引用本文： 方家刘, 尹宗生, 王伟, 陆鸣, 江正, 高维陆, 张硕, 余涛. 富白细胞和血小板血浆对BMSCs在兔股骨头缺血性坏死中成骨作用的影响. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(2): 227-233. doi: 10.7507/1002-1892.20150048 复制
股骨头缺血性坏死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常见疾病，各种治疗方法在于延缓或阻止早期坏死进展，避免晚期行人工关节置换，但均存在一定不足[1-2]。BMSCs是一种具有自我更新及多种分化潜能的细胞，能分泌多种成骨活性因子，是组织工程常用种子细胞[3-5]。富白细胞和血小板血浆（leucocyte-and platelet-rich plasma，L-PRP）是通过离心法从外周血分离出的白细胞和血小板浓缩物，含有丰富的纤维蛋白网络、各种生长因子及炎性反应抑制因子，具有促进组织修复、抑制炎性反应、控制感染和构建生物支架的潜能[6]。目前关于L-PRP对BMSCs成骨分化的作用尚存在争议[7-9]。本实验旨在通过动物实验探索L-PRP在ANFH模型中对BMSCs成骨分化的影响，为BMSCs联合L-PRP治疗ANFH奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4～6月龄新西兰大白兔24只，体重2.0～ 3.0 kg，雌雄不拘，由安徽医科大学动物实验室提供。DMEM/F12培养基（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；胰蛋白酶（上海鼎国生物技术有限公司）；牛凝血酶、CD29、CD31、CD45及CD90单抗（Sigma公司，美国）。CO2孵箱（Harris公司，美国）；Airtech无菌超净工作台（苏州富泰洁净系统有限公司）；常温超速离心机（Thermofisher公司，美国）；普通光学显微镜、倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus5.0计算机图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）；MDGS图像分析系统（Zeiss公司，德国）。
1.2 实验方法
实验动物随机分成A、B、C、D 4组（n=6）。A组：单纯行髓芯减压；B组：髓芯减压联合L-PRP移植；C组：髓芯减压联合BMSCs移植；D组：髓芯减压联合BMSCs及L-PRP移植。
1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定
取C、D组实验动物，于双侧髂后上嵴穿刺抽取骨髓6 mL，缓慢转入至离心管内（含淋巴细胞分离液2 mL），以离心半径13.5 cm、2 000 r/min离心25 min；采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心去除红细胞等纯化处理后，收集单核细胞层，洗涤2次，加至25 cm2培养瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基，于37℃、5%CO2孵箱内培养。48 h后换液，弃悬浮的单个核细胞及培养液，倒置相差显微镜下见散在贴壁，呈梭形、球形或菱形的细胞。每隔3～4 d换液1次，至细胞长满至80%时，按1∶2比例传代；第2代传第3代时，取部分细胞接种于装有载玻片的6孔板，预留检测细胞表型；其余第3代细胞继续培养备用。细胞移植前以0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心5 min，计数细胞，配制成6×106 个 /mL细胞悬液。
细胞表型鉴定：弃6孔板培养液，PBS冲洗2遍，加入胰蛋白酶消化成细胞悬液，移至离心管，以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心5 min，弃上清。PBS洗2次后3%多聚甲醛垂悬。4℃固定30 min，2%牛血清白蛋白封闭，加入CD29、 CD31、CD45 及CD90单抗孵育60 min，流式细胞仪检测细胞表型。
1.2.2 L-PRP及其凝胶制备
采用Landesberg方法[10]制备L-PRP。取B、D组实验动物，于耳背动脉抽取5 mL血液移至肝素抗凝管，以200×g离心10 min，在超净台内用枪头吸取全部上清液及白膜层，加入离心管中，以200×g离心10 min，弃3/4上清，剩余0.5 mL即为L-PRP。取L-PRP光镜下计数血小板，约（1 053.17±129.65）×109个/L。取5 000 U牛凝血酶溶解于5 mL 10% CaCl2溶液调配牛凝血酶溶液，取L-PRP或BMSCs/L-PRP混合物与牛凝血酶溶液以体积比（V/V）为1∶0.167混合，制备L-PRP或BMSCs/L-PRP凝胶。
1.2.3 ANFH动物模型制备
