引用本文： 莫翠萍, 任力杰, 赵振富, 周光前, 姚晓璐, 龚飞鹏, 陈钢. BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤效果及局部细胞因子表达变化. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(3): 265-271. doi: 10.7507/1002-1892.20160054 复制
脊髓损伤的病理生理过程包括两个阶段：原发性损伤（物理机械性损伤）和继发性损伤，继发性损伤是原发性损伤后短期内局部缺血和炎性反应造成的脊髓神经组织再次损伤。继发性损伤后会出现局部缺血，大量神经细胞坏死、免疫炎性反应、氧自由基释放、离子通道紊乱、星形胶质细胞胶质化、幸存的轴突发生脱髓鞘改变等[1]。这一系列继发性损伤又通过细胞分子水平的级联放大作用，导致原发性损伤再次扩大[2]。内源性修复和机体的再生机制可减轻继发性损伤，主要通过星形胶质细胞胶质化、血管再生、重建损伤的神经环路等达到修复效果[3]。因此，控制脊髓继发性损伤炎性因子的分泌为脊髓损伤再生修复研究提供了一个潜在的切入点。
BMSCs具有多向分化潜能，通过外源移植可替代脊髓损伤丢失的神经细胞，又因其可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和成肌细胞，且具有较低的免疫原性与免疫抑制性，在干细胞移植治疗脊髓损伤研究中具有较广阔的应用前景。本研究通过Allen撞击装置制备大鼠T9、10脊髓损伤模型，检测BMSCs移植治疗后相关神经标志物的表达情况，同时采用抗体芯片技术检测局部细胞因子表达变化，从细胞分泌方面进一步探讨脊髓损伤修复的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级8周龄雌性SD大鼠15只，体质量250～300 g，由广东省医学动物实验中心提供。L-DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、FBS（GIBCO公司，美国）；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗体、兔抗神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗体、鼠抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、Alexa Fluor 94驴抗兔IgG（H+L）荧光抗体、AlexaFluor 594驴抗鼠IgG（H+L）荧光抗体（Abcam公司，英国）；Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG（H+L）荧光抗体（Invitrogen公司，美国）；戊巴比妥钠（Ekear公司，美国）。RayBiotech抗体芯片AAR-CYT-1-8（RayBiotech公司，美国）。荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ImageJ 2X软件（Rawak software公司，德国）。
1.2 大鼠BMSCs分离培养及鉴定
取3只大鼠，腹腔注射过量2%戊巴比妥钠处死。取双侧股骨，剔除骨表面肌肉及软组织，PBS洗3次，用注射器抽取L-DMEM培养基，插入骨髓腔中冲出骨髓液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换培养液，弃除漂浮骨组织、软组织及血细胞等杂细胞。之后根据细胞生长情况，2～3 d更换培养液，待8～10 d细胞融合至80%左右进行传代。经倒置相差显微镜观察细胞形态以及流式细胞仪检测细胞表面标记物，鉴定培养细胞为BMSCs。
1.3 BMSCs标记及观察
取5μL腺病毒rAd-EGFP（1×1010 PFU/mL，由深圳百恩维生物科技有限公司构建），稀释于2 mL L-DMEM培养基中，感染复数为100。取第5代BMSCs，取5×105个接种于直径为6 cm的细胞培养皿，待细胞充分贴壁铺展开后，加入稀释的腺病毒rAd-EGFP以及2μL Polybrene助转剂（8 mg/mL）。37℃培养箱中孵育1 h，弃病毒液，更换完全培养基进行培养。转染后荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况。
1.4 动物模型制备及分组
