引用本文： 赖思可, 曹畅, 李箭, 李棋. 玻璃酸钠作用于兔膝骨关节炎的代谢组学研究. 华西医学, 2018, 33(9): 1153-1161. doi: 10.7507/1002-0179.201808068 复制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以损害关节软骨为特征，并累及软骨下骨、滑膜和关节周围组织的进展性骨关节疾患[1-3]。膝关节 OA 发病率居全身各部 OA 的首位[4]，中老年人群中发病最常见，65 岁以上人群中约 50% 患有膝关节 OA，大大影响了中老年人的日常生活质量[5]。目前 OA 的发病机制仍不清楚，普遍认为 OA 是关节软骨、关节滑膜、软骨下骨三者在力学和生物学因素共同作用下，降解和合成偶联失衡的结果。1999 年 Nicholson 等[6]完善了代谢组学这一概念，代谢组学重点研究的是基因表达的最终产物，通过对低分子量代谢产物进行定性定量分析从而对疾病进行诊断和药物治疗。该技术可以鉴定标本中所包含的异常生物指标，从而用于包括 OA 在内的多种疾病的诊断、检测预后以及治疗[7-8]。玻璃酸钠（hyaluronate，HA）是一种是高分子量多糖，是关节软骨基质和滑液的主要成分，能增加关节液的黏弹性和润滑功能，促进软骨再生和修复，改善滑液组织的炎性反应而缓解疼痛[9-10]。1974 年 Peyron 等[11]首次将通过关节腔注射 HA 运用于 OA，取得了良好效果，并有大样本、多中心的临床研究证实了其确切疗效，但 HA 治疗骨关节疾病的作用机制仍未被完全阐明。基于上述背景，本研究拟采用核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）为基础的代谢组学检测分析研究 HA 在兔膝关节 OA 模型中的影响及作用机制，为进一步研究 HA 治疗 OA 的具体机制提供新思路和新依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
重水（D2O）：美国 Cambridge Isotope Laboratories 公司； 3-（三甲基硅基）丙酸钠盐：美国 Cambridge Isotope Laboratories 公司；40% 多聚甲醛：江苏永华精细化工有限公司；HA 注射液（商品名：阿尔治）：日本生化学工业株式会社；Bruker AVⅢ 600 MHz NMR 谱仪：德国 Bruker Biospin 公司。
1.2 实验动物
30 只健康的 6 月龄新西兰大白兔，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg。本研究实验动物由四川大学华西医院动物实验中心提供［实验动物生产许可证号 SCXK（川）2013-14，实验动物使用许可证号 SYXK（川）2013-119］，动物日常护理及实验条件均符合《中华人民共和国实验动物环境及设施标准》[12]。实验过程中观察记录动物的体质量、饮食情况、活动量及精神状态等。
1.3 实验方法
1.3.1 随机分组及处理
将动物实验中心提供的 30 只新西兰大白兔编号，按照随机数字表法分为：健康空白对照组（N 组）与模型组［包括磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）注射组（P 组）、HA 注射组（H 组）］，每组各 10 只。其中 P、H 两组采用 Hulth 造模方式进行左侧膝关节炎模型制备。
1.3.2 OA 造模
术前 30 min 肌肉注射青霉素钠 80 万 U，用 2.0% 戊巴比妥钠经大白兔耳缘静脉注射麻醉，常规消毒、铺巾。采用 Hulth 造模方式[13]：无菌条件下取左膝关节内侧纵切口长约 2 cm，显露膝关节，切断内侧副韧带及前交叉韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，消毒。术后无菌敷料覆盖伤口并用胶带固定但不固定伤肢，自由活动，给予青霉素钠预防感染 1 周。手术后 7 d 驱赶动物，30 min/d，分 2 次驱赶，驱赶动物 4 周后行 X 线照片、取材及病理学观察，证实兔膝 OA 造模成功。结合预实验结果及文献，将造模术后 4 周确定为兔膝 OA 早期。
1.3.3 给药方法
将兔进行耳缘静脉轻度麻醉，仰卧固定于手术台上，刮去膝关节处毛发。将兔膝关节微曲，消毒，注射器通过髌上囊外侧穿刺进入关节腔，严格按照膝关节腔注射方法给药。P 组给予 PBS 液 0.3 mL，H 组给予 HA 注射液 0.3 mL。于造模术后第 5 周开始注射，1 次/周，总共进行 5 次。N 组不予特殊处理。
1.3.4 取材