采用文献[11]方法制备ANFH动物模型。取24只实验动物，3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，取髋关节前外侧切口，显露股骨头及股骨颈前上部，行Light Bulb手术。在软骨与骨交界处，以3.5 mm 电钻头向股骨头前内侧钻孔，深4.0 mm。刮匙向内侧潜行刮除部分股骨头松质骨至软骨下骨，占股骨头总体积的50%～60%，模拟骨坏死行病灶清理术；干纱布保护股骨头以外组织，用沾有液氮的棉球即刻填塞于缺损区冷冻，连续冷冻25次，每次约8 s，共持续约3 min，使骨细胞和骨髓细胞坏死，生理盐水复温，制备ANFH动物模型。
1.2.4 ANFH动物模型修复方法
A组：ANFH动物模型制备后即刻缝合切口。B组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL L-PRP按上述方法制备L-PRP凝胶（血小板数约5.25×107个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。C组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL BMSCs悬液（BMSCs数约3×105个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。D组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL L-PRP及50 μL BMSCs混匀后按上述方法制备L-PRP/BMSCs凝胶（血小板数约5.25×107个，BMSCs数约3×105个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。术后连续3 d臀大肌肌肉注射硫酸庆大霉素，2 mL/只，每日1次。
1.3 观测指标
1.3.1 X线片评价
术后2、4、8周，实验动物以3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉后取仰卧位，摄髋关节正位X线片，观察髋关节和骨缺损灶骨密度变化，并行Lane-Sandhu X线评分评价成骨情况[12]。
1.3.2 组织学观测
摄片后，每组随机取2只实验动物处死，取股骨头标本，10%甲醛固定48 h，5%～7%硝酸溶液脱钙2周，沿冠状面切开标本，常规石蜡包埋，连续切片，厚5 μm，HE染色，光镜下观察ANFH修复情况。每张切片在100倍镜下随机取10个视野，行血管计数，取均值。采用Image-Pro Plus5.0计算机图像分析系统在100倍镜下观察，应用MDGS图像分析系统采集图像并分析，计算新生骨在骨缺损区所占面积百分比。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs分离培养及鉴定
第3代细胞培养5 d，倒置相差显微镜下呈贴壁梭形生长（图 1）。流式细胞仪检测示，CD31、CD45表达阴性，CD29及CD90表达阳性（图 2），表明传代培养的细胞为BMSCs。
图1
第3代细胞培养5 d，倒置相差显微镜观察细胞形态 ⓐ ×100 ⓑ ×400 图 2 流式细胞仪鉴定 ⓐ CD31 ⓑ CD45 ⓒ CD29 ⓓ CD90
Figure1.
Morphological observation of BMSCs at passage 3 after cultured for 5 days under inverted phase contrast microscope ⓐ ×100 ⓑ ×400 Fig. 2 Identification of BMSCs by flow cytometry ⓐ CD31 ⓑ CD45 ⓒ CD29 ⓓ CD90
2.2 动物实验
2.2.1 一般情况
所有动物无死亡，术后当天开始进食，伤口Ⅰ期愈合。
2.2.2 X线片评价
术后2周，各组缺损区均呈现低密度，C、D组缺损区密度较A、B组增高。4周，A组缺损区密度较2周时稍增高，边缘骨小梁出现结构紊乱；B组缺损区密度稍增高，边缘密度亦有所增高；C组缺损区密度较A、B组增高，但不及D组；D组缺损区密度进一步增高，有散在骨小梁出现，边缘高密度，形成硬化线。8周，A组软骨下出现明显囊性变；B组缺损区密度较4周时增高，边缘密度增高明显；C组缺损区密度进一步增高，可见散在骨小梁结构；D组缺损区与正常区无明显区别，有正常骨小梁结构。见图 3。Lane-Sandhu X线评分示：术后2、4、8周C、D组成骨明显优于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组优于C组，B组优于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
图3
术后各时间点各组X线片 ⓐ A组术后2周 ⓑ A组术后4周 ⓒ A组术后8周 ⓓ B组术后2周 ⓔ B组术后4周 ⓕ B组术后8周 ⓖ C组术后2周 ⓗ C组术后4周 ⓘ C组术后8周 ⓙ D组术后2周 ⓚ D组术后4周 ⓛ D组术后8周
Figure3.