取12只大鼠根据处理方法不同，随机分为实验组及对照组，每组6只。两组大鼠以腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉后，俯卧四肢固定。沿T10处正中线作长约3 cm纵切口，逐层切开暴露棘突、椎板和横突。确定T10椎体位置，分别暴露其上、下棘突及椎板，用咬骨钳咬除棘突、椎板，暴露T10脊髓。用改良Allen撞击装置制备脊髓损伤模型，具体步骤：用拉钩拉开脊髓两侧软组织，使质量为40 g的撞击棒从5 cm高套管内自由落体，致伤能量200 g·cm。造模成功标准[4]：硬脊膜保持完整且呈紫红色，撞击后脊髓组织出现水肿出血、膨胀，大鼠尾巴偶出现痉挛性摆动。两组大鼠均造模成功。
模型制备后，实验组用胰岛素注射器吸取10 μL标记的BMSCs（1×106个），分别于脊髓损伤头、尾侧2 mm处注射，留针1 min。对照组同法注射10μL PBS。常规分层缝合切口。术后7 d内每日腹腔注射庆大霉素，预防感染；人工排尿直至大鼠恢复自主排尿。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
术后观察大鼠存活、切口愈合以及饮食等情况。观察两组大鼠肢体运动功能恢复情况，于术后即刻及1、2、3、4、5周采用BBB评分法进行运动功能评分。
1.5.2 组织学观察
术后5周，腹腔注射过量2%戊巴比妥钠处死两组大鼠，4%多聚甲醛全身灌注固定。各组取4只大鼠标本进行组织学及免疫荧光染色观察。以原切口入路，取损伤脊髓样本分别进行冠状面、横断面切片。取部分切片行HE染色，镜下观察损伤脊髓愈合程度与细胞排列等情况。
1.5.3 免疫荧光染色观察
术后5周，两组切片用3% H2O2作用30 min消除组织内过氧化物酶，PBS洗3次。1%牛血清白蛋白与0.3%Triton X-100室温孵育1 h进行封闭及细胞透化。一抗工作液用1%牛血清白蛋白稀释抗体，稀释比分别为Nestin 1:200、Neu N 1:500、GFAP 1:500；加入一抗工作液，放入湿盒内，置于4°C冰箱孵育过夜。取出玻片，常温中复温30 min，滴加与一抗来源配对的1:500比例稀释的荧光二抗，室温避光孵育1 h，PBS冲洗3次，封片。荧光显微镜下观察Nestin、NeuN、GFAP表达情况，采用ImageJ 2X软件检测荧光表达量。
1.5.4 抗体芯片技术检测脊髓损伤治疗后细胞因子表达差异
术后5周，实验组及对照组各取1只大鼠，原切口入路取损伤脊髓约0.5 cm，将脊髓组织蛋白样品置于细胞冻存管后液氮保存，进行细胞因子抗体芯片检测。采用RayBiotech抗体芯片AAR-CYT-1-8检测19个细胞因子表达量，并计算实验组及对照组比值；包括：中性粒细胞趋化因子2 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 2，CINC-2)、CINC-3、睫状肌营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF)、炎性内皮趋化因子（Fractaline）、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-mac rophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、脂多糖趋化因子（lipopolysaccharide chemotactic factor，LIX）、瘦素（Leptin）、单核细胞趋化蛋白1 (chemoattractant protein 1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α）、β-NGF、基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)、TNF-α、VEGF。以变化倍数（实验组/对照组）> 1.5以及< 0.7作为存在差异的阈值。
1.6 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs标记观察
荧光显微镜下观察，经过腺病毒rAd-EGFP转染后的BMSCs大部分携带绿色荧光蛋白，转染率达60%以上（图 1）。
图1
荧光显微镜观察转染后BMSCs（×200） 图 2术后5周两组大鼠脊髓组织学观察（HE×40）箭头示损伤中心 ⓐ 对照组横断面 ⓑ 实验组横断面 ⓒ 对照组冠状面 ⓓ 实验组冠状面 图 3术后5周两组免疫荧光染色观察（×200） ⓐ 对照组Nestin表达 ⓑ 实验组Nestin表达 ⓒ 对照组NeuN表达 ⓓ 实验组NeuN表达 ⓔ 对照组GFAP表达 ⓕ 实验组GFAP表达 图 4两组细胞因子表达差异情况 1: CNTF 2: TIMP-1 3：IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ⓐ 对照组 ⓑ 实验组
Figure1.
