引用本文： 笪琳萃, 龚梅, 王旻, 解慧琪. 新型交联方法在生物衍生材料中的应用进展. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 777-783. doi: 10.7507/1002-1892.20140172 复制
对于因先天缺失、运动损伤、外伤、疾病等所致的组织损伤或缺损，组织工程技术已逐渐成为重要修复手段[1]。该技术将来还可能为目前尚无法治愈的疾病和组织变性提供解决方案，对人类健康具有深远影响。目前，生物衍生材料在组织工程中的研究和应用最为广泛[2]，包括天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、同种异体组织、胶原、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐等[3]。
生物衍生材料因具有良好的生物相容性、易降解且降解产物无毒副作用、炎性反应低、可诱导和促进组织结构再生和修复等特点，常作为生物支架促进组织和器官重塑[2-5]。然而，生物衍生材料在提取过程中常需使用中性盐、酸、碱或蛋白酶等，会破坏其天然交联网络结构，导致热稳定性、机械强度和耐水性能无法满足应用需要[6]。同时直接提取的生物衍生材料存在易降解失效、有结构功能障碍及诱发免疫反应等缺陷，也限制了其临床应用[7-8]。为解决上述问题，国内外学者们对生物衍生材料进行了交联或表面处理的研究，以制备出更适合临床应用的组织工程产品[6, 9]。
传统的合成交联剂，如戊二醛、多聚环氧化合物、碳二亚胺等，虽可增强支架材料的机械性能，但存在长期稳定性低、细胞毒性较强、反应速率难以控制，或中间产物不稳定等缺陷[7, 10]。近年来，研究者们开始尝试其他交联方法，如光化学交联、酶交联以及使用生物交联剂等对材料进行改性。现对新型交联方法在生物衍生材料研究领域的应用进展进行综述，并对各种交联方法的交联特点进行讨论。
1 化学交联法
化学交联法是指在光、热、高能辐射、机械力、超声波和交联剂等的作用下，使高分子化合物间通过化学键联结而形成交联网络的方法。生物衍生材料中的生物大分子也可通过该方法发生交联反应。
1.1 光氧化交联法
ECM或纯胶原中的某些氨基酸能在光敏剂存在情况下，通过光照射（平常只限于紫外线及可见光谱的波长，即200～800 nm）被特异地氧化，发生交联反应。激活的光敏剂可通过电子转移或夺氢反应形成游离自由基，这些游离自由基既可直接与目标分子发生共价交联，也可将能量转移给氧分子生成单重态氧，进而氧化周围的目标分子[11]。该法特点是：① 可通过控制激光能量、功率密度、能量密度以及光敏剂浓度等参数来控制交联反应进程；② 具有一定的空间选择性；③ 交联时间短，且交联效率高达80%；④ 与其他交联方法相比毒性较小[11]。蛋白质中的色氨酸、酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等均可发生光氧化反应。
Ramesh等[12]将人隐静脉脱细胞后，以亚甲蓝为光敏感剂，紫外光照射下进行光氧化交联，得到了熔融温度为126℃、焓值为183.5 J/g、机械强度为250%的支架材料；他们将BALB/c 3T3细胞接种于支架材料上未见形态异常，接种7 d开始细胞明显增殖，表明其细胞毒性小；将交联的脱细胞人隐静脉植入雄性绵羊左侧颈内静脉，术后不进行抗凝治疗，术后24周形成具有平滑肌和完整内皮的血管结构，肉眼未见血栓形成，管腔直径保持不变，说明其能诱导组织再生且具有良好的血液相容性和组织相容性。因此，Ramesh等认为任意脱细胞的人体静脉均可通过光氧化交联法制备小尺寸的血管移植物。Lü等[13]将光氧化交联的脱细胞牛颈静脉导管植入犬体内，重建了肺动脉和右心室的连接；术后6个月，交联后的支架材料表现出良好的血流动力学性能和抗钙化能力，且其血管壁和瓣膜仍较柔软、光滑。
然而，材料是否能发生光氧化交联反应取决于其化学和光学特性，有些生物衍生材料如富含蛋白多糖的组织就不适合采用该法交联。Chan[11]指出，只有既含有能与光敏剂反应的官能团，但自身光学性能又不影响光敏剂对光吸收的生物衍生材料才适合用该法交联。
1.2 高能辐照交联法
高能辐照交联法是指通过电子束照射、γ光子照射等高能辐照使高分子链段发生交联的过程。其交联原理是：高分子溶液在电子束或γ光子照射下产生自由基，然后不同链段上的自由基重新结合形成共价键，达到交联目的[14-15]。该法的交联过程可控性高、无毒性添加剂，且消毒过程可与交联过程同时进行[10, 16]。但是，高能辐照产生的自由基可能会破坏支架材料中的生物活性成分，所以含有生长因子等活性物质的生物衍生材料，如脱细胞猪小肠黏膜下层不适合采用该法交联[14]。
