引用本文： 张紫机, 康焱, 张志奇, 杨子波, 方淑莺, 盛璞义, 何爱珊, 傅明, 廖威明. 人脂肪来源干细胞成软骨分化过程中成软骨相关微小RNA表达的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(1): 74-80. doi: 10.7507/1002-1892.20150017 复制
软骨组织工程研究中，种子细胞的选择是关键。自体软骨细胞具有供区有限、体外培养传代去分化，以及随年龄增长细胞数量和质量下降等缺陷。而脂肪组织具有来源广泛、取材简便、易培养、生物学性质稳定等优点，故人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）成软骨诱导已成为研究热点[1-2]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是在转录后水平参与基因调控的一类非编码单链小分子RNA，通过碱基互补配对原则与靶基因mRNA的3’-非编码区相结合而沉默基因，导致其降解或翻译抑制，从而于转录后水平调控基因表达[3]。miRNA在多个调控通路中扮演重要角色，如胚胎发育及器官形成、细胞增殖与凋亡、脂肪代谢、细胞生长与分化[4-6]等。研究发现miRNA在维持软骨及软骨细胞内环境稳定中起重要作用[7]，能调节MSCs成软骨分化[8]。本实验通过miRNA基因芯片技术筛选hAD SCs成软骨分化中特异性表达miRNA，并预测其软骨代谢相关靶基因。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂、仪器
人脂肪组织由中山大学附属第一医院行抽脂术或其他腹部手术的3例患者自愿捐赠，其中女1例，男2例；年龄19、28、45岁；均排除恶性肿瘤和代谢性疾病。本实验获中山大学伦理委员会审核批准。
DMEM培养液、FBS、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素双抗溶液（GIBCO公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；PBS（HyClone公司，美国）；成人MSCs成软骨诱导分化基础培养液及添加物（Cyagen公司，美国），添加物含脯氨酸、ITS + Supplement、TGF-β3等，与成软骨诱导分化基础培养液混匀后形成完全培养液；人Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，Col2a1）、人蛋白聚糖（Aggrecan）、人Col10a1、人硫酸软骨素 ELISA定量检测试剂盒（Rapidbio公司，美国）；细胞总RNA提取试剂Trizol Reagent（Invit rogen公司，美国）；miRNeasy mini kit试剂盒（Qiagen公司，德国）；miRCURYTM LNA Array V13.0芯片、miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit试剂盒（Exiqon公司，丹麦）；SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本）；miRNA 实时定量PCR检测试剂盒（GeneCopoeia公司，美国）；FITC单克隆抗体、PC5单克隆抗体、鼠抗人IgG1、鼠抗人CD14、鼠抗人CD34、鼠抗人CD73、人HLA-DR单克隆抗体（BD公司，美国）；PE单克隆抗体、鼠抗人CD90、鼠抗人CD105单克隆抗体（eBioscience公司，美国）。
CO2细胞培养箱（Thermo Forma公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；层流超净工作台（ESCO公司，美国）；低温离心机、分光光度计（Eppendorf公司，德国）；紫外分光光度计ND1000（Nanodrop公司，美国）；流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；凝胶成像分析系统（Vilber公司，美国）；台式分子杂交箱（Shellab公司，美国）；LuxScanTM 10K/A双通道激光共聚焦芯片扫描仪、Bio MixerⅡ芯片杂交仪、芯片洗干仪、LuxScan V3.0图像分析软件、微阵列数据分析系统V2.0（北京博奥生物技术有限公司）；SAM（Significance analysis of microarrays）软件（Stanford大学，美国）；ABI PRISM® 7500 序列检测系统（ABI公司，美国）；iQ5 实时定量 PCR分析仪、电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 hADSCs分离培养及鉴定
无菌条件剪取5～10 g脂肪组织，PBS冲洗3次，剔除残留纤维组织和血管，剪碎至乳糜状。按照1∶1（V/V）比例加入Ⅰ型胶原酶，置于恒温摇床37℃消化60 min，100 μm尼龙滤网过滤，加入含10%FBS的DMEM中止消化，弃上层漂浮的脂肪和培养基，加入DMEM吹打冲洗，重悬细胞；以离心半径10 cm，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。加入完全培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 g/ L链霉素的DMEM培养基），按1.5×105个/cm2浓度接种于细胞培养瓶，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；细胞达80%融合后传代培养，取第3代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD13、CD34、CD73、CD90、CD105，鉴定细胞。