造模术后第 10 周以空气栓塞处死全部实验动物取材。① 血清。全部实验动物消毒待乙醇完全挥发后取耳缘静脉血 5 mL，缓慢注入真空采血管，静置 1 h 后进行凝固分层。1 500 r/min 离心15 min 取上清液装载干净的离心管中，再 3 500 r/min离心 5 min，取上清液分装到冻存管中，每管 0.5 mL，置于液氮罐中迅速冷冻，并转入–80° 冰箱保存待测。② 关节液。实验兔固定后，剪去左侧膝关节部位毛发，消毒后在髌韧带附着点外上方约 0.5 cm 处穿刺进针，抽取关节液于冻存管，快速移入液氮罐中冷冻，而后转入–80° 冰箱保存待测。
1.3.5 观测指标
① 一般情况。观察动物术后的饮食及精神状态，休息时体位、活动量、切口愈合情况，注意左膝关节有无肿胀、活动障碍、脱位，局部有无积液以及感染情况。
② 大体观察。观察动物造模术后滑膜有无增生、关节囊滑液量、软骨表面有无磨损及光滑度、有无骨赘等情况。
③ 影像学检查。术后第 4 周拍片：麻醉后将实验动物仰卧于检查床，使用沙袋分别伸直、固定双下肢，拍摄双侧膝关节正侧位 X 线片。观察左侧膝关节间隙是否对称、关节面有无磨损及骨赘形成。
④ 组织病理学观察。术后第 4 周处死 2 只、术后第 10 周全部处死实验动物，取材，进行标本脱钙石蜡切片，行软骨组织的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学（组化）染色。光学显微镜（光镜）下观察其病理组织结构和胶原纤维分布情况，有无炎性细胞浸润。
⑤ 代谢组学检测及分析。在 Bruker AVⅢ600 MHz NMR 谱仪上进行检测，质子共振频率为 600.13 MHz，实验温度为 298 K，检测 CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列[14]。血样每个精确吸取 200 μL 样品和 400 μL 钠离子（Na+）/钾离子（K+）缓冲液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化钠）至 5 mm 核磁管，混匀后进行核磁检测。关节液每个吸取 160 μL 样品和 320 μL Na+/K+ 缓冲液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化钠）至 5 mm 核磁管，不足 160 μL 的以 D2O 补足，混匀后进行核磁检测。检测得到的自由感应衰减信号经傅立叶变换转为 1H-NMR 图谱，使用相关软件将所有样本的 1H-NMR 谱进行分段积分。对所有数据进行归一化处理，将数据导入 SIMCA-P 11.5（瑞典 Umetrics AB 公司）软件包，通过无监督的模式识别法主成分分析（principal components analysis，PCA）进行多维统计分析。通过 7 次循环交叉验证法确定主成分值及验证模型的稳定性和预测性，获得 PCA 模型。进一步采用有监督的模式识别法进行多维统计分析，建立正交信号校正偏最小二乘判别（orthogonal signal correction-partial least squares-discriminant analysis，OSC-PLS-DA）模型。以每种存在差异的代谢产物作为变量，OSC-PLS-DA 模型的散点图分布为结果，用相关系数法进行差异代谢物筛选，利用代谢数据库来分析差异代谢物所参与的代谢途径和代谢通路。A. 差异代谢相对浓度比较：由 SIMCA-P 软件筛选出差异代谢产物后，根据其在 1H NMR 图谱上的峰面积可推算出其相对浓度。相对浓度的升高或者降低反映了相比较的两类标本之间差异代谢产物变化的趋势，通过列表及波形拟合的趋势图可以较为直观地展示出来，选用相应的单维统计分析方法，进一步比较每个差异代谢物在两类标本之间的差异。B. 代谢通路分析：将发现的差异代谢物输入 Metabo-Analyst，系统完成其在 HMDB、PubChem、KEGG 等数据库的编号和信息匹配，然后采用机器算法分析出可能的代谢途径，最后将相关代谢通路按 P 值大小排列显示。
2 结果
2.1 一般情况
所有模型组动物术后 1 h 内苏醒，恢复活动，进食正常。术后切口均无感染，造模区愈合良好。
2.2 大体标本观察
N 组：关节腔无积液，滑膜未见增生，股骨髁及胫骨平台表面光滑，色泽鲜亮，未见软骨磨损及骨赘形成。模型组：左侧关节腔少量积液，颜色清亮，滑膜轻度增生，股骨髁表面较光整，左侧胫骨平台色泽灰暗，表面欠光滑，内侧缘可见骨赘形成。
2.3 影像学表现
N 组：双侧膝关节间隙对称，无狭窄，骨性关节面光滑，未见骨赘形成；脂肪垫清晰，关节周围软组织未见肿胀（图 1a）。模型组：左侧膝关节内侧胫骨平台有增生、稍微变尖，骨赘形成，内侧关节囊肿胀，髌下脂肪垫透亮度减低，关节间隙狭窄（图 1b）。
图1
实验动物双膝关节正侧位 X 线片
a. N 组动物 X 线片，可见关节间隙对称，未见明显狭窄及骨赘形成；b. 模型组动物 X 线片，可见模型侧胫骨平台有增生，骨赘形成，关节间隙变窄
2.4 组织病理学观察