Zhou等[17]发现，将明胶、羧甲基壳聚糖和β-磷酸三钙的混合溶液先超声20 min，再在剂量为30 kGy条件下辐照，可获得β-磷酸三钙分布均一、孔径均匀且相互连通、力学性能和降解时间适宜的多孔材料；进一步将材料植入比格犬下颌骨，术后4周未见伤口感染、坏死、水肿以及严重炎性反应，micro-CT可观察到大量骨组织再生，证实其具有良好的生物相容性。Yang等[10]利用γ光子照射制备了不同配比的明胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，研究其应用于伤口愈合的可能性。结果表明，该方法制备的水凝胶孔隙均匀且相互贯通，细胞毒性为0级，且NIH 3T3成纤维细胞能在凝胶上生长良好，该凝胶还具有较好的保水性能（10～700 g/ g干胶）、与软组织相近的压缩模量以及优良可控的生物降解性能。Huang等[15]还将羧甲基壳聚糖/明胶比例分别为10∶0、6∶4、4∶6、0∶10的水凝胶进行辐照交联，结果发现，交联后4∶6组的压缩模量为70 kPa，显示了良好的机械性能；同时以不含水凝胶的透明薄膜敷料作为空白对照，将各组材料分别植入全层皮肤缺损创面的SD大鼠模型，10∶0组和6∶4组水凝胶均在术后3周内完全降解，0∶10组几乎未降解，只有4∶6组水凝胶在术后3周降解了50%，降解性能最佳；术后3、6 d，4∶6组水凝胶的肉芽组织厚于空白对照组（P＜ 0.05）；术后9、12、15 d，4∶6组水凝胶的伤口愈合率显著高于空白对照组（P＜ 0.05）。由此可见，交联后的凝胶材料具有良好的生物相容性，可通过诱导肉芽组织生长和加速再上皮化来促进伤口愈合。
1.3 生物交联剂
生物交联剂是指来源于生物材料、分子中具有2 个或2个以上活性基团，并且可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的试剂。常见生物交联剂有去甲二氢愈创木酸、京尼平、多醛基葡聚糖、褐藻胶醛等。
1.3.1 去甲二氢愈创木酸
去甲二氢愈创木酸是从绿檀等常青灌木中提取的天然产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、消炎等多种生物活性[9]。其交联机制是：去甲二氢愈创木酸末端的儿茶酚基团氧化为有活性的醌基，氧化后的单体既可自身聚合生成聚去甲二氢愈创木酸，也可与蛋白质的自由氨基通过Michael加成反应形成共价键，从而稳定生物衍生材料结构，改善其理化性能[18-20]。
有研究表明，去甲二氢愈创木酸可作为一种生物相容性好的低毒交联剂交联胶原蛋白。Koob等[18]利用去甲二氢愈创木酸交联牛腱Ⅰ型胶原，交联后Ⅰ型胶原纤维的拉伸强度和刚度随交联剂用量的增加而增加，且极限抗张强度和弹性模量与天然肌腱相当。Koob等[19]还发现经去甲二氢愈创木酸交联后的明胶水凝胶热稳定性从低于37℃增加至80℃以上，且不再溶于离液剂。Lü等[7]发现去甲二氢愈创木酸交联后的脱细胞心脏瓣膜最大拉伸强度达（17.2 ± 1.7） MPa，是未交联组的2倍，且高于戊二醛组；最高弹性模量为（21.1 ± 2.6）MPa，与戊二醛组基本一致；交联的瓣膜支架于PBS中浸泡120 d后，其多孔结构和最大拉伸强度基本保持不变；扫描电镜结果显示，内皮细胞能在交联的支架材料表面上黏附并保持正常形态。这些结果表明，经去甲二氢愈创木酸交联后的瓣膜支架细胞相容性好，且力学强度、抗酶解性和储存稳定性得到明显提高。Ju等[21-22]发现去甲二氢愈创木酸交联胶原支架可提高植入式葡萄糖传感器的生物相容性。他们将牛腱Ⅰ型胶原包被于葡萄糖传感器后分别用去甲二氢愈创木酸和戊二醛处理，得到交联的胶原支架[21]。然后将其植入大鼠皮下组织，术后4周未见物理变形，炎性反应小；虽然去甲二氢愈创木酸处理组传感器的灵敏度稍低于无支架的对照组传感器，但比单纯戊二醛处理组更为理想[22]。由此可见，去甲二氢愈创木酸交联的胶原支架可减少植入物的异物反应，从而延长其使用寿命。
1.3.2 京尼平
京尼平是由茜草科植物栀子中提取的环烯醚萜类化合物，也可由京尼平苷酶解得到[23]，分子式为C11H14O5[24]。其富含的活性羟基和羧基能与含有自由氨基的生物衍生材料发生反应[25-26]。其交联机制是：① 京尼平上的烯碳原子受到氨基的亲核进攻而开环，生成杂环胺化合物；② 京尼平上的酯键与氨基发生取代反应，形成分子内或分子间的聚合环状结构[27-28]。
京尼平已被广泛应用于ECM、丝素蛋白、明胶和壳聚糖等生物衍生材料的交联制备工艺。Koch等[8]采用京尼平、戊二醛、碳二亚胺交联管状脱细胞猪食管支架，并将其植入SD大鼠模型；仅京尼平组的巨噬细胞浸润程度较轻，且促进炎性反应的CD163型巨噬细胞显著减少、皮下组织的成纤维细胞比例增加，说明京尼平可有效抑制移植排斥反应和炎性反应。Silva等[29]利用京尼平交联壳聚糖和蚕丝素蛋白，冻干后获得了结构规整的壳聚糖/丝素蛋白海绵；交联的海绵上细胞存活率接近100%，显示极低的细胞毒性；并能促进ATDC5细胞的黏附、增殖及软骨样ECM分泌，可用作软骨组织工程的支架材料。Yan等[30]通过对京尼平交联的胶原/壳聚糖多孔支架材料的研究发现，京尼平交联可抑制Ⅰ型胶原酶的酶解，有效提升支架材料的生物稳定性，而且支架材料的弹性模量与京尼平的使用浓度成正相关。Jin等[31]还发现京尼平交联的猪心包断裂伸长率与拉伸载荷显著增加，拉伸强度高于碳二亚胺交联组而低于未交联组；此外，京尼平交联的支架材料还有助于受损组织功能的恢复。Chen等[32]用京尼平交联的明胶导管成功修复了10 mm长大鼠坐骨神经缺损；组织学观察显示，大量雪旺细胞包围的再生无髓神经纤维在术后6周桥接缺损区域；肌肉动作电位曲线的峰波幅和波面积在术后6周和8周均明显增加，说明神经功能得到一定程度恢复。