1.3 hADSCs成软骨诱导分化及相关检测
取第3代hADSCs，用成人MSCs成软骨诱导分化基础培养液调整细胞密度为2×107个/mL，接种至24孔板中，每孔12.5 μL。于37℃、5% CO2及饱和湿度培养箱培养90 min，待细胞聚集成团后加入成软骨诱导分化完全培养液，每孔500 μL。细胞团于24 h内进一步聚合并紧密黏附，形成直径1～2 mm微球。每3天换液1次，期间肉眼观察软骨球形成情况，至21 d收集软骨球。① 组织学观察：将软骨球置于10%甲醛室温下固定3 d，无水乙醇脱水，二甲苯冲洗后石蜡包埋切片，片厚5 μm，阿尔新蓝染色，镜下观察软骨形成情况。以未行成软骨诱导的细胞作为对照。② 成软骨相关蛋白检测：取培养后7、14、21 d上清，按ELISA定量检测试剂盒说明书，检测hADSCs成软骨诱导分化相关蛋白表达情况，包括Col2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸软骨素。以hADSCs未行成软骨诱导的普通培养上清作为对照。
1.4 筛选成软骨相关差异表达miRNA
取成软骨诱导21 d软骨球及诱导前hADSCs，采用Trizol细胞裂解液提取总RNA。按照miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit试剂盒说明书进行miRNA标记、杂交及脱水处理，通过LuxScan 10K/A双通道激光共聚焦芯片扫描仪扫描，LuxScan V3.0图像分析软件分析芯片图像，将图像信号转化成数字信号。每个样品重复2次芯片杂交。最终输出结果包括诱导前后表达有变化和没有变化的所有miRNAs信号，Ratio值为Lowess法归一化后的结果。整合Ratio值，采用SAM软件分析，根据以下标准筛选差异表达miRNA，包括表达上调及下调的miRNA。筛选标准：q值＜1%且Ratio值≥2或Ratio值≤0.5（即差异倍数在2倍以上）。本实验结果取自3个样本，筛选前选出每个hADSCs样品成软骨诱导分化前后表达差异显著的miRNA，然后取其交集。
对于筛选的成软骨诱导分化差异表达miR NAs，通过miRNA靶基因预测站点Target Scan（http://www.targetscan.org/）、miRanda（http://www.microrna.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/）和miRBase（http://www.mirbase.org/）进行靶基因预测，同时被3种预测软件认定的靶基因纳入结果。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs鉴定
流式细胞仪检测示第3代细胞CD73、CD90和CD105阳性表达，其中CD73表达阳性细胞占99.02%，CD90表达阳性细胞占95.28%，CD105表达阳性细胞占97.65%，而造血干细胞相关标记抗原CD14和CD34表达均为阴性（图 1）。提示培养的细胞为hADSCs[9]。
图1
流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原 ⓐCD73 ⓑCD90 ⓒCD105 ⓓCD34 ⓔCD14 2.2 成软骨诱导分化相关检测
第3代hADSCs成软骨诱导1 d后可见软骨球形成，5～7 d软骨球表面逐渐光滑，具软骨光泽；随培养时间延长，软骨球逐渐增大，至21 d直径可达1.5～2.0 mm（图 2）。诱导21 d，阿尔新蓝染色呈阳性，形成大量软骨基质Aggrecan；而未诱导的hADSCs染色呈阴性（图 3）。
ELISA检测示，成软骨诱导后7、14、21 d，Co l2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸软骨素表达水平均显著高于未诱导的hADSCs，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
2.3 成软骨诱导前后差异性表达miRNA芯片筛查
在样本1中，筛选出255个差异性表达miR NA，其中141个上调miRNA及114个下调miRNA。样本2中，筛选出78个差异性表达miR NA，其中27个上调miRNA，51个下调miRNA。样本3中，筛选出231个差异性表达miRNA，其中144个上调miRNA，87个下调miRNA。
综合3个样本共筛选出11个差异性表达miRNA。与未诱导hADSCs相比，成软骨诱导培养后hADSCs中7个miRNA表达上调，分别为hsa-miR-193b、hsa-miR-199a-3p/hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-381、hsa-miR-92a和hsa-miR-320c，4个miRNA表达下调，分别为hsa-miR-490-5p、hsa-miR-4287、evb-miR-BART8*和hcmv-miR-US25-1*。见表 1。
表1
成软骨诱导前后差异性表达miRNAs
Table1.