X-ray films in each group at different time points after operation ⓐ Group A at 2 weeks ⓑ Group A at 4 weeks ⓒ Group A at 8 weeks ⓓ Group B at 2 weeks ⓔ Group B at 4 weeks ⓕ Group B at 8 weeks ⓖ Group C at 2 weeks ⓗ Group C at 4 weeks ⓘ Group C at 8 weeks ⓙ Group D at 2 weeks ⓚ Group D at 4 weeks ⓛ Group D at 8 weeks
表1
各组术后各时间点X线评分比较(n=4，x±s)
Table1.
X-ray score in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
2.2.3 组织学观测
A组：术后2周缺损区可见零星成骨细胞，周边及负重区骨小窝内细胞萎缩，大量纤维组织充填；4周，周边有新骨形成，中心部为疏松的纤维肉芽组织，空骨陷窝增多；8周，周边为逐渐形成的骨壁，中心部为纤维组织，无骨组织充填，并可见软骨与软骨下骨分离，骨小梁断裂等坏死征象。B组：术后2周缺损区可见少量成骨细胞，大量纤维组织充填，周边少量成骨反应；4周，周边有少量成骨反应，新生组织向中心部长入；8周，周边为骨形成带，中央部新生骨稀疏，排列紊乱。C组：术后2周缺损区内有较多成骨细胞，周边有类骨质及新生骨小梁出现；4周，缺损区有较多骨小梁及类骨质填充；8周，出现比较成熟的骨小梁及骨髓组织。D组：术后2周缺损区内可见大量成骨细胞，周边可见新生骨小梁及原始毛细血管形成；4周，缺损区新生骨小梁板层状或编织状，毛细血管丰富，但修复尚不均匀；8周，缺损区可见成熟的骨小梁变宽变粗，排列规则。见图 4。
图4
术后各时间点各组组织学观察（HE×100） ⓐ A组术后2周 ⓑ A组术后4周 ⓒ A组术后8周 ⓓ B组术后2周 ⓔ B组术后4周 ⓕ B组术后8周 ⓖ C组术后2周 ⓗ C组术后4周 ⓘ C组术后8周 ⓙ D组术后2周 ⓚ D组术后4周 ⓛ D组术后8周
Figure4.
Histological observation in each group at different time points after operation (HE×100) ⓐ Group A at 2 weeks ⓑ Group A at 4 weeks ⓒ Group A at 8 weeks ⓓ Group B at 2 weeks ⓔ Group B at 4 weeks ⓕ Group B at 8 weeks ⓖ Group C at 2 weeks ⓗ Group C at 4 weeks ⓘ Group C at 8 weeks ⓙ Group D at 2 weeks ⓚ Group D at 4 weeks ⓛGroup D at 8 weeks
修复区内骨形态计量与血管计数：术后2、4、8周，C、D组新生骨面积百分比及血管计数明显优于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组优于C组，B组优于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2、3。
表2
各组术后各时间点新生骨面积百分比比较(n=4,%，x±s)
Table2.
New bone area ratio in each group at postoperative different time points (n=4,%，x±s)
表3
各组术后各时间点血管计数比较(n=4，x±s)
Table3.