但是，栀子果实中的京尼平成分仅占0.005%～ 0.01%，京尼平苷中也只占3.06%～4.12%，尽管已有成熟的提取方法，但提取过程仍相对复杂[33]。有研究表明，京尼平可能会影响细胞的基因表达，且其低毒性具有一定种属和细胞特异性[34]。京尼平在水溶液中不稳定，且交联产物颜色深、交联时间较长[35]。此外，市售的京尼平价格为150～200元/g，与其他交联剂相比较昂贵[34]。上述不足在一定程度上限制了京尼平的广泛应用。
1.3.3 氧化海藻酸钠
海藻酸钠的羟基基团可被高碘酸钠氧化，生成氧化海藻酸钠。它属于多官能团的高分子交联剂，含有以醛基为主的多种可供交联的官能团，是有效的蛋白质或亚基交联剂[36-37]。氧化海藻酸钠的价格相对低廉，氧化度＜ 50%时的细胞毒性为0～2级，氧化度越高其细胞毒性越强[37]。其交联机制[36]与戊二醛的交联机制相似，即氧化海藻酸钠的醛基在水中与富含氨基、羟基的分子（如蛋白质、含胺多糖等）反应，形成Schiff碱后，再与其他分子反应形成立体网状结构。
Balakrishnan等[38]在弱碱性条件下，利用氧化海藻酸钠交联明胶，获得了可注射的降解型生物支架材料；胶凝时间一般随氧化海藻酸钠、明胶以及硼砂的浓度增加而减少，组织的交联程度随藻酸盐的氧化程度增加而增加，而溶胀比和溶胀程度则随氧化程度的增加而降低；37℃下用交联材料浸提液孵育L929小鼠成纤维细胞24 h，93%的细胞代谢活跃，与空白对照组（含血清的DMEM细胞）无显著差异，显示极低的细胞毒性。Xu等[36]采用氧化海藻酸钠、戊二醛和多聚环氧化合物3种交联剂分别处理脱细胞猪主动脉，结果显示3组材料的交联系数均随交联时间增加而显著提高，反应7 h后达峰值；氧化海藻酸钠组的交联速率和交联指数最佳，其机械性能与戊二醛组相当并优于多聚环氧化合物；而且氧化海藻酸钠交联组的自然结构保存完好，细胞毒性显著低于戊二醛和多聚环氧化合物交联的组织。李莉等[5]还发现与京尼平相比，氧化海藻酸钠处理血管组织，其交联时间更短、交联速率更快且交联程度更佳；交联后的组织力学性能更接近于新鲜组织，且细胞毒性和细胞黏附能力均与京尼平相似。因而，可以认为氧化海藻酸钠是一种有效的生物组织交联剂。
1.3.4 多醛基葡聚糖
多醛基葡聚糖（氧化葡聚糖）是葡聚糖适度氧化生成的高分子葡萄糖聚合物，它能与具有游离氨基的大分子物质发生交联反应，交联机制与氧化海藻酸钠相似[39]。如明胶的赖氨酸和羟赖氨酸的氨基残基就可与多醛基葡聚糖反应生成Schiff碱。相同温度、时间下，葡聚糖的氧化度与氧化剂高碘酸钠的浓度相关。而葡聚糖的氧化度越高，醛基的暴露程度就越大，多醛基葡聚糖的交联度也随之增高。
多醛基葡聚糖交联生物衍生材料的优点有交联效率高、机械性能好以及炎性反应弱等，主要不足是细胞毒性相比其他生物交联剂较强。Draye等[40]制备了多醛基葡聚糖交联的明胶伤口敷料，体外实验结果表明，交联敷料的细胞毒性在可接受范围内；将敷料植入小鼠皮下只引起较弱且逐渐消退的炎性反应，未见细胞变性或异常的细胞形貌，说明其具有良好的生物相容性。Mateo等[41]还发现用多醛基葡聚糖交联得到的固定化腈水解酶的活力回收可达50%～60%，而戊二醛交联则导致酶完全失活；而且多醛基葡聚糖固定的青霉素G酰化酶的活力回收可达到90%。这可能是由于多醛基葡聚糖的大分子结构不能穿透蛋白活性位点，因而不能与催化必需的氨基酸残基反应。同理，多醛基葡聚糖交联的支架材料上的某些活性成分也可能不会被破坏，但目前未见相关研究报道。
此外，可发生化学交联的生物交联剂还有橄榄苦苷[42]、藻酸[43]以及植酸[44]等。研究表明，它们均具有良好的细胞相容性和血液相容性，交联产物具有理想的机械性能。因此，它们也适合作为交联剂应用于生物医学领域。
2 物理交联法
物理交联的生物衍生材料是指由于分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用等存在而形成的网络结构。通过离子的相互作用力交联是典型的物理交联。聚电解质如壳聚糖、海藻酸盐等，可与带相反电荷的多价离子或聚电解质通过离子的相互作用而键合，形成物理交联型水凝胶[45]。
Nie等[46]使用Na+交联魔芋葡甘聚糖/壳聚糖复合材料，提高其生物稳定性，并将制得的支架材料用于骨组织修复。Kuo等[47]将D-葡萄糖酸-δ-内酯作为Ca2+的载体，制备了凝胶速率可控、结构均一的海藻酸盐水凝胶，该凝胶的机械性能取决于交联时各组分的配比；他们发现，凝胶速率低的水凝胶更加均一且机械强度更高；凝胶的压缩模量和强度随藻酸盐浓度、总钙含量、藻酸盐的相对分子质量和古洛糖醛酸含量增加而增加。值得注意的是，Ca2+与海藻酸盐的交联反应是可逆的。Gillette等[48]发现可将柠檬酸钠作为Ca2+螯合剂夺取海藻酸盐交联网络中的Ca2+，使其发生交联反应的逆反应。他们利用这一特性制备了胶原/海藻酸盐双组分水凝胶，通过反复改变海藻酸盐的交联程度研究三维ECM的动态变化对细胞行为的影响。两种带异种电荷的聚电解质也可通过离子的相互作用交联[49]，其结合强度高于氢键、范德华力等次级键，且具有可逆性，安全隐患较小，但是聚电解质的选择难度较高[50]。