分别进行实验动物关节软骨 HE、甲苯胺蓝及免疫组化染色，光镜下观察到病理组织结构和胶原纤维分布情况，及炎性细胞浸润（图 2）。N 组：双侧关节软骨表面光滑、平整，软骨层次清楚，潮线完整，软骨细胞分布均匀，细胞排列整齐，无簇聚或减少；甲苯胺蓝染色示基质呈均匀的深蓝色，无失染现象。P 组：左侧膝关节软骨光镜下观察到软骨表面变薄、粗糙不规则，可见较小和浅的裂隙，潮线不完整，软骨细胞数量减少，排列紊乱，无细胞聚集现象；甲苯胺蓝染色示基质轻度失染。H 组：左侧软骨组织表面有纤维组织增生，软骨细胞呈散在的点状增生，软骨细胞轮廓模糊，有散在的淋巴细胞和浆细胞，细胞排列紊乱，但层次可分清。3 组标本图形对比观察，HA 组具有一定的软骨修复能力。
图2
光镜下组织病理学表现
2.5 代谢组学分析
2.5.1 血清样本
① 血清 1H-NMR 谱代谢物识别。实验动物 N 组、P 组及 H 组的血清经过磁共振检测得到的 1H-NMR 谱见图 3a，图中横坐标表示化学位移，主要代谢物包括：组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸类；脂肪酸、不饱和脂肪酸等脂质类；葡萄糖等糖类；乳酸、柠檬酸、醋酸等有机酸类；丙酮酸、谷氨酰胺、胆碱等中间代谢产物；高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白类及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶类。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H6 点出现了明显偏离，离散样品会影响模型结构，使模型失真。离散点数量极少，可能由样本采集或数据采集过程中受到污染造成，予以剔除后再次进行分析，离散点对整体分布影响较小，得到如下 PCA 模型（图 3b）。3 组动物的血清代谢物已出现了一定的分离趋势，但还未达到明显区分的目标。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。通过 PCA 模型分析，对血清组的代谢物分布情况有了一个整体的认识，进一步采用有监督的模式识别法进行多维统计分析，并建立 OSC-PLS-DA 模型。根据实验需求，重点进行 P-H 组间模型比较，得到 OSC-PLS-DA 模型（图 3c）。在有监督的 OSC-PLS-DA 模型中，血清中的 P 组代谢物与 H 组代谢物已明显分离。
④ 差异代谢物筛选。血清 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型相关系数图见图 3d，图中远离原点的变量数据即为可能引起组间差异的主要代谢物。
图3
血清样本的 1H-NMR 谱代谢组学分析
a. 血清的 1H-NMR 谱代谢物识别；b、c. 分别为血清 1H-NMR 谱 PCA 散点图和 OSC-PLS-DA 散点图，N 表示健康空白对照组，P 表示 PBS 注射组，H 表示 HA 注射组，横纵坐标表示 2 个主成分；d. 血清 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型的负载权重图，横纵坐标表示 2 个主成分
2.5.2 关节液样本
① 关节液 1H-NMR 谱代谢物识别。实验动物 N 组、P 组及 H 组的关节液经过磁共振检测得到 1H-NMR 谱（图 4a）。主要的代谢物包括：组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸类；脂肪酸、不饱和脂肪酸等脂质类；葡萄糖等糖类；乳酸、柠檬酸、醋酸等有机酸类；丙酮酸、谷氨酰胺、胆碱等中间代谢产物；高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白类以及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶类。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H2、H9 点出现了明显偏离，离散点数量极少，可能由样本采集或数据采集过程中受到污染造成，予以剔除后再次进行分析，离散点对整体分布影响较小，PCA 散点图如图 4b 示，3 组样品已出现分离趋势，可进行后续 OPLS 分析。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。将数据进行正交信号校正处理后，进行 OPLS-DA 分析，见图 4c，可见 3 组样品已达到完全分离。
④ 差异代谢物筛选。关节液1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型相关系数图见图 4d ，图中远离原点的变量数据即为可能引起组间差异的主要代谢物。
图4
关节液样本的1H-NMR 谱代谢组学分析
a. 关节液的 1H-NMR 谱代谢物识别；b、c. 分别为关节液 1H-NMR 谱 PCA 散点图和 OSC-PLS-DA 散点图，N 表示健康空白对照组，P 表示 PBS 注射组，H 表示 HA 注射组，横纵坐标表示 2 个主成分；d. 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型的负载权重图，横纵坐标表示2 个主成分