New blood vessel count in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
3 讨论
ANFH常因疼痛影响髋关节功能，最终导致股骨头表面塌陷、骨性关节炎，终末期需行髋关节置换术治疗[13]。目前针对早期，即小区域及未塌陷阶段的ANFH，采取各种保留股骨头的方法进行治疗。
髓芯减压是治疗早期ANFH的常用方法之一，可有效降低股骨头内压，有助于坏死区域内血管再生，但临床有效率报道不一[14]。Buckley等[15]提出，单纯髓芯减压成功率为30%～90%。Steinberg等[16]报道约36%患者于术后30个月需行全髋关节置换，成功率因术前坏死阶段及坏死范围不同而异。研究者认为髓芯减压失败可能是由于病损区成骨细胞缺乏，导致单纯髓芯减压并不能提升坏死区骨的再生能力[17-18]。另有学者研究发现 [19-20]，ANFH患者坏死股骨头内前体细胞增殖能力减低。成骨细胞缺乏是导致坏死的原因之一，因此增加前体细胞数量成为治疗ANFH的潜在目标。
BMSCs来源于发育期中胚层，存在于骨髓组织中，是一种多分化潜能的祖细胞，容易收集及体外扩增，其分化受多种生长因子调控，成骨能力确切，并且来源广泛，取材简便，对机体创伤小，在骨缺损修复中具有重要作用。自体BMSCs移植很少发生免疫排斥反应，具有自我更新能力、很强的黏附性、可塑性及快速增殖形成克隆的能力，是骨组织工程最佳种子细胞来源之一[3-5]。
L-PRP是通过离心从自体血中提取的白细胞和血小板浓缩物，含有丰富的纤维蛋白网络，可用作组织工程支架材料，同时又富含各种生长因子，包括PDGF、TGF-β、VEGF、IGF、EGF等，可刺激细胞增殖、合成与代谢。血小板还可释放一些炎性抑制因子如：IL-1受体拮抗剂、可溶性TNF受体Ⅰ和Ⅱ、IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ等，可抑制IL-1β引起的炎性反应，保护细胞免受炎性反应损伤。白细胞在机体微生物防御反应中发挥重要作用，可直接或间接杀灭或抑制病原菌，控制感染[6]。目前对L-PRP促进骨再生的能力尚存在争议，部分学者[21-22]认为L-PRP能够促进骨再生，加速骨缺损修复；然而部分学者[23-24]在动物骨缺损模型中发现，L-PRP对骨再生无明显促进作用；另外还有些学者[8-9]通过体外实验认为L-PRP可促进BMSCs增殖，但对其成骨分化具有抑制作用。
Chen等[25]报道中等浓度L-PRP（2.65±0.20） × 109个/ mL具有促进BMSCs成骨分化，并抑制向脂肪分化的作用，然而高浓度L-PRP（8.21± 0.40） ×109 个 / mL则抑制BMSCs成骨分化。Aghaloo 等[23]则认为低浓度L-PRP（0.85±0.16） ×109个 / mL 和高浓度L-PRP（8.0±0.5）×109个/mL均无促BMSCs成骨分化的作用，认为L-PRP浓度与其生物学作用无明显关联。Thorwarth等 [26]则发现较高浓度L-PRP（约正常血的6.5倍）较低浓度L-PRP（约4.1 倍）成骨作用更好。
本研究显示在兔ANFH模型中，髓芯减压联合BMSCs及L-PRP相对于单纯髓芯减压或髓芯减压联合L-PRP或BMSCs能更有效促进骨再生及缺损坏死区修复。本研究中C组单纯联合BMSCs的成骨作用优于B组单纯联合L-PRP，考虑原因可能是坏死股骨头缺乏足够的前体细胞及前体细胞增殖能力减弱，导致B组股骨头内骨再生能力减低；同时L-PRP凝胶可有效减少植入物流失，增加了BMSCs及L-PRP的利用率。本研究发现L-PRP可有效促进骨形成，然而最佳L-PRP及生长因子浓度尚需深入研究。
综上述，髓芯减压联合BMSCs及L-PRP较单纯髓芯减压或髓芯减压联合BMSCs或L-PRP对早期兔ANFH模型具有更好的治疗作用；L-PRP对BMSCs具有促成骨分化作用，为髓芯减压联合BMSCs及L-PRP移植治疗早期ANFH奠定了理论基础。