通过氢键进行交联也是物理交联法的一个分支，如原花青素分子中的酚羟基可与蛋白肽链中的酰胺基等基团形成氢键，达到交联改性的目的[51]。研究表明[52]，原花青素交联的材料力学性能、组织变性温度、抗酶解能力等均有所改善。而且，He等[6]通过傅里叶变换红外光谱、原子力显微镜等测试分析，发现原花青素交联处理的胶原蛋白三螺旋构象并未破坏，且改善了胶原蛋白膜的疏水性能和热稳定性能。槲皮素分子中的酚羟基也可与生物衍生材料中蛋白质的羰基、羟基等自由基团形成氢键交联[53]。Zhai等[53]评价了槲皮素交联的脱细胞猪主动脉瓣，结果表明槲皮素交联的主动脉瓣不仅抗钙化、抗中性粒细胞胶原酶酶解，而且其拉伸强度优于戊二醛交联的主动脉瓣，在D-Hank溶液浸泡30 d后其拉伸强度和弹性无明显损失。槲皮素对血管内皮细胞的毒性阈值为1 μg/mL，其细胞毒性比戊二醛低100倍。
此外，温敏凝胶如壳聚糖则可在接近低临界溶解温度时因分子运动加剧，分子链相互缠绕而发生液态和凝胶态的相互转变[45, 50, 54]。但是，在物理交联型水凝胶中，分子间的缠绕、疏水相互作用或离子键合区域也会形成簇团结构，因此造成凝胶的不均匀性，同时自由链端和链环也会产生瞬时的网络缺陷[45]。
3 生物交联法
一些酶如转谷氨酰胺酶[55]、辣根过氧化物酶[56]、酪氨酸酶[57-58]、赖氨酰氧化酶[59]等可在特定的pH值和温度下催化生物衍生材料发生交联反应[60]，这种交联方法称为酶交联法。它具有酶催化反应的所有优点，如高效、高选择性、交联速率可控、反应条件温和等，还可避免有毒交联剂的带入[61]。但是其高选择性也在一定程度上限制了在生物衍生材料交联改性中的应用，如微生物转谷氨酰胺酶可以交联Ⅰ型胶原，却无法交联天然胶原，如牛皮胶原蛋白粉[62]。
转谷氨酰胺酶又称谷氨酰胺胺酶，参与细胞黏附、分化、死亡和维护ECM稳定性等多种生理功能，是一种依赖Ca2+催化酰基转移反应的酶[61]。它以肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基的供体，以多肽链中赖氨酰残基ε-氨基作为酰基的受体，形成蛋白质分子内和分子间的酰胺键，使蛋白质分子发生交联，维护组织的稳定性，提高材料的机械性能[61]。转谷氨酰胺酶家族成员--组织型转谷氨酰胺酶对创伤愈合有促进作用，组织损伤区域积累的组织型转谷氨酰胺酶可交联ECM中某些成分，尤其是胶原蛋白和纤连蛋白，加速其沉积速率，还可通过影响TGF-β1的激活来减轻炎性反应，因此它本身可能就是一种促进伤口愈合、防止瘢痕形成的治疗方法[63]。
Westhaus等[64]利用转谷氨酰胺酶的Ca2+依赖型催化机制，设计了原位交联体系。他将脂质体作为Ca2+的载体，将其与纤维蛋白原以及Ca2+依赖型转谷氨酰胺酶制备成液态混合物，该液态混合物可在37℃迅速凝胶化，其原理是脂质体在37℃时不稳定，释放的Ca2+激活转谷氨酰胺酶；这种凝胶系统可通过注射方式修复受损组织。Chau等[65]用组织型转谷氨酰胺酶和微生物转谷氨酰胺酶处理Ⅰ型胶原，改善胶原的细胞相容性。与未处理的胶原相比，人成骨细胞和人包皮成纤维细胞均能在支架材料上更好黏附、铺展和分化；人成骨细胞的ALP活性以及骨桥蛋白表达量显著增高，且随着转谷氨酰胺酶的浓度增加而增加；此外，酶交联还能有效抑制细胞内源蛋白酶的酶解。Lee等[66]还发现用转谷氨酰胺酶处理的Ⅰ型胶原刚度增加，而材料交联前后的孔隙率和孔径无变化。
此外，酶交联法还可与物理交联法联合使用。Wen等[67]先利用转谷氨酰胺酶交联明胶/海藻酸盐中的明胶成分，再利用Ca2+交联海藻酸盐成分，制备了具有互穿聚合物网络结构的材料。
4 结论与展望
近年来，生物衍生材料的研发取得了很大进展，其中新发现的可用于材料制备的交联剂和交联方法为生物衍生材料研究作出了巨大贡献。各种交联方法均有一定局限性，我们可以针对特定的生物衍生材料选择合适交联方法，使其在保持优良生物相容性和组织修复能力的同时，获得良好的机械性能、抗降解性能等。如含有不稳定生物活性物质或活细胞的生物衍生材料往往要求温和的反应条件且无有机溶剂、交联剂残留；为避免残留的交联剂使材料中活性物质变性，保证水凝胶所包埋物质的完整性，我们可采用酶交联或物理交联法如离子交联对材料进行交联改性。对于双组分或多组分的生物衍生复合材料，可能需联合使用两种或多种交联方法。
虽然这些交联方法仍存在不足，但是它们交联的生物衍生材料的细胞毒性均较传统化学交联剂低，生物相容性好，且显著改善了材料的各项性能，如力学性能和降解性能等。它们为生物衍生材料的交联改性提供了更多选择，有助于得到更适用于临床的组织工程产品。相信在国内外研究者的共同努力下，随着各种交联机制研究的不断深入和交联方法的不断完善，有望更精确控制材料的交联度，更大程度降低细胞毒性和免疫原性，获得更适合临床应用的生物衍生材料，进一步推动转化医学发展。