2.5.3 差异代谢相对浓度比较
血清中亮氨酸、缬氨酸、脂质、赖氨酸、醋酸、谷氨酸、柠檬氨酸、苏氨酸、葡萄糖、不饱和脂肪酸和甲基组氨酸水平 H 组较 P 组均升高，而高密度脂蛋白、乳酸、丙氨酸降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
关节液中亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、醋酸、谷氨酸、乙酰乙酸、柠檬酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及甲酸水平 H 组较 N 组升高，而脂质、乳酸、琥珀酸、肌酸、葡萄糖水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5.4 代谢通路分析
由图 5 分析可发现，产生差异代谢物的可能代谢通路主要是蛋白质的生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸的代谢、三羧酸循环及生物素代谢、糖异生和葡萄糖-丙氨酸循环等。
图5
通过代谢物富集分析发现的相关代谢途径
3 讨论
目前 OA 研究的模型有多种[15-17]，动物模型主要有：自发性模型，即实验动物在无人为干预处理情况下产生，如 STR/ort 小鼠模型、Hartley 豚鼠模型、Bgn-Fbn 双基因敲除小鼠等；诱发性模型，即通过人为有目的地进行处理干预来诱导产生[18-19]，如改变饮食、关节腔注射药物及膝关节固定等；手术方法，如改变关节应力、关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导法及关节切开造模等，其中前交叉韧带、半月板切除、Hulth 法是主要膝 OA 手术造模方式，以 Hulth 法建模最为经典[20]。本研究根据实验设计和实验条件，选择兔模型，兔膝关节组织结构与人较类似，其 OA 模型的软骨生化指标与人类也相近。
HA 是体内重要的生理活性物质，是由 2 000～25 000 个 β-N-乙酞氨基葡糖和 D-葡糖醛酸单糖重复连接而成的链状聚合物[21]。正常关节滑液具有一定的黏弹性，对关节有屏障保护及润滑减震等作用，对于维持膝关节软骨面的稳定具有重要意义。OA 关节中滑液的黏弹性减少主要是由于关节滑液中 HA 浓度降低所致。目前关节腔注射 HA 治疗 OA 己被广泛应用。外源性 HA 的生理作用主要是减震、保护软骨、抑制软骨细胞丢失、减少 OA 中炎症细胞。据本动物实验观察，H 组对兔膝骨关节软骨损伤的疗效优于 P 组，但对半月板和滑膜无明确的作用。Pham 等[22]实验表明，关节腔注射 HA 能补充外源性 HA 并刺激内源性 HA 分泌，恢复关节润滑及改善炎症反应，促进关节软骨修复，改善关节功能。HA 膝关节腔注射是目前治疗轻中度 OA 的有效药物，应结合个体化治疗方案进行选择。
目前 OA 的病因和发病机制尚不清楚，相关因素主要包括外伤、肥胖、炎症、遗传、内分泌异常、气候、肌肉衰弱、关节松弛等，此外，与细胞因子、生长因子、免疫及代谢因素也有关[23-25]。本研究从代谢水平分析了 HA 治疗 OA 的作用机制，主要与活化蛋白质代谢、脂代谢和能量代谢等途径有关。软骨细胞是驻留在关节软骨内的唯一细胞，负责维持基质合成代谢和分解代谢之间的稳态平衡[26-27]。软骨细胞功能障碍和活力丧失会导致进行性软骨损伤[28]，进而发展为 OA。退化的软骨细胞表现出合成代谢活性降低和分解代谢活性增加，从而损害软骨细胞外基质完整性[29-30]。有研究表明，OA 会改变能量代谢，包括糖酵解和氧化磷酸化之间的平衡[31]。OA 发生过程中软骨细胞的肥大变化可能是由糖酵解减少和乳酸积累造成。关节软骨细胞中腺苷酸激活蛋白激酶活性降低有可能通过促进基质分解代谢破坏软骨稳态，改变能量代谢，从而促进 OA 的发展[32]。氨基酸的代谢改变与 OA 的发病机制和炎症改变有关，OA 发生过程中的外周伤害感受转导可能由谷氨酸和花生四烯酸衍生的炎症介质发生，代谢异常导致了 OA 关节中解剖学和生理学的变化[33-36]。支链氨基酸是构成骨骼肌蛋白质约 1/3 的必需氨基酸，是能量代谢的重要燃料。研究发现，在膝关节 OA 患者中，支链氨基酸与组氨酸的比例相较于正常组更高，这一代谢比例有望在未来成为监测 OA 进展的有效标志[37-39]。近年来有研究表明，OA 与以血脂异常为特征的代谢综合征有关，高胆固醇血症与 OA 之间存在关联[40-41]。胆固醇是软骨细胞生物学中的一种重要信号，可通过孤核受体 Ror-α 的表达刺激软骨细胞肥大[42]。Huang 等[43]最近提出，脂质多糖介导的炎症可能解释肥胖、代谢综合征和 OA 之间的关联。因此，脂代谢在 OA 的发生与进展中有着重要作用。