BMSCs observation under fluorescence microscope after transfection (×200) Fig. 2 Histological observation of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (HE×40) Arrow indicated the injury site ⓐ Transverse section in the control group ⓑ Transverse section in the experimental group ⓒ Coronal section in the control group ⓓ Coronal section in the experimental group Fig. 3 Immunofluorescent staining of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (×200) ⓐ Nestin expression in the control group ⓑ Nestin expression in the experimental group ⓒ NeuN expression in the control group ⓓ NeuN expression in the experimental group ⓔ GFAP expression in the control group ⓕ GFAP expression in the experimental group Fig. 4 Expressions of cytokines in 2 groups 1: CNTF 2: TIMP-1 3: IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ⓐ Control group ⓑ Experimental group
2.2 一般情况
术后5周实验组及对照组各2只大鼠因尿路感染死亡，其余大鼠均存活至实验完成。两组存活大鼠切口均愈合良好，表皮平整，切口处肌肉汇合生长，覆盖损伤的脊髓。
术后对照组大鼠肢体运动功能逐渐恢复，但4周后无显著提高；而实验组大鼠5周内运动功能呈逐步恢复趋势，且优于对照组。除术后即刻两组BBB评分比较差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余各时间点实验组均显著高于对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点两组大鼠BBB评分比较（n=4，2.3 组织学观察
术后5周，实验组脊髓灰质结构较紊乱，细胞排列稍不整齐，有较小坏死区形成的空洞，但白质部分保持完整，瘢痕组织较少，脊髓组织结构均较清晰。对照组可见灰质几乎全部被破坏，并形成巨大的空腔，完整的细胞结构较少，瘢痕组织较实验组多，其白质区范围也较实验组窄，结构较紊乱。见图 2。
2.4 免疫荧光染色观察
术后5周，对照组仅见少量Nestin、NeuN阳性细胞，实验组Nestin、NeuN阳性细胞均较对照组明显增加；对照组GFAP阳性细胞胞体变大、粗短增生；实验组GFAP阳性细胞呈清晰细长丝状。见图 3。
实验组Nestin、NeuN荧光表达量分别为0.259±0.055、0.240±0.040，较对照组0.064±0.011、0.030±0.002显著增加，比较差异有统计学意义（t=6.072，P=0.004；t=7.469，P=0.002）。而实验组GFAP荧光表达量为0.161±0.022，较对照组0.285±0.059显著降低，比较差异有统计学意义（t=3.398，P=0.027）。
2.5 脊髓损伤治疗后细胞因子表达检测
筛选结果显示，19个细胞因子中6个表达存在差异，分别为Leptin、CNTF、GM-CSF、TNF-α、IL-1β及TIMP-1（图 4）。其中实验组Leptin、CNTF高于对照组，GM-CSF、TNF-α、IL-1β与TIMP-1低于对照组。见表 2。
表2
19个细胞因子表达情况
Table2.
The expressions of 19 cytokines
3 讨论
研究表明，细胞因子分泌调控BMSCs治疗脊髓损伤作用的机制为：BMSCs进入损伤处，分化为神经相关细胞；同时BMSCs产生神经营养因子，通过旁分泌途径改善损伤脊髓的微环境，促进血管再生、突触再生以及神经环路重建[5]。本研究通过探讨体内脊髓损伤治疗后神经相关标志物的表达情况，以及利用抗体芯片技术检测相关细胞因子分泌情况，提供了外源干细胞进入体内通过调节损伤脊髓中细胞因子的含量，从而稳定修复微环境的证据。