股骨头缺血性坏死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常见疾病，各种治疗方法在于延缓或阻止早期坏死进展，避免晚期行人工关节置换，但均存在一定不足[1-2]。BMSCs是一种具有自我更新及多种分化潜能的细胞，能分泌多种成骨活性因子，是组织工程常用种子细胞[3-5]。富白细胞和血小板血浆（leucocyte-and platelet-rich plasma，L-PRP）是通过离心法从外周血分离出的白细胞和血小板浓缩物，含有丰富的纤维蛋白网络、各种生长因子及炎性反应抑制因子，具有促进组织修复、抑制炎性反应、控制感染和构建生物支架的潜能[6]。目前关于L-PRP对BMSCs成骨分化的作用尚存在争议[7-9]。本实验旨在通过动物实验探索L-PRP在ANFH模型中对BMSCs成骨分化的影响，为BMSCs联合L-PRP治疗ANFH奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4～6月龄新西兰大白兔24只，体重2.0～ 3.0 kg，雌雄不拘，由安徽医科大学动物实验室提供。DMEM/F12培养基（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；胰蛋白酶（上海鼎国生物技术有限公司）；牛凝血酶、CD29、CD31、CD45及CD90单抗（Sigma公司，美国）。CO2孵箱（Harris公司，美国）；Airtech无菌超净工作台（苏州富泰洁净系统有限公司）；常温超速离心机（Thermofisher公司，美国）；普通光学显微镜、倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus5.0计算机图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）；MDGS图像分析系统（Zeiss公司，德国）。
1.2 实验方法
实验动物随机分成A、B、C、D 4组（n=6）。A组：单纯行髓芯减压；B组：髓芯减压联合L-PRP移植；C组：髓芯减压联合BMSCs移植；D组：髓芯减压联合BMSCs及L-PRP移植。
1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定
取C、D组实验动物，于双侧髂后上嵴穿刺抽取骨髓6 mL，缓慢转入至离心管内（含淋巴细胞分离液2 mL），以离心半径13.5 cm、2 000 r/min离心25 min；采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心去除红细胞等纯化处理后，收集单核细胞层，洗涤2次，加至25 cm2培养瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基，于37℃、5%CO2孵箱内培养。48 h后换液，弃悬浮的单个核细胞及培养液，倒置相差显微镜下见散在贴壁，呈梭形、球形或菱形的细胞。每隔3～4 d换液1次，至细胞长满至80%时，按1∶2比例传代；第2代传第3代时，取部分细胞接种于装有载玻片的6孔板，预留检测细胞表型；其余第3代细胞继续培养备用。细胞移植前以0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心5 min，计数细胞，配制成6×106 个 /mL细胞悬液。
细胞表型鉴定：弃6孔板培养液，PBS冲洗2遍，加入胰蛋白酶消化成细胞悬液，移至离心管，以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心5 min，弃上清。PBS洗2次后3%多聚甲醛垂悬。4℃固定30 min，2%牛血清白蛋白封闭，加入CD29、 CD31、CD45 及CD90单抗孵育60 min，流式细胞仪检测细胞表型。
1.2.2 L-PRP及其凝胶制备
采用Landesberg方法[10]制备L-PRP。取B、D组实验动物，于耳背动脉抽取5 mL血液移至肝素抗凝管，以200×g离心10 min，在超净台内用枪头吸取全部上清液及白膜层，加入离心管中，以200×g离心10 min，弃3/4上清，剩余0.5 mL即为L-PRP。取L-PRP光镜下计数血小板，约（1 053.17±129.65）×109个/L。取5 000 U牛凝血酶溶解于5 mL 10% CaCl2溶液调配牛凝血酶溶液，取L-PRP或BMSCs/L-PRP混合物与牛凝血酶溶液以体积比（V/V）为1∶0.167混合，制备L-PRP或BMSCs/L-PRP凝胶。
1.2.3 ANFH动物模型制备
采用文献[11]方法制备ANFH动物模型。取24只实验动物，3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，取髋关节前外侧切口，显露股骨头及股骨颈前上部，行Light Bulb手术。在软骨与骨交界处，以3.5 mm 电钻头向股骨头前内侧钻孔，深4.0 mm。刮匙向内侧潜行刮除部分股骨头松质骨至软骨下骨，占股骨头总体积的50%～60%，模拟骨坏死行病灶清理术；干纱布保护股骨头以外组织，用沾有液氮的棉球即刻填塞于缺损区冷冻，连续冷冻25次，每次约8 s，共持续约3 min，使骨细胞和骨髓细胞坏死，生理盐水复温，制备ANFH动物模型。