本研究基于 1H-NMR 平台，通过检测生物体液中的内源性代谢产物浓度，结合化学信息学分析方法来确定生物体在生理病理状态或者给药前后代谢物成分的变化模式，结果显示 HA 对 OA 的作用主要与蛋白质代谢、脂代谢和能量代谢等代谢途径的激活有关，为研究 HA 治疗膝 OA 的具体机制提供了新思路和新依据。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以损害关节软骨为特征，并累及软骨下骨、滑膜和关节周围组织的进展性骨关节疾患[1-3]。膝关节 OA 发病率居全身各部 OA 的首位[4]，中老年人群中发病最常见，65 岁以上人群中约 50% 患有膝关节 OA，大大影响了中老年人的日常生活质量[5]。目前 OA 的发病机制仍不清楚，普遍认为 OA 是关节软骨、关节滑膜、软骨下骨三者在力学和生物学因素共同作用下，降解和合成偶联失衡的结果。1999 年 Nicholson 等[6]完善了代谢组学这一概念，代谢组学重点研究的是基因表达的最终产物，通过对低分子量代谢产物进行定性定量分析从而对疾病进行诊断和药物治疗。该技术可以鉴定标本中所包含的异常生物指标，从而用于包括 OA 在内的多种疾病的诊断、检测预后以及治疗[7-8]。玻璃酸钠（hyaluronate，HA）是一种是高分子量多糖，是关节软骨基质和滑液的主要成分，能增加关节液的黏弹性和润滑功能，促进软骨再生和修复，改善滑液组织的炎性反应而缓解疼痛[9-10]。1974 年 Peyron 等[11]首次将通过关节腔注射 HA 运用于 OA，取得了良好效果，并有大样本、多中心的临床研究证实了其确切疗效，但 HA 治疗骨关节疾病的作用机制仍未被完全阐明。基于上述背景，本研究拟采用核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）为基础的代谢组学检测分析研究 HA 在兔膝关节 OA 模型中的影响及作用机制，为进一步研究 HA 治疗 OA 的具体机制提供新思路和新依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
重水（D2O）：美国 Cambridge Isotope Laboratories 公司； 3-（三甲基硅基）丙酸钠盐：美国 Cambridge Isotope Laboratories 公司；40% 多聚甲醛：江苏永华精细化工有限公司；HA 注射液（商品名：阿尔治）：日本生化学工业株式会社；Bruker AVⅢ 600 MHz NMR 谱仪：德国 Bruker Biospin 公司。
1.2 实验动物
30 只健康的 6 月龄新西兰大白兔，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg。本研究实验动物由四川大学华西医院动物实验中心提供［实验动物生产许可证号 SCXK（川）2013-14，实验动物使用许可证号 SYXK（川）2013-119］，动物日常护理及实验条件均符合《中华人民共和国实验动物环境及设施标准》[12]。实验过程中观察记录动物的体质量、饮食情况、活动量及精神状态等。
1.3 实验方法
1.3.1 随机分组及处理
将动物实验中心提供的 30 只新西兰大白兔编号，按照随机数字表法分为：健康空白对照组（N 组）与模型组［包括磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）注射组（P 组）、HA 注射组（H 组）］，每组各 10 只。其中 P、H 两组采用 Hulth 造模方式进行左侧膝关节炎模型制备。
1.3.2 OA 造模
术前 30 min 肌肉注射青霉素钠 80 万 U，用 2.0% 戊巴比妥钠经大白兔耳缘静脉注射麻醉，常规消毒、铺巾。采用 Hulth 造模方式[13]：无菌条件下取左膝关节内侧纵切口长约 2 cm，显露膝关节，切断内侧副韧带及前交叉韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，消毒。术后无菌敷料覆盖伤口并用胶带固定但不固定伤肢，自由活动，给予青霉素钠预防感染 1 周。手术后 7 d 驱赶动物，30 min/d，分 2 次驱赶，驱赶动物 4 周后行 X 线照片、取材及病理学观察，证实兔膝 OA 造模成功。结合预实验结果及文献，将造模术后 4 周确定为兔膝 OA 早期。
1.3.3 给药方法
将兔进行耳缘静脉轻度麻醉，仰卧固定于手术台上，刮去膝关节处毛发。将兔膝关节微曲，消毒，注射器通过髌上囊外侧穿刺进入关节腔，严格按照膝关节腔注射方法给药。P 组给予 PBS 液 0.3 mL，H 组给予 HA 注射液 0.3 mL。于造模术后第 5 周开始注射，1 次/周，总共进行 5 次。N 组不予特殊处理。
1.3.4 取材