Nestin是分布在细胞质的第Ⅵ类中间丝蛋白，其作为神经干细胞标记物，参与了细胞骨架的构成。在中枢神经系统发育过程中仅在胚胎期表达，出生后便停止表达[6]；同时，当神经干细胞进入成熟阶段分化为神经元或胶质细胞后Nestin表达消失[7]。NeuN作为成熟神经元的特异性标记物，在神经前体细胞迁移完成之前罕见表达，细胞迁移结束后才出现表达[8]。GFAP作为星形胶质细胞的特异性标志物，与神经元的关系十分密切。有研究发现神经元与胶质细胞间存在交叉通讯，如星形胶质细胞可调节神经元的存活及突触功能的活动[9]。辐射状的星形胶质细胞被认为是另一类神经干细胞，其可通过不对称分裂方式产生新的胶质细胞和神经元[10]。
本研究中实验组Nestin表达较对照组明显增加，说明干细胞移植对损伤脊髓组织内神经干细胞的激活有一定作用，这类细胞与脊髓损伤修复密切相关。实验组NeuN表达较对照组亦明显增加，说明干细胞移植对神经元修复具有重要作用。但对照组GFAP表达较实验组明显增加，结合BBB评分结果实验组运动功能恢复优于对照组，说明干细胞移植后对脊髓损伤运动功能恢复有一定作用。干细胞移植后会激起体内神经相关细胞生理生化上的改变，运动神经元虽然大量坏死丢失，但胶质细胞也剧增，在形成胶质瘢痕的同时，胶质细胞本身也释放神经营养因子，协助脊髓再生。
胶质细胞增生为脊髓损伤修复期中持续且普遍存在的标志性病理生理过程，与炎性反应的细胞因子关系密切。这类胶质细胞常出现在损伤区周围，是由急性脊髓损伤后炎性因子激活[11]。在脊髓损伤不同时期，胶质细胞的活化增生也有不同作用。急性损伤后，早期炎性反应较重，胶质细胞大量增生，活化的胶质细胞在阻挡损伤区域扩大上起着积极作用[12]。而中晚期胶质细胞继续活化易形成胶质瘢痕，阻挡神经轴突的再生延长[13]，阻碍了神经环路的重建，造成了神经上、下单元物质信息交流障碍，影响脊髓损伤修复；但与此同时，有部分胶质细胞也释放神经营养因子，对脊髓损伤修复起到积极作用。本研究中对照组GFAP表达量显著高于实验组，即对照组中存在星形胶质细胞增生的现象，导致胶质瘢痕阻碍神经再生修复。苏国辉[14]认为胶质瘢痕中的主要成分硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sul fate proteoglycan，CSPGs）是阻碍轴突再生的化学性屏障。BMSCs移植治疗脊髓损伤可减少胶质瘢痕形成，可能是通过BMSCs分泌神经营养因子中和损伤部位不利因素，如降低星形胶质细胞核内CSPGs表达来减缓胶质瘢痕形成，促进神经再生修复[15]。但有关移植BMSCs分泌的细胞因子减弱胶质瘢痕形成的机制仍需进一步探讨。
炎性反应对脊髓损伤后期修复具有一定影响，炎性反应导致的神经毒性、神经元凋亡坏死等会影响神经再生。本研究比较了脊髓损伤5周后两组脊髓中相关炎性反应细胞因子的表达情况。结果显示，实验组中Leptin与CNTF均较对照组升高。Leptin是一类具有抗炎性作用的细胞因子，在急性炎性刺激的应答中具有时间依赖性[16]。Leptin可降低内毒素诱导的TNF水平，减弱TNF-α诱导的炎性级联反应[17]，上调凋亡基因Bax、Caspase-3表达，减少神经细胞凋亡。CNTF能促使多种神经细胞的存活，是维持脊髓运动神经元存活及突起生长的神经营养因子，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中具有重要作用。脊髓损伤后CNTF可作用于损伤部位的神经元或神经胶质细胞而发挥神经营养作用，它是中枢神经系统的一个损伤修复因子[18]。GM-CSF是一种多效能的细胞因子，一方面可促进粒细胞、巨噬细胞分化成熟，提高机体防御能力，另一方面活化的巨噬细胞可分泌多种促炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，扩大炎性反应，形成炎性瀑布流[19]。对照组脊髓损伤后功能恢复较实验组差，GM-CSF、IL-1β与TNF-α均较实验组升高，说明损伤后导致的炎性级联反应严重阻碍了脊髓修复进程。另外脊髓中枢神经中的胶质细胞可产生炎性因子和趋化因子，调控炎性细胞进入脊髓损伤区域[20]，对照组GFAP高表达与促炎性因子GM-CSF、IL-1β、TNF-α大量存在对脊髓损伤修复过程起到一定的阻碍作用。而实验组中Leptin与CNTF的高水平表达促进了脊髓损伤后神经的再生修复，可能通过减弱TNF-α诱发的炎性瀑布与分泌神经营养因子等方式协助脊髓损伤再生。这些细胞因子参与损伤修复活动可能是由移植的BMSCs产生或是由损伤微环境启动修复机制共同参与作用，具体机制有待进一步明确。
