11.17）%，较治疗后有所降低，差异有统计学意义（t=2.37，P＜0.05）；联合治疗组与单药治疗组治疗后阳性血小板比较，联合治疗组治疗后较单药治疗组治疗后阳性血小板百分率下降明显，两组比较差异有统计学意义（t=2.58，P＜0.05）。 见图 1。
图1
流式细胞术检测PAIG分析图像采集 B2象限即为PAIgG阳性血小板的百分率 1a.空白对照，PAIgG阳性血小板的百分率为0 1b.治疗前，PAIgG阳性血小板的百分率为（33.55 ± 9.68）% 1c.免疫抑制剂联合治疗后，PAIgG阳性血小板的百分率下降为6.84 % 1d.免疫抑制剂单药治疗后，PAIgG阳性血小板的百分率下降为14.71%
3 讨论
ITP的发病机制十分复杂，自身免疫因素为其中最重要的一种致病机制，这类自身免疫异常将导致单纯血小板减少症。ITP患者的免疫异常通常均涉及B淋巴细胞体液免疫异常和T淋巴细胞免疫异常[1, 2]。已有研究显示：由于患者体液免疫异常，针对血小板特定抗原（血小板表面糖蛋白，如GPⅡ/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ糖蛋白复合体）所产生的抗体在诱导血小板破坏增加和血小板生成损伤方面发挥了主导作用[7]。机体这种针对血小板表面抗原或特定的免疫表型分子失耐受状态加速了网状内皮系统（单核巨噬系统）对血小板的破坏，最终表现出外周血血小板计数减少[7, 8]。通过运用糖皮质激素抑制B淋巴细胞免疫活性，减少抗血小板自身抗体的产生；使用脾动脉栓塞术或脾脏切除手术以减少网状内皮细胞对抗原抗体致敏血小板的吞噬及破坏，大部分患者血小板均可以得到有效的回升[9]；但仍有30%患者在接受脾切除后仍然表现为顽固性血小板减少状态或是短暂有效回升后再次急剧下降，或过度依赖于长期大剂量的糖皮质激素方可维持安全血小板计数状态，而长期大量糖皮质激素使用可产生严重的并发症（重症感染、结核复燃、广泛严重的骨质疏松、股骨头缺血性坏死等），这部分ITP患者即为临床上的难治性ITP，其病死率约10%～30%，大多来自于颅内出血或者治疗相关不良反应[10, 11]。传统免疫抑制剂治疗难治性ITP在过去的临床实践中似乎疗效并不明显。国外学者联合使用免疫抑制剂治疗难治性ITP取得了较好的疗效，作用机制重点在于多药联合的免疫抑制协调效应，从不同通路、途径抑制T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫功能，减少其对效应细胞、组织的免疫攻击[4]。本研究中，我们使用2～3种不同组合的免疫抑制剂治疗22例难治性ITP，治疗后血小板恢复达到显效和良效患者占72.7%，总体反应率81.8%（9/11），患者对治疗耐受好，血小板上升后继续维持治疗可以长期稳定于安全范围内，较单用免疫抑制剂治疗效果好。
近年的研究认为ITP的发病机制除B淋巴细胞增殖产生抗体外，尚存在T淋巴细胞亚群失衡的参与[3, 7, 8]。选用免疫抑制剂治疗ITP从免疫学和临床应用方面都得到充分证实，且可能还有其他方法所不能表现出的临床治疗优势：如达那唑治疗过程中，虽血小板还未上升，女性患者月经增多、阴道大量出血的现象得到很大程度缓解；但长期单独运用免疫抑制药物治疗也存在明显的局限性：长期维持的疗效仅不到30%的患者有效；往往需要较高剂量药物才能维持疗效，而长期较高剂量状态下的毒副作用表现十分明显：免疫抑制治疗状态下发生感染的机会明显增加；环孢素A长期应用引起肾脏毒性、毛发，齿龈过度增生；达那唑长期使用后表现为女性男性化改变（声音变粗、出现胡须和喉结的过度显露）；长春碱药物的周围神经损害等[4]。当选择联合多种免疫抑制剂治疗难治性ITP，在尽可能减少药物重叠毒性（减少每种药物的治疗用量；保证维持治疗时可以继续两药联合使用，但均在更低剂量状态下运用）的同时，以期从不同途径达到协同抑制PAIG的产生[1, 4]。我们运用流式细胞术检测了患者治疗前后抗PAIG阳性的血小板百分率的变化，结果提示，经免疫抑制剂治疗后，患者PAIG水平明显降低，多药联合治疗后PAIG阳性百分率降为6.84%；而单药免疫抑制治疗后，PAIG阳性百分率下降为14.71%，免疫抑制剂联合组治疗后PAIG水平明显低于单药治疗组，检测结果提示联合使用免疫抑制剂能有效抑制患者自身抗体的产生，在治疗难治性ITP时，对稳定血小板计数及减少复发有更好的效果。