造模术后第 10 周以空气栓塞处死全部实验动物取材。① 血清。全部实验动物消毒待乙醇完全挥发后取耳缘静脉血 5 mL，缓慢注入真空采血管，静置 1 h 后进行凝固分层。1 500 r/min 离心15 min 取上清液装载干净的离心管中，再 3 500 r/min离心 5 min，取上清液分装到冻存管中，每管 0.5 mL，置于液氮罐中迅速冷冻，并转入–80° 冰箱保存待测。② 关节液。实验兔固定后，剪去左侧膝关节部位毛发，消毒后在髌韧带附着点外上方约 0.5 cm 处穿刺进针，抽取关节液于冻存管，快速移入液氮罐中冷冻，而后转入–80° 冰箱保存待测。
1.3.5 观测指标
① 一般情况。观察动物术后的饮食及精神状态，休息时体位、活动量、切口愈合情况，注意左膝关节有无肿胀、活动障碍、脱位，局部有无积液以及感染情况。
② 大体观察。观察动物造模术后滑膜有无增生、关节囊滑液量、软骨表面有无磨损及光滑度、有无骨赘等情况。
③ 影像学检查。术后第 4 周拍片：麻醉后将实验动物仰卧于检查床，使用沙袋分别伸直、固定双下肢，拍摄双侧膝关节正侧位 X 线片。观察左侧膝关节间隙是否对称、关节面有无磨损及骨赘形成。
④ 组织病理学观察。术后第 4 周处死 2 只、术后第 10 周全部处死实验动物，取材，进行标本脱钙石蜡切片，行软骨组织的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学（组化）染色。光学显微镜（光镜）下观察其病理组织结构和胶原纤维分布情况，有无炎性细胞浸润。
⑤ 代谢组学检测及分析。在 Bruker AVⅢ600 MHz NMR 谱仪上进行检测，质子共振频率为 600.13 MHz，实验温度为 298 K，检测 CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列[14]。血样每个精确吸取 200 μL 样品和 400 μL 钠离子（Na+）/钾离子（K+）缓冲液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化钠）至 5 mm 核磁管，混匀后进行核磁检测。关节液每个吸取 160 μL 样品和 320 μL Na+/K+ 缓冲液（45 mmol/L，50% D2O，0.8% 氯化钠）至 5 mm 核磁管，不足 160 μL 的以 D2O 补足，混匀后进行核磁检测。检测得到的自由感应衰减信号经傅立叶变换转为 1H-NMR 图谱，使用相关软件将所有样本的 1H-NMR 谱进行分段积分。对所有数据进行归一化处理，将数据导入 SIMCA-P 11.5（瑞典 Umetrics AB 公司）软件包，通过无监督的模式识别法主成分分析（principal components analysis，PCA）进行多维统计分析。通过 7 次循环交叉验证法确定主成分值及验证模型的稳定性和预测性，获得 PCA 模型。进一步采用有监督的模式识别法进行多维统计分析，建立正交信号校正偏最小二乘判别（orthogonal signal correction-partial least squares-discriminant analysis，OSC-PLS-DA）模型。以每种存在差异的代谢产物作为变量，OSC-PLS-DA 模型的散点图分布为结果，用相关系数法进行差异代谢物筛选，利用代谢数据库来分析差异代谢物所参与的代谢途径和代谢通路。A. 差异代谢相对浓度比较：由 SIMCA-P 软件筛选出差异代谢产物后，根据其在 1H NMR 图谱上的峰面积可推算出其相对浓度。相对浓度的升高或者降低反映了相比较的两类标本之间差异代谢产物变化的趋势，通过列表及波形拟合的趋势图可以较为直观地展示出来，选用相应的单维统计分析方法，进一步比较每个差异代谢物在两类标本之间的差异。B. 代谢通路分析：将发现的差异代谢物输入 Metabo-Analyst，系统完成其在 HMDB、PubChem、KEGG 等数据库的编号和信息匹配，然后采用机器算法分析出可能的代谢途径，最后将相关代谢通路按 P 值大小排列显示。
2 结果
2.1 一般情况
所有模型组动物术后 1 h 内苏醒，恢复活动，进食正常。术后切口均无感染，造模区愈合良好。
2.2 大体标本观察
N 组：关节腔无积液，滑膜未见增生，股骨髁及胫骨平台表面光滑，色泽鲜亮，未见软骨磨损及骨赘形成。模型组：左侧关节腔少量积液，颜色清亮，滑膜轻度增生，股骨髁表面较光整，左侧胫骨平台色泽灰暗，表面欠光滑，内侧缘可见骨赘形成。
2.3 影像学表现
N 组：双侧膝关节间隙对称，无狭窄，骨性关节面光滑，未见骨赘形成；脂肪垫清晰，关节周围软组织未见肿胀（图 1a）。模型组：左侧膝关节内侧胫骨平台有增生、稍微变尖，骨赘形成，内侧关节囊肿胀，髌下脂肪垫透亮度减低，关节间隙狭窄（图 1b）。
图1
实验动物双膝关节正侧位 X 线片
a. N 组动物 X 线片，可见关节间隙对称，未见明显狭窄及骨赘形成；b. 模型组动物 X 线片，可见模型侧胫骨平台有增生，骨赘形成，关节间隙变窄
2.4 组织病理学观察