综上述，脊髓损伤后炎性反应引起胶质细胞活化增生产生不利于脊髓修复的微环境，脊髓组织结构受到严重破坏导致细胞大量死亡，炎性因子以及坏死细胞内释放的蛋白酶导致细胞骨架蛋白降解，神经元细胞大量死亡。当外源性BMSCs移植进入损伤区后，释放神经营养因子，对脊髓损伤修复起到积极作用，在合适脊髓修复的胶质增生化程度较低的微环境里，GFAP阳性细胞也会释放神经营养因子协同BMSCs分泌的神经因子促进脊髓修复。BMSCs对脊髓损伤的修复可能是通过胶质细胞与其自身共同合理调节促炎性因子与抗炎性因子的释放，以及分泌相关神经营养因子，从旁分泌途径上达到神经修复的作用，但这些炎性因子在脊髓损伤修复过程中发挥的具体作用机制有待进一步探究。
脊髓损伤的病理生理过程包括两个阶段：原发性损伤（物理机械性损伤）和继发性损伤，继发性损伤是原发性损伤后短期内局部缺血和炎性反应造成的脊髓神经组织再次损伤。继发性损伤后会出现局部缺血，大量神经细胞坏死、免疫炎性反应、氧自由基释放、离子通道紊乱、星形胶质细胞胶质化、幸存的轴突发生脱髓鞘改变等[1]。这一系列继发性损伤又通过细胞分子水平的级联放大作用，导致原发性损伤再次扩大[2]。内源性修复和机体的再生机制可减轻继发性损伤，主要通过星形胶质细胞胶质化、血管再生、重建损伤的神经环路等达到修复效果[3]。因此，控制脊髓继发性损伤炎性因子的分泌为脊髓损伤再生修复研究提供了一个潜在的切入点。
BMSCs具有多向分化潜能，通过外源移植可替代脊髓损伤丢失的神经细胞，又因其可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和成肌细胞，且具有较低的免疫原性与免疫抑制性，在干细胞移植治疗脊髓损伤研究中具有较广阔的应用前景。本研究通过Allen撞击装置制备大鼠T9、10脊髓损伤模型，检测BMSCs移植治疗后相关神经标志物的表达情况，同时采用抗体芯片技术检测局部细胞因子表达变化，从细胞分泌方面进一步探讨脊髓损伤修复的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级8周龄雌性SD大鼠15只，体质量250～300 g，由广东省医学动物实验中心提供。L-DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、FBS（GIBCO公司，美国）；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗体、兔抗神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗体、鼠抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、Alexa Fluor 94驴抗兔IgG（H+L）荧光抗体、AlexaFluor 594驴抗鼠IgG（H+L）荧光抗体（Abcam公司，英国）；Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG（H+L）荧光抗体（Invitrogen公司，美国）；戊巴比妥钠（Ekear公司，美国）。RayBiotech抗体芯片AAR-CYT-1-8（RayBiotech公司，美国）。荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ImageJ 2X软件（Rawak software公司，德国）。
1.2 大鼠BMSCs分离培养及鉴定
取3只大鼠，腹腔注射过量2%戊巴比妥钠处死。取双侧股骨，剔除骨表面肌肉及软组织，PBS洗3次，用注射器抽取L-DMEM培养基，插入骨髓腔中冲出骨髓液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换培养液，弃除漂浮骨组织、软组织及血细胞等杂细胞。之后根据细胞生长情况，2～3 d更换培养液，待8～10 d细胞融合至80%左右进行传代。经倒置相差显微镜观察细胞形态以及流式细胞仪检测细胞表面标记物，鉴定培养细胞为BMSCs。
1.3 BMSCs标记及观察
取5μL腺病毒rAd-EGFP（1×1010 PFU/mL，由深圳百恩维生物科技有限公司构建），稀释于2 mL L-DMEM培养基中，感染复数为100。取第5代BMSCs，取5×105个接种于直径为6 cm的细胞培养皿，待细胞充分贴壁铺展开后，加入稀释的腺病毒rAd-EGFP以及2μL Polybrene助转剂（8 mg/mL）。37℃培养箱中孵育1 h，弃病毒液，更换完全培养基进行培养。转染后荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况。
1.4 动物模型制备及分组