对于因先天缺失、运动损伤、外伤、疾病等所致的组织损伤或缺损，组织工程技术已逐渐成为重要修复手段[1]。该技术将来还可能为目前尚无法治愈的疾病和组织变性提供解决方案，对人类健康具有深远影响。目前，生物衍生材料在组织工程中的研究和应用最为广泛[2]，包括天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、同种异体组织、胶原、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐等[3]。
生物衍生材料因具有良好的生物相容性、易降解且降解产物无毒副作用、炎性反应低、可诱导和促进组织结构再生和修复等特点，常作为生物支架促进组织和器官重塑[2-5]。然而，生物衍生材料在提取过程中常需使用中性盐、酸、碱或蛋白酶等，会破坏其天然交联网络结构，导致热稳定性、机械强度和耐水性能无法满足应用需要[6]。同时直接提取的生物衍生材料存在易降解失效、有结构功能障碍及诱发免疫反应等缺陷，也限制了其临床应用[7-8]。为解决上述问题，国内外学者们对生物衍生材料进行了交联或表面处理的研究，以制备出更适合临床应用的组织工程产品[6, 9]。
传统的合成交联剂，如戊二醛、多聚环氧化合物、碳二亚胺等，虽可增强支架材料的机械性能，但存在长期稳定性低、细胞毒性较强、反应速率难以控制，或中间产物不稳定等缺陷[7, 10]。近年来，研究者们开始尝试其他交联方法，如光化学交联、酶交联以及使用生物交联剂等对材料进行改性。现对新型交联方法在生物衍生材料研究领域的应用进展进行综述，并对各种交联方法的交联特点进行讨论。
1 化学交联法
化学交联法是指在光、热、高能辐射、机械力、超声波和交联剂等的作用下，使高分子化合物间通过化学键联结而形成交联网络的方法。生物衍生材料中的生物大分子也可通过该方法发生交联反应。
1.1 光氧化交联法
ECM或纯胶原中的某些氨基酸能在光敏剂存在情况下，通过光照射（平常只限于紫外线及可见光谱的波长，即200～800 nm）被特异地氧化，发生交联反应。激活的光敏剂可通过电子转移或夺氢反应形成游离自由基，这些游离自由基既可直接与目标分子发生共价交联，也可将能量转移给氧分子生成单重态氧，进而氧化周围的目标分子[11]。该法特点是：① 可通过控制激光能量、功率密度、能量密度以及光敏剂浓度等参数来控制交联反应进程；② 具有一定的空间选择性；③ 交联时间短，且交联效率高达80%；④ 与其他交联方法相比毒性较小[11]。蛋白质中的色氨酸、酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等均可发生光氧化反应。
Ramesh等[12]将人隐静脉脱细胞后，以亚甲蓝为光敏感剂，紫外光照射下进行光氧化交联，得到了熔融温度为126℃、焓值为183.5 J/g、机械强度为250%的支架材料；他们将BALB/c 3T3细胞接种于支架材料上未见形态异常，接种7 d开始细胞明显增殖，表明其细胞毒性小；将交联的脱细胞人隐静脉植入雄性绵羊左侧颈内静脉，术后不进行抗凝治疗，术后24周形成具有平滑肌和完整内皮的血管结构，肉眼未见血栓形成，管腔直径保持不变，说明其能诱导组织再生且具有良好的血液相容性和组织相容性。因此，Ramesh等认为任意脱细胞的人体静脉均可通过光氧化交联法制备小尺寸的血管移植物。Lü等[13]将光氧化交联的脱细胞牛颈静脉导管植入犬体内，重建了肺动脉和右心室的连接；术后6个月，交联后的支架材料表现出良好的血流动力学性能和抗钙化能力，且其血管壁和瓣膜仍较柔软、光滑。
然而，材料是否能发生光氧化交联反应取决于其化学和光学特性，有些生物衍生材料如富含蛋白多糖的组织就不适合采用该法交联。Chan[11]指出，只有既含有能与光敏剂反应的官能团，但自身光学性能又不影响光敏剂对光吸收的生物衍生材料才适合用该法交联。
1.2 高能辐照交联法
高能辐照交联法是指通过电子束照射、γ光子照射等高能辐照使高分子链段发生交联的过程。其交联原理是：高分子溶液在电子束或γ光子照射下产生自由基，然后不同链段上的自由基重新结合形成共价键，达到交联目的[14-15]。该法的交联过程可控性高、无毒性添加剂，且消毒过程可与交联过程同时进行[10, 16]。但是，高能辐照产生的自由基可能会破坏支架材料中的生物活性成分，所以含有生长因子等活性物质的生物衍生材料，如脱细胞猪小肠黏膜下层不适合采用该法交联[14]。