难治性ITP的治疗尚无明确的标准方案。尽可能减少治疗相关不良反应并遵循个体化治疗原则的方案才是最好的选择。免疫抑制药物多药联合治疗方案在复发难治ITP部分患者中表现出较好的临床疗效，可以作为临床治疗复发难治ITP患者的一种选择。近几年将利妥昔单抗（鼠抗人CD20单克隆抗体）以及促血小板生成素受体激动剂用于ITP的二线治疗，为复发难治ITP的治疗提供了更多的选择[12-15]：利妥昔单抗治疗难治性ITP患者1年维持有效率为30%左右，3～5年有效率为20%；促血小板生成素受体激动剂Eltrombopag或Romiplostim治疗后60%～80%的患者血小板会有上升，在有效患者中采用维持治疗后，又有70%～90%的患者获得持续疗效[3, 13]。对复发难治ITP患者而言，治疗方案选择需结合其病情、身体状态、共患疾病情况及家庭经济承受能力综合决定[16, 17]。对于难治性ITP的研究，重点仍在于进一步探索ITP 发病机制，给临床治疗提供更可靠的线索。
原发免疫性血小板减少症（ITP）的发病机制至今仍未明确，但自身免疫因素导致血小板破坏增加已成为共识，而破坏途径涉及多重免疫学异常。目前认为ITP的一种发病机制为：体液免疫异常状态下，自身抗体介导的血小板被巨噬细胞系统破坏及血小板的生成受抑[1, 2]，这类抗体被称为血小板相关抗体（PAIG）。临床上有大约不到10%的ITP患者为难治性ITP，存在着极高的死亡风险和严重的治疗相关并发症。目前关于难治性ITP的具体治疗措施尚不确定，不同医疗单位及医学研究机构针对难治性ITP还在做着大量的尝试[3]。近年来，有国外学者尝试联合使用多种免疫抑制剂治疗难治性ITP，并取得了较好的疗效，为我们治疗难治性ITP提供了另一个思路[4]。我们在临床中联合使用2～3种免疫抑制剂治疗难治性ITP取得较好疗效，同时运用流式细胞术检测患者治疗前后的血清PAIG水平变化情况，以探讨免疫抑制剂对PAIG的影响和逆转作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2009年2月－2013年2月期间我科收治难治性ITP患者22例，其中男6例，女16例，中位年龄42岁。所有患者按入院号顺序随机分为联合治疗组（单数）和单药治疗组（双数），其中联合治疗组男2例，女9例，中位年龄44岁；单药治疗组男4例，女7例，中位年龄41岁。
所有患者曾接受的治疗方法平均有5种，均接受过脾切除及糖皮质激素治疗，且无效或者复发。治疗前血小板计数（1～30）×109/L，均有不同程度的脏器或黏膜出血。ITP诊断标准及难治性患者的判断标准均参照2011年新修订的ITP国内专家共识修订版[5]的标准。其中难治性ITP的标准：维持血小板计数需使用大剂量糖皮质激素口服，缓慢减用激素用量后血小板计数不能稳定于30×109/L以上者、ITP患者接受脾切除后无效或者复发。排除标准：年龄＜18岁的青少年，及＞60岁的老年人；孕妇；合并肿瘤者。
1.2 主要仪器及试剂
仪器：流式细胞仪（NAVIOS美国Beckman Coulter公司），低温离心机（Allegra X-12R美国Beckman Coulter公司）。试剂：小鼠抗人CD61-FITC（Biolegend公司），小鼠抗人IgG-PE（美国Biolegend公司），小鼠IgG-PE（美国Biolegend公司）。
1.3 方法
1.3.1 治疗方法
联合治疗组：第1阶段先予甲泼尼龙1 g/d静脉滴注，共3 d，免疫球蛋白0.4 g/（kg·d）静脉滴注，共5 d，以期获得外周血小板计数快速有效升高（＞30×109/L）；随后安排口服2～3种不同组合的免疫抑制剂（包括：环孢素A 50 mg，2次/d，口服；达那唑200 mg，2次/d，口服；吗替麦考酚酯1 g，2次/d，口服）维持治疗。单药治疗组：第1阶段治疗同联合治疗组；第2阶段，给予1种免疫抑制剂（单用环孢素A 50 mg，2次/d，口服；单用达那唑200 mg，2次/d，口服；单用吗替麦考酚酯1 g，2次/d，口服）维持治疗。所有患者住院期间若有出血表现均输注血小板及止血药物等治疗，严密观察出血情况及药物相关不良反应，定期检测血常规、电解质、肝肾功能指标。口服免疫抑制剂维持治疗3～6个月，每2周至1个月门诊随访。观察随访期6～24个月。