取12只大鼠根据处理方法不同，随机分为实验组及对照组，每组6只。两组大鼠以腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉后，俯卧四肢固定。沿T10处正中线作长约3 cm纵切口，逐层切开暴露棘突、椎板和横突。确定T10椎体位置，分别暴露其上、下棘突及椎板，用咬骨钳咬除棘突、椎板，暴露T10脊髓。用改良Allen撞击装置制备脊髓损伤模型，具体步骤：用拉钩拉开脊髓两侧软组织，使质量为40 g的撞击棒从5 cm高套管内自由落体，致伤能量200 g·cm。造模成功标准[4]：硬脊膜保持完整且呈紫红色，撞击后脊髓组织出现水肿出血、膨胀，大鼠尾巴偶出现痉挛性摆动。两组大鼠均造模成功。
模型制备后，实验组用胰岛素注射器吸取10 μL标记的BMSCs（1×106个），分别于脊髓损伤头、尾侧2 mm处注射，留针1 min。对照组同法注射10μL PBS。常规分层缝合切口。术后7 d内每日腹腔注射庆大霉素，预防感染；人工排尿直至大鼠恢复自主排尿。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
术后观察大鼠存活、切口愈合以及饮食等情况。观察两组大鼠肢体运动功能恢复情况，于术后即刻及1、2、3、4、5周采用BBB评分法进行运动功能评分。
1.5.2 组织学观察
术后5周，腹腔注射过量2%戊巴比妥钠处死两组大鼠，4%多聚甲醛全身灌注固定。各组取4只大鼠标本进行组织学及免疫荧光染色观察。以原切口入路，取损伤脊髓样本分别进行冠状面、横断面切片。取部分切片行HE染色，镜下观察损伤脊髓愈合程度与细胞排列等情况。
1.5.3 免疫荧光染色观察
术后5周，两组切片用3% H2O2作用30 min消除组织内过氧化物酶，PBS洗3次。1%牛血清白蛋白与0.3%Triton X-100室温孵育1 h进行封闭及细胞透化。一抗工作液用1%牛血清白蛋白稀释抗体，稀释比分别为Nestin 1:200、Neu N 1:500、GFAP 1:500；加入一抗工作液，放入湿盒内，置于4°C冰箱孵育过夜。取出玻片，常温中复温30 min，滴加与一抗来源配对的1:500比例稀释的荧光二抗，室温避光孵育1 h，PBS冲洗3次，封片。荧光显微镜下观察Nestin、NeuN、GFAP表达情况，采用ImageJ 2X软件检测荧光表达量。
1.5.4 抗体芯片技术检测脊髓损伤治疗后细胞因子表达差异
术后5周，实验组及对照组各取1只大鼠，原切口入路取损伤脊髓约0.5 cm，将脊髓组织蛋白样品置于细胞冻存管后液氮保存，进行细胞因子抗体芯片检测。采用RayBiotech抗体芯片AAR-CYT-1-8检测19个细胞因子表达量，并计算实验组及对照组比值；包括：中性粒细胞趋化因子2 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 2，CINC-2)、CINC-3、睫状肌营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF)、炎性内皮趋化因子（Fractaline）、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-mac rophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、脂多糖趋化因子（lipopolysaccharide chemotactic factor，LIX）、瘦素（Leptin）、单核细胞趋化蛋白1 (chemoattractant protein 1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α）、β-NGF、基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)、TNF-α、VEGF。以变化倍数（实验组/对照组）> 1.5以及< 0.7作为存在差异的阈值。
1.6 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs标记观察
荧光显微镜下观察，经过腺病毒rAd-EGFP转染后的BMSCs大部分携带绿色荧光蛋白，转染率达60%以上（图 1）。
图1
荧光显微镜观察转染后BMSCs（×200） 图 2术后5周两组大鼠脊髓组织学观察（HE×40）箭头示损伤中心 ⓐ 对照组横断面 ⓑ 实验组横断面 ⓒ 对照组冠状面 ⓓ 实验组冠状面 图 3术后5周两组免疫荧光染色观察（×200） ⓐ 对照组Nestin表达 ⓑ 实验组Nestin表达 ⓒ 对照组NeuN表达 ⓓ 实验组NeuN表达 ⓔ 对照组GFAP表达 ⓕ 实验组GFAP表达 图 4两组细胞因子表达差异情况 1: CNTF 2: TIMP-1 3：IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ⓐ 对照组 ⓑ 实验组
Figure1.