miRNAs expression in chondrogenic differentiated hADSCs by microarray
对7个已有大量研究的miRNA进行靶基因预测，结果显示大量与细胞增殖、分化、周期调控以及转录因子和信号传导相关的基因都可能成为上述miRNA的潜在靶基因。在hADSCs成软骨分化中表达上调的miRNAs靶向基因可能为CAAT/增强子结合蛋白β（CAAT/enhancer binding protein β,CAAT/EBPβ）、B细胞κ轻链增强核因子的抑制物α（nuclear factor of kappa light chain enhancer of activated B cells inhibitor alpha，NFKBIA或IKBA）、Sox4、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated kinase-like protein 1，MAPK-1）、Runx2和骨形成蛋白受体2（bone morphogenic protein receptor 2，BMPR2）等。而在hADSCs成软骨分化过程中表达下调的miR NAs靶基因可能为Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1和BMPR2。见表 2。
表2
部分成软骨相关miRNAs的靶基因在线预测结果
Table2.
Predicted target genes of chondrogenic miRNAs that are related to cartilage formation and chondrogenic differentiation
3 讨论
miRNA是一类短链的非编码单链RNA分子，广泛存在于各种组织和器官，并在骨及软骨发育中扮演重要角色[8, 10-15]。为了进一步研究miRNA在hADSCs成软骨分化中的作用，我们应用miRNA微阵列芯片技术筛选成软骨分化前后差异性表达超过2倍的miRNA。结果显示，miR-193b、miR-199a-3p/miR-199b-3p、miR-455-3p、miR-210、miR-381、miR-92a以及miR-320c表达均明显上调超过2倍。Han等 [16]报道miR-193b在MSCs成软骨分化过程中表达升高。Swingler等[14]也在软骨形成过程中和成人关节软骨中发现miR-455-3p表达。鉴于miRNA在MSCs成软骨分化中的重要作用，我们认为这些表达异常的miRNA可能具备改变hADSCs成软骨分化进程的能力。
研究发现miR-140在斑马及老鼠的软骨发育[17-18]以及人关节软骨发育中均有表达[19]。近期有研究发现骨关节炎患者软骨中miR-140-5p表达明显升高[14]。这些结果均提示miR-140在关节软骨发育过程中具有重要作用，但在本研究中miR-140-5p仅在两个样本中表现出超过2倍的差异性表达。我们前期研究也未发现这些miRNAs在hADSCs成骨分化过程中明显过表达[10]，因而我们认为这些特异miRNA在关节软骨发育进程中可能起一定作用。
软骨细胞的代谢受转录和转录后水平调控，miRNA作为成软骨分化转录后重要的调节中介，通过结合靶基因，即转录因子发挥作用[8, 13, 20]。miR-199a*是miR-199a家族中的一员，是BMP-2反应性miRNA，在鼠MSCs中它可以直接靶向结合Smad1进而调节软骨形成[19]；miR-455-3p则通过调节TGF-β信号通路抑制成软骨分化相关的Smad2/3通路[14]。为探索特异性表达的miRNAs靶基因，我们通过miRNA靶基因预测软件发现靶基因中包括了多种转录因子，如Sox5、Sox9、C/EBPβ、MAPK-1、Smad3、NF-κB、Runx2和Osterix等，功能涉及成软骨分化、增殖、凋亡、细胞周期控制、细胞内级联反应和自我更新等。
Xu等[20]研究发现Sox5可与miR-194联合调控hADSCs成软骨分化，但本研究仅1个样本成软骨诱导后miR-194下调2.95倍。Xu等研究认为，miR-194下调可增加Sox5表达，从而增强hADSCs成软骨分化能力；miR-194上调则减弱其成软骨分化能力。亦有报道Sox5和Sox9对hADSCs成软骨分化过程中Ⅱ型胶原表达起调控作用[21]。C/EBP是亮氨酸拉链转录因子家族，其中C/EBPβ与软骨细胞特异性基因表达有重要相关性，介导软骨细胞对IL-1β和抵抗素作用的生物反应[22]。也有研究认为C/EBPβ能够促进软骨细胞从增殖期至肥大软骨细胞转化，敲除C/EBPβ后能延缓骨关节炎的发展[23]。因此，C/EBPβ是软骨细胞生长分化调控和细胞退变中的重要转录因子。NF-κB是另一个与成软骨分化密切相关的预测靶基因。在转录调控中，C/EBPβ与NF-κB能有序联合调控软骨细胞炎性因子的表达。NF-κB参与早期起始性的反应性正向调节，但不参与炎性因子的基础状态下启动子的活性；C/EBPβ持续稳定参与炎性因子的反应性正向调节和细胞稳定期内炎性因子的表达[22-23]。这一研究理论也在上皮细胞中得到证实[24]。另外，Wehling等 [24]发现在软骨修复中IL-1β和TNF-α通过NF-κB依赖性信号通路抑制干细胞成软骨分化。结合以上研究结果我们认为，C/EBPβ及NF-κB在调节干细胞成软骨分化和抑制退变中的作用不容忽视，并需深入研究。