1.2.4 ANFH动物模型修复方法
A组：ANFH动物模型制备后即刻缝合切口。B组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL L-PRP按上述方法制备L-PRP凝胶（血小板数约5.25×107个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。C组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL BMSCs悬液（BMSCs数约3×105个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。D组：ANFH动物模型制备后，吸取50 μL L-PRP及50 μL BMSCs混匀后按上述方法制备L-PRP/BMSCs凝胶（血小板数约5.25×107个，BMSCs数约3×105个）植入缺损区，骨蜡封闭骨孔，缝合切口。术后连续3 d臀大肌肌肉注射硫酸庆大霉素，2 mL/只，每日1次。
1.3 观测指标
1.3.1 X线片评价
术后2、4、8周，实验动物以3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉后取仰卧位，摄髋关节正位X线片，观察髋关节和骨缺损灶骨密度变化，并行Lane-Sandhu X线评分评价成骨情况[12]。
1.3.2 组织学观测
摄片后，每组随机取2只实验动物处死，取股骨头标本，10%甲醛固定48 h，5%～7%硝酸溶液脱钙2周，沿冠状面切开标本，常规石蜡包埋，连续切片，厚5 μm，HE染色，光镜下观察ANFH修复情况。每张切片在100倍镜下随机取10个视野，行血管计数，取均值。采用Image-Pro Plus5.0计算机图像分析系统在100倍镜下观察，应用MDGS图像分析系统采集图像并分析，计算新生骨在骨缺损区所占面积百分比。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs分离培养及鉴定
第3代细胞培养5 d，倒置相差显微镜下呈贴壁梭形生长（图 1）。流式细胞仪检测示，CD31、CD45表达阴性，CD29及CD90表达阳性（图 2），表明传代培养的细胞为BMSCs。
图1
第3代细胞培养5 d，倒置相差显微镜观察细胞形态 ⓐ ×100 ⓑ ×400 图 2 流式细胞仪鉴定 ⓐ CD31 ⓑ CD45 ⓒ CD29 ⓓ CD90
Figure1.
Morphological observation of BMSCs at passage 3 after cultured for 5 days under inverted phase contrast microscope ⓐ ×100 ⓑ ×400 Fig. 2 Identification of BMSCs by flow cytometry ⓐ CD31 ⓑ CD45 ⓒ CD29 ⓓ CD90
2.2 动物实验
2.2.1 一般情况
所有动物无死亡，术后当天开始进食，伤口Ⅰ期愈合。
2.2.2 X线片评价
术后2周，各组缺损区均呈现低密度，C、D组缺损区密度较A、B组增高。4周，A组缺损区密度较2周时稍增高，边缘骨小梁出现结构紊乱；B组缺损区密度稍增高，边缘密度亦有所增高；C组缺损区密度较A、B组增高，但不及D组；D组缺损区密度进一步增高，有散在骨小梁出现，边缘高密度，形成硬化线。8周，A组软骨下出现明显囊性变；B组缺损区密度较4周时增高，边缘密度增高明显；C组缺损区密度进一步增高，可见散在骨小梁结构；D组缺损区与正常区无明显区别，有正常骨小梁结构。见图 3。Lane-Sandhu X线评分示：术后2、4、8周C、D组成骨明显优于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组优于C组，B组优于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
图3
术后各时间点各组X线片 ⓐ A组术后2周 ⓑ A组术后4周 ⓒ A组术后8周 ⓓ B组术后2周 ⓔ B组术后4周 ⓕ B组术后8周 ⓖ C组术后2周 ⓗ C组术后4周 ⓘ C组术后8周 ⓙ D组术后2周 ⓚ D组术后4周 ⓛ D组术后8周
Figure3.