Zhou等[17]发现，将明胶、羧甲基壳聚糖和β-磷酸三钙的混合溶液先超声20 min，再在剂量为30 kGy条件下辐照，可获得β-磷酸三钙分布均一、孔径均匀且相互连通、力学性能和降解时间适宜的多孔材料；进一步将材料植入比格犬下颌骨，术后4周未见伤口感染、坏死、水肿以及严重炎性反应，micro-CT可观察到大量骨组织再生，证实其具有良好的生物相容性。Yang等[10]利用γ光子照射制备了不同配比的明胶/羧甲基壳聚糖水凝胶，研究其应用于伤口愈合的可能性。结果表明，该方法制备的水凝胶孔隙均匀且相互贯通，细胞毒性为0级，且NIH 3T3成纤维细胞能在凝胶上生长良好，该凝胶还具有较好的保水性能（10～700 g/ g干胶）、与软组织相近的压缩模量以及优良可控的生物降解性能。Huang等[15]还将羧甲基壳聚糖/明胶比例分别为10∶0、6∶4、4∶6、0∶10的水凝胶进行辐照交联，结果发现，交联后4∶6组的压缩模量为70 kPa，显示了良好的机械性能；同时以不含水凝胶的透明薄膜敷料作为空白对照，将各组材料分别植入全层皮肤缺损创面的SD大鼠模型，10∶0组和6∶4组水凝胶均在术后3周内完全降解，0∶10组几乎未降解，只有4∶6组水凝胶在术后3周降解了50%，降解性能最佳；术后3、6 d，4∶6组水凝胶的肉芽组织厚于空白对照组（P＜ 0.05）；术后9、12、15 d，4∶6组水凝胶的伤口愈合率显著高于空白对照组（P＜ 0.05）。由此可见，交联后的凝胶材料具有良好的生物相容性，可通过诱导肉芽组织生长和加速再上皮化来促进伤口愈合。
1.3 生物交联剂
生物交联剂是指来源于生物材料、分子中具有2 个或2个以上活性基团，并且可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的试剂。常见生物交联剂有去甲二氢愈创木酸、京尼平、多醛基葡聚糖、褐藻胶醛等。
1.3.1 去甲二氢愈创木酸
去甲二氢愈创木酸是从绿檀等常青灌木中提取的天然产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、消炎等多种生物活性[9]。其交联机制是：去甲二氢愈创木酸末端的儿茶酚基团氧化为有活性的醌基，氧化后的单体既可自身聚合生成聚去甲二氢愈创木酸，也可与蛋白质的自由氨基通过Michael加成反应形成共价键，从而稳定生物衍生材料结构，改善其理化性能[18-20]。
有研究表明，去甲二氢愈创木酸可作为一种生物相容性好的低毒交联剂交联胶原蛋白。Koob等[18]利用去甲二氢愈创木酸交联牛腱Ⅰ型胶原，交联后Ⅰ型胶原纤维的拉伸强度和刚度随交联剂用量的增加而增加，且极限抗张强度和弹性模量与天然肌腱相当。Koob等[19]还发现经去甲二氢愈创木酸交联后的明胶水凝胶热稳定性从低于37℃增加至80℃以上，且不再溶于离液剂。Lü等[7]发现去甲二氢愈创木酸交联后的脱细胞心脏瓣膜最大拉伸强度达（17.2 ± 1.7） MPa，是未交联组的2倍，且高于戊二醛组；最高弹性模量为（21.1 ± 2.6）MPa，与戊二醛组基本一致；交联的瓣膜支架于PBS中浸泡120 d后，其多孔结构和最大拉伸强度基本保持不变；扫描电镜结果显示，内皮细胞能在交联的支架材料表面上黏附并保持正常形态。这些结果表明，经去甲二氢愈创木酸交联后的瓣膜支架细胞相容性好，且力学强度、抗酶解性和储存稳定性得到明显提高。Ju等[21-22]发现去甲二氢愈创木酸交联胶原支架可提高植入式葡萄糖传感器的生物相容性。他们将牛腱Ⅰ型胶原包被于葡萄糖传感器后分别用去甲二氢愈创木酸和戊二醛处理，得到交联的胶原支架[21]。然后将其植入大鼠皮下组织，术后4周未见物理变形，炎性反应小；虽然去甲二氢愈创木酸处理组传感器的灵敏度稍低于无支架的对照组传感器，但比单纯戊二醛处理组更为理想[22]。由此可见，去甲二氢愈创木酸交联的胶原支架可减少植入物的异物反应，从而延长其使用寿命。
1.3.2 京尼平
京尼平是由茜草科植物栀子中提取的环烯醚萜类化合物，也可由京尼平苷酶解得到[23]，分子式为C11H14O5[24]。其富含的活性羟基和羧基能与含有自由氨基的生物衍生材料发生反应[25-26]。其交联机制是：① 京尼平上的烯碳原子受到氨基的亲核进攻而开环，生成杂环胺化合物；② 京尼平上的酯键与氨基发生取代反应，形成分子内或分子间的聚合环状结构[27-28]。
京尼平已被广泛应用于ECM、丝素蛋白、明胶和壳聚糖等生物衍生材料的交联制备工艺。Koch等[8]采用京尼平、戊二醛、碳二亚胺交联管状脱细胞猪食管支架，并将其植入SD大鼠模型；仅京尼平组的巨噬细胞浸润程度较轻，且促进炎性反应的CD163型巨噬细胞显著减少、皮下组织的成纤维细胞比例增加，说明京尼平可有效抑制移植排斥反应和炎性反应。Silva等[29]利用京尼平交联壳聚糖和蚕丝素蛋白，冻干后获得了结构规整的壳聚糖/丝素蛋白海绵；交联的海绵上细胞存活率接近100%，显示极低的细胞毒性；并能促进ATDC5细胞的黏附、增殖及软骨样ECM分泌，可用作软骨组织工程的支架材料。Yan等[30]通过对京尼平交联的胶原/壳聚糖多孔支架材料的研究发现，京尼平交联可抑制Ⅰ型胶原酶的酶解，有效提升支架材料的生物稳定性，而且支架材料的弹性模量与京尼平的使用浓度成正相关。Jin等[31]还发现京尼平交联的猪心包断裂伸长率与拉伸载荷显著增加，拉伸强度高于碳二亚胺交联组而低于未交联组；此外，京尼平交联的支架材料还有助于受损组织功能的恢复。Chen等[32]用京尼平交联的明胶导管成功修复了10 mm长大鼠坐骨神经缺损；组织学观察显示，大量雪旺细胞包围的再生无髓神经纤维在术后6周桥接缺损区域；肌肉动作电位曲线的峰波幅和波面积在术后6周和8周均明显增加，说明神经功能得到一定程度恢复。