本研究筛选出4个成软骨诱导分化前后表达下调超过2倍的miRNA，包括miR-4287、miR-BART8*、miR-US25-1*和miR-490-5p。因目前对miR-4287、miR-BART8*和miR-US25-1*的研究有限，未能查阅到相关文献，且反复多次对其引物的设计亦因同样理由失败，未对其进行靶基因预测。miR-490-5p目前多见于膀胱癌组织[25]，尚未在成软骨分化中发现。其预测靶基因中与软骨分化相关的有Sox2、Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1/7/9/12和BMPR2/7/9等。功能亦同样涉及成软骨细胞分化、增殖、凋亡、细胞周期控制、介导细胞内级联反应和自我更新等。在hADSCs成软骨分化中表达上调的miRNAs潜在靶基因和下调的miRNAs潜在靶基因有部分重合，如Sox2/4、Smad4/5、MAPK-1/9和BMP-2/7等，提示它们可能同时参与某些转录因子的调控。
miRNAs在成软骨分化中的调控作用已逐渐被认识。本研究发现了一组在hADSCs成软骨分化过程中差异性表达的miRNA，它们可能参与hADSCs成软骨分化调控。靶基因预测发现，1个miRNA有多个靶基因，提示1个miRNA可能参与多个信号通路调节。为进一步阐明miRNAs在转录后水平对成软骨分化的调控机制，后续将对miRNA预测靶基因功能进行研究，从而为定向调控hADSCs成软骨分化及筛选组织工程改良种子细胞提供理论依据。
软骨组织工程研究中，种子细胞的选择是关键。自体软骨细胞具有供区有限、体外培养传代去分化，以及随年龄增长细胞数量和质量下降等缺陷。而脂肪组织具有来源广泛、取材简便、易培养、生物学性质稳定等优点，故人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）成软骨诱导已成为研究热点[1-2]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是在转录后水平参与基因调控的一类非编码单链小分子RNA，通过碱基互补配对原则与靶基因mRNA的3’-非编码区相结合而沉默基因，导致其降解或翻译抑制，从而于转录后水平调控基因表达[3]。miRNA在多个调控通路中扮演重要角色，如胚胎发育及器官形成、细胞增殖与凋亡、脂肪代谢、细胞生长与分化[4-6]等。研究发现miRNA在维持软骨及软骨细胞内环境稳定中起重要作用[7]，能调节MSCs成软骨分化[8]。本实验通过miRNA基因芯片技术筛选hAD SCs成软骨分化中特异性表达miRNA，并预测其软骨代谢相关靶基因。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂、仪器
人脂肪组织由中山大学附属第一医院行抽脂术或其他腹部手术的3例患者自愿捐赠，其中女1例，男2例；年龄19、28、45岁；均排除恶性肿瘤和代谢性疾病。本实验获中山大学伦理委员会审核批准。
DMEM培养液、FBS、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素双抗溶液（GIBCO公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；PBS（HyClone公司，美国）；成人MSCs成软骨诱导分化基础培养液及添加物（Cyagen公司，美国），添加物含脯氨酸、ITS + Supplement、TGF-β3等，与成软骨诱导分化基础培养液混匀后形成完全培养液；人Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，Col2a1）、人蛋白聚糖（Aggrecan）、人Col10a1、人硫酸软骨素 ELISA定量检测试剂盒（Rapidbio公司，美国）；细胞总RNA提取试剂Trizol Reagent（Invit rogen公司，美国）；miRNeasy mini kit试剂盒（Qiagen公司，德国）；miRCURYTM LNA Array V13.0芯片、miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit试剂盒（Exiqon公司，丹麦）；SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本）；miRNA 实时定量PCR检测试剂盒（GeneCopoeia公司，美国）；FITC单克隆抗体、PC5单克隆抗体、鼠抗人IgG1、鼠抗人CD14、鼠抗人CD34、鼠抗人CD73、人HLA-DR单克隆抗体（BD公司，美国）；PE单克隆抗体、鼠抗人CD90、鼠抗人CD105单克隆抗体（eBioscience公司，美国）。