分别进行实验动物关节软骨 HE、甲苯胺蓝及免疫组化染色，光镜下观察到病理组织结构和胶原纤维分布情况，及炎性细胞浸润（图 2）。N 组：双侧关节软骨表面光滑、平整，软骨层次清楚，潮线完整，软骨细胞分布均匀，细胞排列整齐，无簇聚或减少；甲苯胺蓝染色示基质呈均匀的深蓝色，无失染现象。P 组：左侧膝关节软骨光镜下观察到软骨表面变薄、粗糙不规则，可见较小和浅的裂隙，潮线不完整，软骨细胞数量减少，排列紊乱，无细胞聚集现象；甲苯胺蓝染色示基质轻度失染。H 组：左侧软骨组织表面有纤维组织增生，软骨细胞呈散在的点状增生，软骨细胞轮廓模糊，有散在的淋巴细胞和浆细胞，细胞排列紊乱，但层次可分清。3 组标本图形对比观察，HA 组具有一定的软骨修复能力。
图2
光镜下组织病理学表现
2.5 代谢组学分析
2.5.1 血清样本
① 血清 1H-NMR 谱代谢物识别。实验动物 N 组、P 组及 H 组的血清经过磁共振检测得到的 1H-NMR 谱见图 3a，图中横坐标表示化学位移，主要代谢物包括：组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸类；脂肪酸、不饱和脂肪酸等脂质类；葡萄糖等糖类；乳酸、柠檬酸、醋酸等有机酸类；丙酮酸、谷氨酰胺、胆碱等中间代谢产物；高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白类及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶类。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H6 点出现了明显偏离，离散样品会影响模型结构，使模型失真。离散点数量极少，可能由样本采集或数据采集过程中受到污染造成，予以剔除后再次进行分析，离散点对整体分布影响较小，得到如下 PCA 模型（图 3b）。3 组动物的血清代谢物已出现了一定的分离趋势，但还未达到明显区分的目标。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。通过 PCA 模型分析，对血清组的代谢物分布情况有了一个整体的认识，进一步采用有监督的模式识别法进行多维统计分析，并建立 OSC-PLS-DA 模型。根据实验需求，重点进行 P-H 组间模型比较，得到 OSC-PLS-DA 模型（图 3c）。在有监督的 OSC-PLS-DA 模型中，血清中的 P 组代谢物与 H 组代谢物已明显分离。
④ 差异代谢物筛选。血清 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型相关系数图见图 3d，图中远离原点的变量数据即为可能引起组间差异的主要代谢物。
图3
血清样本的 1H-NMR 谱代谢组学分析
a. 血清的 1H-NMR 谱代谢物识别；b、c. 分别为血清 1H-NMR 谱 PCA 散点图和 OSC-PLS-DA 散点图，N 表示健康空白对照组，P 表示 PBS 注射组，H 表示 HA 注射组，横纵坐标表示 2 个主成分；d. 血清 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型的负载权重图，横纵坐标表示 2 个主成分
2.5.2 关节液样本
① 关节液 1H-NMR 谱代谢物识别。实验动物 N 组、P 组及 H 组的关节液经过磁共振检测得到 1H-NMR 谱（图 4a）。主要的代谢物包括：组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸等氨基酸类；脂肪酸、不饱和脂肪酸等脂质类；葡萄糖等糖类；乳酸、柠檬酸、醋酸等有机酸类；丙酮酸、谷氨酰胺、胆碱等中间代谢产物；高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等脂蛋白类以及 N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶等酶类。
② PCA 模型分析。在 PCA 模型中 H2、H9 点出现了明显偏离，离散点数量极少，可能由样本采集或数据采集过程中受到污染造成，予以剔除后再次进行分析，离散点对整体分布影响较小，PCA 散点图如图 4b 示，3 组样品已出现分离趋势，可进行后续 OPLS 分析。
③ OSC-PLS-DA 模型分析。将数据进行正交信号校正处理后，进行 OPLS-DA 分析，见图 4c，可见 3 组样品已达到完全分离。
④ 差异代谢物筛选。关节液1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型相关系数图见图 4d ，图中远离原点的变量数据即为可能引起组间差异的主要代谢物。
图4
关节液样本的1H-NMR 谱代谢组学分析
a. 关节液的 1H-NMR 谱代谢物识别；b、c. 分别为关节液 1H-NMR 谱 PCA 散点图和 OSC-PLS-DA 散点图，N 表示健康空白对照组，P 表示 PBS 注射组，H 表示 HA 注射组，横纵坐标表示 2 个主成分；d. 1H-NMR 谱 OSC-PLS-DA 模型的负载权重图，横纵坐标表示2 个主成分
2.5.3 差异代谢相对浓度比较