1.3.2 检测方法
了解不同治疗状态ITP患者抗血小板自身抗体的具体情况：分别于治疗前后采集上述患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管，置室温20℃。取上述标本150 μL于含有1.85 mL磷酸盐缓冲液的离心管中，200 g离心3次后重悬细胞。取3支流式细胞专用塑料试管，分别标记为ISO（对照管）、A（联合治疗）、B（单药治疗）。在ISO管中加入小鼠IgG-PE，及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL；A、B管中分别加入小鼠抗人IgG-PE及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL。上述各管中分别加入制备的细胞悬液50 μL，混匀后置室温，避光并反应30 min。运用流式细胞仪检测每份标本，设阈值为FL1（FITC），根据FITC与侧向角散射设定血小板门，测定5 000～10 000个血小板，分析阳性血小板的百分率。
1.3.3 疗效评定
参考全国血液学学术会议拟定的《血液病诊断及疗效标准（第3版）》[6]。显效：血小板恢复正常，无出血症状，持续3个月以上；维持2年以上无复发为基本治愈。良效：血小板升至50×109/L 或较原水平上升30×109/L以上，无或基本无出血症状，持续2个月以上。进步：血小板有所上升，出血症状改善，持续2周以上。无效：血小板计数及出血症状无改善或恶化。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较用t检验；等级资料以例数和百分比表示，组间比较用秩和检验。P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床治疗反应
经治疗后联合治疗组患者中显效6例（54.5%），良效2例（18.2%），进步1例（9.2%），无效2例（18.2%），总有效率为81.8%。单药治疗组11例患者中显效0例，良效2例（18.2%），进步1例（18.2%），无效7例（63.6%），总有效率为36.4%。两组治疗反应比较差异有统计学意义（Z=-2.796，P=0.005）。
2.2 两组治疗前后阳性血小板百分率的比较
联合治疗组阳性血小板治疗前为（33.55 ± 9.68）%，治疗后为（14.15 ± 13.03）%，较治疗前明显降低，差异有统计学意义（t=2.55，P＜0.05）；单药治疗组阳性血小板治疗前为（31.49 ± 11.07）%，治疗后为（25.19 ± 11.17）%，较治疗后有所降低，差异有统计学意义（t=2.37，P＜0.05）；联合治疗组与单药治疗组治疗后阳性血小板比较，联合治疗组治疗后较单药治疗组治疗后阳性血小板百分率下降明显，两组比较差异有统计学意义（t=2.58，P＜0.05）。 见图 1。
图1
流式细胞术检测PAIG分析图像采集 B2象限即为PAIgG阳性血小板的百分率 1a.空白对照，PAIgG阳性血小板的百分率为0 1b.治疗前，PAIgG阳性血小板的百分率为（33.55 ± 9.68）% 1c.免疫抑制剂联合治疗后，PAIgG阳性血小板的百分率下降为6.84 % 1d.免疫抑制剂单药治疗后，PAIgG阳性血小板的百分率下降为14.71%
3 讨论