CO2细胞培养箱（Thermo Forma公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；层流超净工作台（ESCO公司，美国）；低温离心机、分光光度计（Eppendorf公司，德国）；紫外分光光度计ND1000（Nanodrop公司，美国）；流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）；凝胶成像分析系统（Vilber公司，美国）；台式分子杂交箱（Shellab公司，美国）；LuxScanTM 10K/A双通道激光共聚焦芯片扫描仪、Bio MixerⅡ芯片杂交仪、芯片洗干仪、LuxScan V3.0图像分析软件、微阵列数据分析系统V2.0（北京博奥生物技术有限公司）；SAM（Significance analysis of microarrays）软件（Stanford大学，美国）；ABI PRISM® 7500 序列检测系统（ABI公司，美国）；iQ5 实时定量 PCR分析仪、电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 hADSCs分离培养及鉴定
无菌条件剪取5～10 g脂肪组织，PBS冲洗3次，剔除残留纤维组织和血管，剪碎至乳糜状。按照1∶1（V/V）比例加入Ⅰ型胶原酶，置于恒温摇床37℃消化60 min，100 μm尼龙滤网过滤，加入含10%FBS的DMEM中止消化，弃上层漂浮的脂肪和培养基，加入DMEM吹打冲洗，重悬细胞；以离心半径10 cm，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。加入完全培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 g/ L链霉素的DMEM培养基），按1.5×105个/cm2浓度接种于细胞培养瓶，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；细胞达80%融合后传代培养，取第3代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD13、CD34、CD73、CD90、CD105，鉴定细胞。
1.3 hADSCs成软骨诱导分化及相关检测
取第3代hADSCs，用成人MSCs成软骨诱导分化基础培养液调整细胞密度为2×107个/mL，接种至24孔板中，每孔12.5 μL。于37℃、5% CO2及饱和湿度培养箱培养90 min，待细胞聚集成团后加入成软骨诱导分化完全培养液，每孔500 μL。细胞团于24 h内进一步聚合并紧密黏附，形成直径1～2 mm微球。每3天换液1次，期间肉眼观察软骨球形成情况，至21 d收集软骨球。① 组织学观察：将软骨球置于10%甲醛室温下固定3 d，无水乙醇脱水，二甲苯冲洗后石蜡包埋切片，片厚5 μm，阿尔新蓝染色，镜下观察软骨形成情况。以未行成软骨诱导的细胞作为对照。② 成软骨相关蛋白检测：取培养后7、14、21 d上清，按ELISA定量检测试剂盒说明书，检测hADSCs成软骨诱导分化相关蛋白表达情况，包括Col2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸软骨素。以hADSCs未行成软骨诱导的普通培养上清作为对照。
1.4 筛选成软骨相关差异表达miRNA
取成软骨诱导21 d软骨球及诱导前hADSCs，采用Trizol细胞裂解液提取总RNA。按照miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit试剂盒说明书进行miRNA标记、杂交及脱水处理，通过LuxScan 10K/A双通道激光共聚焦芯片扫描仪扫描，LuxScan V3.0图像分析软件分析芯片图像，将图像信号转化成数字信号。每个样品重复2次芯片杂交。最终输出结果包括诱导前后表达有变化和没有变化的所有miRNAs信号，Ratio值为Lowess法归一化后的结果。整合Ratio值，采用SAM软件分析，根据以下标准筛选差异表达miRNA，包括表达上调及下调的miRNA。筛选标准：q值＜1%且Ratio值≥2或Ratio值≤0.5（即差异倍数在2倍以上）。本实验结果取自3个样本，筛选前选出每个hADSCs样品成软骨诱导分化前后表达差异显著的miRNA，然后取其交集。