X-ray films in each group at different time points after operation ⓐ Group A at 2 weeks ⓑ Group A at 4 weeks ⓒ Group A at 8 weeks ⓓ Group B at 2 weeks ⓔ Group B at 4 weeks ⓕ Group B at 8 weeks ⓖ Group C at 2 weeks ⓗ Group C at 4 weeks ⓘ Group C at 8 weeks ⓙ Group D at 2 weeks ⓚ Group D at 4 weeks ⓛ Group D at 8 weeks
表1
各组术后各时间点X线评分比较(n=4，x±s)
Table1.
X-ray score in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
2.2.3 组织学观测
A组：术后2周缺损区可见零星成骨细胞，周边及负重区骨小窝内细胞萎缩，大量纤维组织充填；4周，周边有新骨形成，中心部为疏松的纤维肉芽组织，空骨陷窝增多；8周，周边为逐渐形成的骨壁，中心部为纤维组织，无骨组织充填，并可见软骨与软骨下骨分离，骨小梁断裂等坏死征象。B组：术后2周缺损区可见少量成骨细胞，大量纤维组织充填，周边少量成骨反应；4周，周边有少量成骨反应，新生组织向中心部长入；8周，周边为骨形成带，中央部新生骨稀疏，排列紊乱。C组：术后2周缺损区内有较多成骨细胞，周边有类骨质及新生骨小梁出现；4周，缺损区有较多骨小梁及类骨质填充；8周，出现比较成熟的骨小梁及骨髓组织。D组：术后2周缺损区内可见大量成骨细胞，周边可见新生骨小梁及原始毛细血管形成；4周，缺损区新生骨小梁板层状或编织状，毛细血管丰富，但修复尚不均匀；8周，缺损区可见成熟的骨小梁变宽变粗，排列规则。见图 4。
图4
术后各时间点各组组织学观察（HE×100） ⓐ A组术后2周 ⓑ A组术后4周 ⓒ A组术后8周 ⓓ B组术后2周 ⓔ B组术后4周 ⓕ B组术后8周 ⓖ C组术后2周 ⓗ C组术后4周 ⓘ C组术后8周 ⓙ D组术后2周 ⓚ D组术后4周 ⓛ D组术后8周
Figure4.
Histological observation in each group at different time points after operation (HE×100) ⓐ Group A at 2 weeks ⓑ Group A at 4 weeks ⓒ Group A at 8 weeks ⓓ Group B at 2 weeks ⓔ Group B at 4 weeks ⓕ Group B at 8 weeks ⓖ Group C at 2 weeks ⓗ Group C at 4 weeks ⓘ Group C at 8 weeks ⓙ Group D at 2 weeks ⓚ Group D at 4 weeks ⓛGroup D at 8 weeks
修复区内骨形态计量与血管计数：术后2、4、8周，C、D组新生骨面积百分比及血管计数明显优于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组优于C组，B组优于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2、3。
表2
各组术后各时间点新生骨面积百分比比较(n=4,%，x±s)
Table2.
New bone area ratio in each group at postoperative different time points (n=4,%，x±s)
表3
各组术后各时间点血管计数比较(n=4，x±s)
Table3.