但是，栀子果实中的京尼平成分仅占0.005%～ 0.01%，京尼平苷中也只占3.06%～4.12%，尽管已有成熟的提取方法，但提取过程仍相对复杂[33]。有研究表明，京尼平可能会影响细胞的基因表达，且其低毒性具有一定种属和细胞特异性[34]。京尼平在水溶液中不稳定，且交联产物颜色深、交联时间较长[35]。此外，市售的京尼平价格为150～200元/g，与其他交联剂相比较昂贵[34]。上述不足在一定程度上限制了京尼平的广泛应用。
1.3.3 氧化海藻酸钠
海藻酸钠的羟基基团可被高碘酸钠氧化，生成氧化海藻酸钠。它属于多官能团的高分子交联剂，含有以醛基为主的多种可供交联的官能团，是有效的蛋白质或亚基交联剂[36-37]。氧化海藻酸钠的价格相对低廉，氧化度＜ 50%时的细胞毒性为0～2级，氧化度越高其细胞毒性越强[37]。其交联机制[36]与戊二醛的交联机制相似，即氧化海藻酸钠的醛基在水中与富含氨基、羟基的分子（如蛋白质、含胺多糖等）反应，形成Schiff碱后，再与其他分子反应形成立体网状结构。
Balakrishnan等[38]在弱碱性条件下，利用氧化海藻酸钠交联明胶，获得了可注射的降解型生物支架材料；胶凝时间一般随氧化海藻酸钠、明胶以及硼砂的浓度增加而减少，组织的交联程度随藻酸盐的氧化程度增加而增加，而溶胀比和溶胀程度则随氧化程度的增加而降低；37℃下用交联材料浸提液孵育L929小鼠成纤维细胞24 h，93%的细胞代谢活跃，与空白对照组（含血清的DMEM细胞）无显著差异，显示极低的细胞毒性。Xu等[36]采用氧化海藻酸钠、戊二醛和多聚环氧化合物3种交联剂分别处理脱细胞猪主动脉，结果显示3组材料的交联系数均随交联时间增加而显著提高，反应7 h后达峰值；氧化海藻酸钠组的交联速率和交联指数最佳，其机械性能与戊二醛组相当并优于多聚环氧化合物；而且氧化海藻酸钠交联组的自然结构保存完好，细胞毒性显著低于戊二醛和多聚环氧化合物交联的组织。李莉等[5]还发现与京尼平相比，氧化海藻酸钠处理血管组织，其交联时间更短、交联速率更快且交联程度更佳；交联后的组织力学性能更接近于新鲜组织，且细胞毒性和细胞黏附能力均与京尼平相似。因而，可以认为氧化海藻酸钠是一种有效的生物组织交联剂。
1.3.4 多醛基葡聚糖
多醛基葡聚糖（氧化葡聚糖）是葡聚糖适度氧化生成的高分子葡萄糖聚合物，它能与具有游离氨基的大分子物质发生交联反应，交联机制与氧化海藻酸钠相似[39]。如明胶的赖氨酸和羟赖氨酸的氨基残基就可与多醛基葡聚糖反应生成Schiff碱。相同温度、时间下，葡聚糖的氧化度与氧化剂高碘酸钠的浓度相关。而葡聚糖的氧化度越高，醛基的暴露程度就越大，多醛基葡聚糖的交联度也随之增高。
多醛基葡聚糖交联生物衍生材料的优点有交联效率高、机械性能好以及炎性反应弱等，主要不足是细胞毒性相比其他生物交联剂较强。Draye等[40]制备了多醛基葡聚糖交联的明胶伤口敷料，体外实验结果表明，交联敷料的细胞毒性在可接受范围内；将敷料植入小鼠皮下只引起较弱且逐渐消退的炎性反应，未见细胞变性或异常的细胞形貌，说明其具有良好的生物相容性。Mateo等[41]还发现用多醛基葡聚糖交联得到的固定化腈水解酶的活力回收可达50%～60%，而戊二醛交联则导致酶完全失活；而且多醛基葡聚糖固定的青霉素G酰化酶的活力回收可达到90%。这可能是由于多醛基葡聚糖的大分子结构不能穿透蛋白活性位点，因而不能与催化必需的氨基酸残基反应。同理，多醛基葡聚糖交联的支架材料上的某些活性成分也可能不会被破坏，但目前未见相关研究报道。
此外，可发生化学交联的生物交联剂还有橄榄苦苷[42]、藻酸[43]以及植酸[44]等。研究表明，它们均具有良好的细胞相容性和血液相容性，交联产物具有理想的机械性能。因此，它们也适合作为交联剂应用于生物医学领域。
2 物理交联法
物理交联的生物衍生材料是指由于分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用等存在而形成的网络结构。通过离子的相互作用力交联是典型的物理交联。聚电解质如壳聚糖、海藻酸盐等，可与带相反电荷的多价离子或聚电解质通过离子的相互作用而键合，形成物理交联型水凝胶[45]。
Nie等[46]使用Na+交联魔芋葡甘聚糖/壳聚糖复合材料，提高其生物稳定性，并将制得的支架材料用于骨组织修复。Kuo等[47]将D-葡萄糖酸-δ-内酯作为Ca2+的载体，制备了凝胶速率可控、结构均一的海藻酸盐水凝胶，该凝胶的机械性能取决于交联时各组分的配比；他们发现，凝胶速率低的水凝胶更加均一且机械强度更高；凝胶的压缩模量和强度随藻酸盐浓度、总钙含量、藻酸盐的相对分子质量和古洛糖醛酸含量增加而增加。值得注意的是，Ca2+与海藻酸盐的交联反应是可逆的。Gillette等[48]发现可将柠檬酸钠作为Ca2+螯合剂夺取海藻酸盐交联网络中的Ca2+，使其发生交联反应的逆反应。他们利用这一特性制备了胶原/海藻酸盐双组分水凝胶，通过反复改变海藻酸盐的交联程度研究三维ECM的动态变化对细胞行为的影响。两种带异种电荷的聚电解质也可通过离子的相互作用交联[49]，其结合强度高于氢键、范德华力等次级键，且具有可逆性，安全隐患较小，但是聚电解质的选择难度较高[50]。