对于筛选的成软骨诱导分化差异表达miR NAs，通过miRNA靶基因预测站点Target Scan（http://www.targetscan.org/）、miRanda（http://www.microrna.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/）和miRBase（http://www.mirbase.org/）进行靶基因预测，同时被3种预测软件认定的靶基因纳入结果。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs鉴定
流式细胞仪检测示第3代细胞CD73、CD90和CD105阳性表达，其中CD73表达阳性细胞占99.02%，CD90表达阳性细胞占95.28%，CD105表达阳性细胞占97.65%，而造血干细胞相关标记抗原CD14和CD34表达均为阴性（图 1）。提示培养的细胞为hADSCs[9]。
图1
流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原 ⓐCD73 ⓑCD90 ⓒCD105 ⓓCD34 ⓔCD14 2.2 成软骨诱导分化相关检测
第3代hADSCs成软骨诱导1 d后可见软骨球形成，5～7 d软骨球表面逐渐光滑，具软骨光泽；随培养时间延长，软骨球逐渐增大，至21 d直径可达1.5～2.0 mm（图 2）。诱导21 d，阿尔新蓝染色呈阳性，形成大量软骨基质Aggrecan；而未诱导的hADSCs染色呈阴性（图 3）。
ELISA检测示，成软骨诱导后7、14、21 d，Co l2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸软骨素表达水平均显著高于未诱导的hADSCs，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
2.3 成软骨诱导前后差异性表达miRNA芯片筛查
在样本1中，筛选出255个差异性表达miR NA，其中141个上调miRNA及114个下调miRNA。样本2中，筛选出78个差异性表达miR NA，其中27个上调miRNA，51个下调miRNA。样本3中，筛选出231个差异性表达miRNA，其中144个上调miRNA，87个下调miRNA。
综合3个样本共筛选出11个差异性表达miRNA。与未诱导hADSCs相比，成软骨诱导培养后hADSCs中7个miRNA表达上调，分别为hsa-miR-193b、hsa-miR-199a-3p/hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-381、hsa-miR-92a和hsa-miR-320c，4个miRNA表达下调，分别为hsa-miR-490-5p、hsa-miR-4287、evb-miR-BART8*和hcmv-miR-US25-1*。见表 1。
表1
成软骨诱导前后差异性表达miRNAs
Table1.
miRNAs expression in chondrogenic differentiated hADSCs by microarray
对7个已有大量研究的miRNA进行靶基因预测，结果显示大量与细胞增殖、分化、周期调控以及转录因子和信号传导相关的基因都可能成为上述miRNA的潜在靶基因。在hADSCs成软骨分化中表达上调的miRNAs靶向基因可能为CAAT/增强子结合蛋白β（CAAT/enhancer binding protein β,CAAT/EBPβ）、B细胞κ轻链增强核因子的抑制物α（nuclear factor of kappa light chain enhancer of activated B cells inhibitor alpha，NFKBIA或IKBA）、Sox4、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated kinase-like protein 1，MAPK-1）、Runx2和骨形成蛋白受体2（bone morphogenic protein receptor 2，BMPR2）等。而在hADSCs成软骨分化过程中表达下调的miR NAs靶基因可能为Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1和BMPR2。见表 2。
表2
部分成软骨相关miRNAs的靶基因在线预测结果
Table2.