New blood vessel count in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
3 讨论
ANFH常因疼痛影响髋关节功能，最终导致股骨头表面塌陷、骨性关节炎，终末期需行髋关节置换术治疗[13]。目前针对早期，即小区域及未塌陷阶段的ANFH，采取各种保留股骨头的方法进行治疗。
髓芯减压是治疗早期ANFH的常用方法之一，可有效降低股骨头内压，有助于坏死区域内血管再生，但临床有效率报道不一[14]。Buckley等[15]提出，单纯髓芯减压成功率为30%～90%。Steinberg等[16]报道约36%患者于术后30个月需行全髋关节置换，成功率因术前坏死阶段及坏死范围不同而异。研究者认为髓芯减压失败可能是由于病损区成骨细胞缺乏，导致单纯髓芯减压并不能提升坏死区骨的再生能力[17-18]。另有学者研究发现 [19-20]，ANFH患者坏死股骨头内前体细胞增殖能力减低。成骨细胞缺乏是导致坏死的原因之一，因此增加前体细胞数量成为治疗ANFH的潜在目标。
BMSCs来源于发育期中胚层，存在于骨髓组织中，是一种多分化潜能的祖细胞，容易收集及体外扩增，其分化受多种生长因子调控，成骨能力确切，并且来源广泛，取材简便，对机体创伤小，在骨缺损修复中具有重要作用。自体BMSCs移植很少发生免疫排斥反应，具有自我更新能力、很强的黏附性、可塑性及快速增殖形成克隆的能力，是骨组织工程最佳种子细胞来源之一[3-5]。
L-PRP是通过离心从自体血中提取的白细胞和血小板浓缩物，含有丰富的纤维蛋白网络，可用作组织工程支架材料，同时又富含各种生长因子，包括PDGF、TGF-β、VEGF、IGF、EGF等，可刺激细胞增殖、合成与代谢。血小板还可释放一些炎性抑制因子如：IL-1受体拮抗剂、可溶性TNF受体Ⅰ和Ⅱ、IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ等，可抑制IL-1β引起的炎性反应，保护细胞免受炎性反应损伤。白细胞在机体微生物防御反应中发挥重要作用，可直接或间接杀灭或抑制病原菌，控制感染[6]。目前对L-PRP促进骨再生的能力尚存在争议，部分学者[21-22]认为L-PRP能够促进骨再生，加速骨缺损修复；然而部分学者[23-24]在动物骨缺损模型中发现，L-PRP对骨再生无明显促进作用；另外还有些学者[8-9]通过体外实验认为L-PRP可促进BMSCs增殖，但对其成骨分化具有抑制作用。
Chen等[25]报道中等浓度L-PRP（2.65±0.20） × 109个/ mL具有促进BMSCs成骨分化，并抑制向脂肪分化的作用，然而高浓度L-PRP（8.21± 0.40） ×109 个 / mL则抑制BMSCs成骨分化。Aghaloo 等[23]则认为低浓度L-PRP（0.85±0.16） ×109个 / mL 和高浓度L-PRP（8.0±0.5）×109个/mL均无促BMSCs成骨分化的作用，认为L-PRP浓度与其生物学作用无明显关联。Thorwarth等 [26]则发现较高浓度L-PRP（约正常血的6.5倍）较低浓度L-PRP（约4.1 倍）成骨作用更好。
本研究显示在兔ANFH模型中，髓芯减压联合BMSCs及L-PRP相对于单纯髓芯减压或髓芯减压联合L-PRP或BMSCs能更有效促进骨再生及缺损坏死区修复。本研究中C组单纯联合BMSCs的成骨作用优于B组单纯联合L-PRP，考虑原因可能是坏死股骨头缺乏足够的前体细胞及前体细胞增殖能力减弱，导致B组股骨头内骨再生能力减低；同时L-PRP凝胶可有效减少植入物流失，增加了BMSCs及L-PRP的利用率。本研究发现L-PRP可有效促进骨形成，然而最佳L-PRP及生长因子浓度尚需深入研究。
综上述，髓芯减压联合BMSCs及L-PRP较单纯髓芯减压或髓芯减压联合BMSCs或L-PRP对早期兔ANFH模型具有更好的治疗作用；L-PRP对BMSCs具有促成骨分化作用，为髓芯减压联合BMSCs及L-PRP移植治疗早期ANFH奠定了理论基础。