血清中亮氨酸、缬氨酸、脂质、赖氨酸、醋酸、谷氨酸、柠檬氨酸、苏氨酸、葡萄糖、不饱和脂肪酸和甲基组氨酸水平 H 组较 P 组均升高，而高密度脂蛋白、乳酸、丙氨酸降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
关节液中亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、醋酸、谷氨酸、乙酰乙酸、柠檬酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及甲酸水平 H 组较 N 组升高，而脂质、乳酸、琥珀酸、肌酸、葡萄糖水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5.4 代谢通路分析
由图 5 分析可发现，产生差异代谢物的可能代谢通路主要是蛋白质的生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸的代谢、三羧酸循环及生物素代谢、糖异生和葡萄糖-丙氨酸循环等。
图5
通过代谢物富集分析发现的相关代谢途径
3 讨论
目前 OA 研究的模型有多种[15-17]，动物模型主要有：自发性模型，即实验动物在无人为干预处理情况下产生，如 STR/ort 小鼠模型、Hartley 豚鼠模型、Bgn-Fbn 双基因敲除小鼠等；诱发性模型，即通过人为有目的地进行处理干预来诱导产生[18-19]，如改变饮食、关节腔注射药物及膝关节固定等；手术方法，如改变关节应力、关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导法及关节切开造模等，其中前交叉韧带、半月板切除、Hulth 法是主要膝 OA 手术造模方式，以 Hulth 法建模最为经典[20]。本研究根据实验设计和实验条件，选择兔模型，兔膝关节组织结构与人较类似，其 OA 模型的软骨生化指标与人类也相近。
HA 是体内重要的生理活性物质，是由 2 000～25 000 个 β-N-乙酞氨基葡糖和 D-葡糖醛酸单糖重复连接而成的链状聚合物[21]。正常关节滑液具有一定的黏弹性，对关节有屏障保护及润滑减震等作用，对于维持膝关节软骨面的稳定具有重要意义。OA 关节中滑液的黏弹性减少主要是由于关节滑液中 HA 浓度降低所致。目前关节腔注射 HA 治疗 OA 己被广泛应用。外源性 HA 的生理作用主要是减震、保护软骨、抑制软骨细胞丢失、减少 OA 中炎症细胞。据本动物实验观察，H 组对兔膝骨关节软骨损伤的疗效优于 P 组，但对半月板和滑膜无明确的作用。Pham 等[22]实验表明，关节腔注射 HA 能补充外源性 HA 并刺激内源性 HA 分泌，恢复关节润滑及改善炎症反应，促进关节软骨修复，改善关节功能。HA 膝关节腔注射是目前治疗轻中度 OA 的有效药物，应结合个体化治疗方案进行选择。
目前 OA 的病因和发病机制尚不清楚，相关因素主要包括外伤、肥胖、炎症、遗传、内分泌异常、气候、肌肉衰弱、关节松弛等，此外，与细胞因子、生长因子、免疫及代谢因素也有关[23-25]。本研究从代谢水平分析了 HA 治疗 OA 的作用机制，主要与活化蛋白质代谢、脂代谢和能量代谢等途径有关。软骨细胞是驻留在关节软骨内的唯一细胞，负责维持基质合成代谢和分解代谢之间的稳态平衡[26-27]。软骨细胞功能障碍和活力丧失会导致进行性软骨损伤[28]，进而发展为 OA。退化的软骨细胞表现出合成代谢活性降低和分解代谢活性增加，从而损害软骨细胞外基质完整性[29-30]。有研究表明，OA 会改变能量代谢，包括糖酵解和氧化磷酸化之间的平衡[31]。OA 发生过程中软骨细胞的肥大变化可能是由糖酵解减少和乳酸积累造成。关节软骨细胞中腺苷酸激活蛋白激酶活性降低有可能通过促进基质分解代谢破坏软骨稳态，改变能量代谢，从而促进 OA 的发展[32]。氨基酸的代谢改变与 OA 的发病机制和炎症改变有关，OA 发生过程中的外周伤害感受转导可能由谷氨酸和花生四烯酸衍生的炎症介质发生，代谢异常导致了 OA 关节中解剖学和生理学的变化[33-36]。支链氨基酸是构成骨骼肌蛋白质约 1/3 的必需氨基酸，是能量代谢的重要燃料。研究发现，在膝关节 OA 患者中，支链氨基酸与组氨酸的比例相较于正常组更高，这一代谢比例有望在未来成为监测 OA 进展的有效标志[37-39]。近年来有研究表明，OA 与以血脂异常为特征的代谢综合征有关，高胆固醇血症与 OA 之间存在关联[40-41]。胆固醇是软骨细胞生物学中的一种重要信号，可通过孤核受体 Ror-α 的表达刺激软骨细胞肥大[42]。Huang 等[43]最近提出，脂质多糖介导的炎症可能解释肥胖、代谢综合征和 OA 之间的关联。因此，脂代谢在 OA 的发生与进展中有着重要作用。
本研究基于 1H-NMR 平台，通过检测生物体液中的内源性代谢产物浓度，结合化学信息学分析方法来确定生物体在生理病理状态或者给药前后代谢物成分的变化模式，结果显示 HA 对 OA 的作用主要与蛋白质代谢、脂代谢和能量代谢等代谢途径的激活有关，为研究 HA 治疗膝 OA 的具体机制提供了新思路和新依据。