Predicted target genes of chondrogenic miRNAs that are related to cartilage formation and chondrogenic differentiation
3 讨论
miRNA是一类短链的非编码单链RNA分子，广泛存在于各种组织和器官，并在骨及软骨发育中扮演重要角色[8, 10-15]。为了进一步研究miRNA在hADSCs成软骨分化中的作用，我们应用miRNA微阵列芯片技术筛选成软骨分化前后差异性表达超过2倍的miRNA。结果显示，miR-193b、miR-199a-3p/miR-199b-3p、miR-455-3p、miR-210、miR-381、miR-92a以及miR-320c表达均明显上调超过2倍。Han等 [16]报道miR-193b在MSCs成软骨分化过程中表达升高。Swingler等[14]也在软骨形成过程中和成人关节软骨中发现miR-455-3p表达。鉴于miRNA在MSCs成软骨分化中的重要作用，我们认为这些表达异常的miRNA可能具备改变hADSCs成软骨分化进程的能力。
研究发现miR-140在斑马及老鼠的软骨发育[17-18]以及人关节软骨发育中均有表达[19]。近期有研究发现骨关节炎患者软骨中miR-140-5p表达明显升高[14]。这些结果均提示miR-140在关节软骨发育过程中具有重要作用，但在本研究中miR-140-5p仅在两个样本中表现出超过2倍的差异性表达。我们前期研究也未发现这些miRNAs在hADSCs成骨分化过程中明显过表达[10]，因而我们认为这些特异miRNA在关节软骨发育进程中可能起一定作用。
软骨细胞的代谢受转录和转录后水平调控，miRNA作为成软骨分化转录后重要的调节中介，通过结合靶基因，即转录因子发挥作用[8, 13, 20]。miR-199a*是miR-199a家族中的一员，是BMP-2反应性miRNA，在鼠MSCs中它可以直接靶向结合Smad1进而调节软骨形成[19]；miR-455-3p则通过调节TGF-β信号通路抑制成软骨分化相关的Smad2/3通路[14]。为探索特异性表达的miRNAs靶基因，我们通过miRNA靶基因预测软件发现靶基因中包括了多种转录因子，如Sox5、Sox9、C/EBPβ、MAPK-1、Smad3、NF-κB、Runx2和Osterix等，功能涉及成软骨分化、增殖、凋亡、细胞周期控制、细胞内级联反应和自我更新等。
Xu等[20]研究发现Sox5可与miR-194联合调控hADSCs成软骨分化，但本研究仅1个样本成软骨诱导后miR-194下调2.95倍。Xu等研究认为，miR-194下调可增加Sox5表达，从而增强hADSCs成软骨分化能力；miR-194上调则减弱其成软骨分化能力。亦有报道Sox5和Sox9对hADSCs成软骨分化过程中Ⅱ型胶原表达起调控作用[21]。C/EBP是亮氨酸拉链转录因子家族，其中C/EBPβ与软骨细胞特异性基因表达有重要相关性，介导软骨细胞对IL-1β和抵抗素作用的生物反应[22]。也有研究认为C/EBPβ能够促进软骨细胞从增殖期至肥大软骨细胞转化，敲除C/EBPβ后能延缓骨关节炎的发展[23]。因此，C/EBPβ是软骨细胞生长分化调控和细胞退变中的重要转录因子。NF-κB是另一个与成软骨分化密切相关的预测靶基因。在转录调控中，C/EBPβ与NF-κB能有序联合调控软骨细胞炎性因子的表达。NF-κB参与早期起始性的反应性正向调节，但不参与炎性因子的基础状态下启动子的活性；C/EBPβ持续稳定参与炎性因子的反应性正向调节和细胞稳定期内炎性因子的表达[22-23]。这一研究理论也在上皮细胞中得到证实[24]。另外，Wehling等 [24]发现在软骨修复中IL-1β和TNF-α通过NF-κB依赖性信号通路抑制干细胞成软骨分化。结合以上研究结果我们认为，C/EBPβ及NF-κB在调节干细胞成软骨分化和抑制退变中的作用不容忽视，并需深入研究。
本研究筛选出4个成软骨诱导分化前后表达下调超过2倍的miRNA，包括miR-4287、miR-BART8*、miR-US25-1*和miR-490-5p。因目前对miR-4287、miR-BART8*和miR-US25-1*的研究有限，未能查阅到相关文献，且反复多次对其引物的设计亦因同样理由失败，未对其进行靶基因预测。miR-490-5p目前多见于膀胱癌组织[25]，尚未在成软骨分化中发现。其预测靶基因中与软骨分化相关的有Sox2、Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1/7/9/12和BMPR2/7/9等。功能亦同样涉及成软骨细胞分化、增殖、凋亡、细胞周期控制、介导细胞内级联反应和自我更新等。在hADSCs成软骨分化中表达上调的miRNAs潜在靶基因和下调的miRNAs潜在靶基因有部分重合，如Sox2/4、Smad4/5、MAPK-1/9和BMP-2/7等，提示它们可能同时参与某些转录因子的调控。
miRNAs在成软骨分化中的调控作用已逐渐被认识。本研究发现了一组在hADSCs成软骨分化过程中差异性表达的miRNA，它们可能参与hADSCs成软骨分化调控。靶基因预测发现，1个miRNA有多个靶基因，提示1个miRNA可能参与多个信号通路调节。为进一步阐明miRNAs在转录后水平对成软骨分化的调控机制，后续将对miRNA预测靶基因功能进行研究，从而为定向调控hADSCs成软骨分化及筛选组织工程改良种子细胞提供理论依据。