ITP的发病机制十分复杂，自身免疫因素为其中最重要的一种致病机制，这类自身免疫异常将导致单纯血小板减少症。ITP患者的免疫异常通常均涉及B淋巴细胞体液免疫异常和T淋巴细胞免疫异常[1, 2]。已有研究显示：由于患者体液免疫异常，针对血小板特定抗原（血小板表面糖蛋白，如GPⅡ/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ糖蛋白复合体）所产生的抗体在诱导血小板破坏增加和血小板生成损伤方面发挥了主导作用[7]。机体这种针对血小板表面抗原或特定的免疫表型分子失耐受状态加速了网状内皮系统（单核巨噬系统）对血小板的破坏，最终表现出外周血血小板计数减少[7, 8]。通过运用糖皮质激素抑制B淋巴细胞免疫活性，减少抗血小板自身抗体的产生；使用脾动脉栓塞术或脾脏切除手术以减少网状内皮细胞对抗原抗体致敏血小板的吞噬及破坏，大部分患者血小板均可以得到有效的回升[9]；但仍有30%患者在接受脾切除后仍然表现为顽固性血小板减少状态或是短暂有效回升后再次急剧下降，或过度依赖于长期大剂量的糖皮质激素方可维持安全血小板计数状态，而长期大量糖皮质激素使用可产生严重的并发症（重症感染、结核复燃、广泛严重的骨质疏松、股骨头缺血性坏死等），这部分ITP患者即为临床上的难治性ITP，其病死率约10%～30%，大多来自于颅内出血或者治疗相关不良反应[10, 11]。传统免疫抑制剂治疗难治性ITP在过去的临床实践中似乎疗效并不明显。国外学者联合使用免疫抑制剂治疗难治性ITP取得了较好的疗效，作用机制重点在于多药联合的免疫抑制协调效应，从不同通路、途径抑制T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫功能，减少其对效应细胞、组织的免疫攻击[4]。本研究中，我们使用2～3种不同组合的免疫抑制剂治疗22例难治性ITP，治疗后血小板恢复达到显效和良效患者占72.7%，总体反应率81.8%（9/11），患者对治疗耐受好，血小板上升后继续维持治疗可以长期稳定于安全范围内，较单用免疫抑制剂治疗效果好。
近年的研究认为ITP的发病机制除B淋巴细胞增殖产生抗体外，尚存在T淋巴细胞亚群失衡的参与[3, 7, 8]。选用免疫抑制剂治疗ITP从免疫学和临床应用方面都得到充分证实，且可能还有其他方法所不能表现出的临床治疗优势：如达那唑治疗过程中，虽血小板还未上升，女性患者月经增多、阴道大量出血的现象得到很大程度缓解；但长期单独运用免疫抑制药物治疗也存在明显的局限性：长期维持的疗效仅不到30%的患者有效；往往需要较高剂量药物才能维持疗效，而长期较高剂量状态下的毒副作用表现十分明显：免疫抑制治疗状态下发生感染的机会明显增加；环孢素A长期应用引起肾脏毒性、毛发，齿龈过度增生；达那唑长期使用后表现为女性男性化改变（声音变粗、出现胡须和喉结的过度显露）；长春碱药物的周围神经损害等[4]。当选择联合多种免疫抑制剂治疗难治性ITP，在尽可能减少药物重叠毒性（减少每种药物的治疗用量；保证维持治疗时可以继续两药联合使用，但均在更低剂量状态下运用）的同时，以期从不同途径达到协同抑制PAIG的产生[1, 4]。我们运用流式细胞术检测了患者治疗前后抗PAIG阳性的血小板百分率的变化，结果提示，经免疫抑制剂治疗后，患者PAIG水平明显降低，多药联合治疗后PAIG阳性百分率降为6.84%；而单药免疫抑制治疗后，PAIG阳性百分率下降为14.71%，免疫抑制剂联合组治疗后PAIG水平明显低于单药治疗组，检测结果提示联合使用免疫抑制剂能有效抑制患者自身抗体的产生，在治疗难治性ITP时，对稳定血小板计数及减少复发有更好的效果。
难治性ITP的治疗尚无明确的标准方案。尽可能减少治疗相关不良反应并遵循个体化治疗原则的方案才是最好的选择。免疫抑制药物多药联合治疗方案在复发难治ITP部分患者中表现出较好的临床疗效，可以作为临床治疗复发难治ITP患者的一种选择。近几年将利妥昔单抗（鼠抗人CD20单克隆抗体）以及促血小板生成素受体激动剂用于ITP的二线治疗，为复发难治ITP的治疗提供了更多的选择[12-15]：利妥昔单抗治疗难治性ITP患者1年维持有效率为30%左右，3～5年有效率为20%；促血小板生成素受体激动剂Eltrombopag或Romiplostim治疗后60%～80%的患者血小板会有上升，在有效患者中采用维持治疗后，又有70%～90%的患者获得持续疗效[3, 13]。对复发难治ITP患者而言，治疗方案选择需结合其病情、身体状态、共患疾病情况及家庭经济承受能力综合决定[16, 17]。对于难治性ITP的研究，重点仍在于进一步探索ITP 发病机制，给临床治疗提供更可靠的线索。