通过氢键进行交联也是物理交联法的一个分支，如原花青素分子中的酚羟基可与蛋白肽链中的酰胺基等基团形成氢键，达到交联改性的目的[51]。研究表明[52]，原花青素交联的材料力学性能、组织变性温度、抗酶解能力等均有所改善。而且，He等[6]通过傅里叶变换红外光谱、原子力显微镜等测试分析，发现原花青素交联处理的胶原蛋白三螺旋构象并未破坏，且改善了胶原蛋白膜的疏水性能和热稳定性能。槲皮素分子中的酚羟基也可与生物衍生材料中蛋白质的羰基、羟基等自由基团形成氢键交联[53]。Zhai等[53]评价了槲皮素交联的脱细胞猪主动脉瓣，结果表明槲皮素交联的主动脉瓣不仅抗钙化、抗中性粒细胞胶原酶酶解，而且其拉伸强度优于戊二醛交联的主动脉瓣，在D-Hank溶液浸泡30 d后其拉伸强度和弹性无明显损失。槲皮素对血管内皮细胞的毒性阈值为1 μg/mL，其细胞毒性比戊二醛低100倍。
此外，温敏凝胶如壳聚糖则可在接近低临界溶解温度时因分子运动加剧，分子链相互缠绕而发生液态和凝胶态的相互转变[45, 50, 54]。但是，在物理交联型水凝胶中，分子间的缠绕、疏水相互作用或离子键合区域也会形成簇团结构，因此造成凝胶的不均匀性，同时自由链端和链环也会产生瞬时的网络缺陷[45]。
3 生物交联法
一些酶如转谷氨酰胺酶[55]、辣根过氧化物酶[56]、酪氨酸酶[57-58]、赖氨酰氧化酶[59]等可在特定的pH值和温度下催化生物衍生材料发生交联反应[60]，这种交联方法称为酶交联法。它具有酶催化反应的所有优点，如高效、高选择性、交联速率可控、反应条件温和等，还可避免有毒交联剂的带入[61]。但是其高选择性也在一定程度上限制了在生物衍生材料交联改性中的应用，如微生物转谷氨酰胺酶可以交联Ⅰ型胶原，却无法交联天然胶原，如牛皮胶原蛋白粉[62]。
转谷氨酰胺酶又称谷氨酰胺胺酶，参与细胞黏附、分化、死亡和维护ECM稳定性等多种生理功能，是一种依赖Ca2+催化酰基转移反应的酶[61]。它以肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基的供体，以多肽链中赖氨酰残基ε-氨基作为酰基的受体，形成蛋白质分子内和分子间的酰胺键，使蛋白质分子发生交联，维护组织的稳定性，提高材料的机械性能[61]。转谷氨酰胺酶家族成员--组织型转谷氨酰胺酶对创伤愈合有促进作用，组织损伤区域积累的组织型转谷氨酰胺酶可交联ECM中某些成分，尤其是胶原蛋白和纤连蛋白，加速其沉积速率，还可通过影响TGF-β1的激活来减轻炎性反应，因此它本身可能就是一种促进伤口愈合、防止瘢痕形成的治疗方法[63]。
Westhaus等[64]利用转谷氨酰胺酶的Ca2+依赖型催化机制，设计了原位交联体系。他将脂质体作为Ca2+的载体，将其与纤维蛋白原以及Ca2+依赖型转谷氨酰胺酶制备成液态混合物，该液态混合物可在37℃迅速凝胶化，其原理是脂质体在37℃时不稳定，释放的Ca2+激活转谷氨酰胺酶；这种凝胶系统可通过注射方式修复受损组织。Chau等[65]用组织型转谷氨酰胺酶和微生物转谷氨酰胺酶处理Ⅰ型胶原，改善胶原的细胞相容性。与未处理的胶原相比，人成骨细胞和人包皮成纤维细胞均能在支架材料上更好黏附、铺展和分化；人成骨细胞的ALP活性以及骨桥蛋白表达量显著增高，且随着转谷氨酰胺酶的浓度增加而增加；此外，酶交联还能有效抑制细胞内源蛋白酶的酶解。Lee等[66]还发现用转谷氨酰胺酶处理的Ⅰ型胶原刚度增加，而材料交联前后的孔隙率和孔径无变化。
此外，酶交联法还可与物理交联法联合使用。Wen等[67]先利用转谷氨酰胺酶交联明胶/海藻酸盐中的明胶成分，再利用Ca2+交联海藻酸盐成分，制备了具有互穿聚合物网络结构的材料。
4 结论与展望
近年来，生物衍生材料的研发取得了很大进展，其中新发现的可用于材料制备的交联剂和交联方法为生物衍生材料研究作出了巨大贡献。各种交联方法均有一定局限性，我们可以针对特定的生物衍生材料选择合适交联方法，使其在保持优良生物相容性和组织修复能力的同时，获得良好的机械性能、抗降解性能等。如含有不稳定生物活性物质或活细胞的生物衍生材料往往要求温和的反应条件且无有机溶剂、交联剂残留；为避免残留的交联剂使材料中活性物质变性，保证水凝胶所包埋物质的完整性，我们可采用酶交联或物理交联法如离子交联对材料进行交联改性。对于双组分或多组分的生物衍生复合材料，可能需联合使用两种或多种交联方法。
虽然这些交联方法仍存在不足，但是它们交联的生物衍生材料的细胞毒性均较传统化学交联剂低，生物相容性好，且显著改善了材料的各项性能，如力学性能和降解性能等。它们为生物衍生材料的交联改性提供了更多选择，有助于得到更适用于临床的组织工程产品。相信在国内外研究者的共同努力下，随着各种交联机制研究的不断深入和交联方法的不断完善，有望更精确控制材料的交联度，更大程度降低细胞毒性和免疫原性，获得更适合临床应用的生物衍生材料，进一步推动转化医学发展。