BMSCs observation under fluorescence microscope after transfection (×200) Fig. 2 Histological observation of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (HE×40) Arrow indicated the injury site ⓐ Transverse section in the control group ⓑ Transverse section in the experimental group ⓒ Coronal section in the control group ⓓ Coronal section in the experimental group Fig. 3 Immunofluorescent staining of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (×200) ⓐ Nestin expression in the control group ⓑ Nestin expression in the experimental group ⓒ NeuN expression in the control group ⓓ NeuN expression in the experimental group ⓔ GFAP expression in the control group ⓕ GFAP expression in the experimental group Fig. 4 Expressions of cytokines in 2 groups 1: CNTF 2: TIMP-1 3: IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ⓐ Control group ⓑ Experimental group
2.2 一般情况
术后5周实验组及对照组各2只大鼠因尿路感染死亡，其余大鼠均存活至实验完成。两组存活大鼠切口均愈合良好，表皮平整，切口处肌肉汇合生长，覆盖损伤的脊髓。
术后对照组大鼠肢体运动功能逐渐恢复，但4周后无显著提高；而实验组大鼠5周内运动功能呈逐步恢复趋势，且优于对照组。除术后即刻两组BBB评分比较差异无统计学意义（P > 0.05）外，其余各时间点实验组均显著高于对照组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点两组大鼠BBB评分比较（n=4，2.3 组织学观察
术后5周，实验组脊髓灰质结构较紊乱，细胞排列稍不整齐，有较小坏死区形成的空洞，但白质部分保持完整，瘢痕组织较少，脊髓组织结构均较清晰。对照组可见灰质几乎全部被破坏，并形成巨大的空腔，完整的细胞结构较少，瘢痕组织较实验组多，其白质区范围也较实验组窄，结构较紊乱。见图 2。
2.4 免疫荧光染色观察
术后5周，对照组仅见少量Nestin、NeuN阳性细胞，实验组Nestin、NeuN阳性细胞均较对照组明显增加；对照组GFAP阳性细胞胞体变大、粗短增生；实验组GFAP阳性细胞呈清晰细长丝状。见图 3。
实验组Nestin、NeuN荧光表达量分别为0.259±0.055、0.240±0.040，较对照组0.064±0.011、0.030±0.002显著增加，比较差异有统计学意义（t=6.072，P=0.004；t=7.469，P=0.002）。而实验组GFAP荧光表达量为0.161±0.022，较对照组0.285±0.059显著降低，比较差异有统计学意义（t=3.398，P=0.027）。
2.5 脊髓损伤治疗后细胞因子表达检测
筛选结果显示，19个细胞因子中6个表达存在差异，分别为Leptin、CNTF、GM-CSF、TNF-α、IL-1β及TIMP-1（图 4）。其中实验组Leptin、CNTF高于对照组，GM-CSF、TNF-α、IL-1β与TIMP-1低于对照组。见表 2。
表2
19个细胞因子表达情况
Table2.
The expressions of 19 cytokines
3 讨论
研究表明，细胞因子分泌调控BMSCs治疗脊髓损伤作用的机制为：BMSCs进入损伤处，分化为神经相关细胞；同时BMSCs产生神经营养因子，通过旁分泌途径改善损伤脊髓的微环境，促进血管再生、突触再生以及神经环路重建[5]。本研究通过探讨体内脊髓损伤治疗后神经相关标志物的表达情况，以及利用抗体芯片技术检测相关细胞因子分泌情况，提供了外源干细胞进入体内通过调节损伤脊髓中细胞因子的含量，从而稳定修复微环境的证据。
Nestin是分布在细胞质的第Ⅵ类中间丝蛋白，其作为神经干细胞标记物，参与了细胞骨架的构成。在中枢神经系统发育过程中仅在胚胎期表达，出生后便停止表达[6]；同时，当神经干细胞进入成熟阶段分化为神经元或胶质细胞后Nestin表达消失[7]。NeuN作为成熟神经元的特异性标记物，在神经前体细胞迁移完成之前罕见表达，细胞迁移结束后才出现表达[8]。GFAP作为星形胶质细胞的特异性标志物，与神经元的关系十分密切。有研究发现神经元与胶质细胞间存在交叉通讯，如星形胶质细胞可调节神经元的存活及突触功能的活动[9]。辐射状的星形胶质细胞被认为是另一类神经干细胞，其可通过不对称分裂方式产生新的胶质细胞和神经元[10]。
本研究中实验组Nestin表达较对照组明显增加，说明干细胞移植对损伤脊髓组织内神经干细胞的激活有一定作用，这类细胞与脊髓损伤修复密切相关。实验组NeuN表达较对照组亦明显增加，说明干细胞移植对神经元修复具有重要作用。但对照组GFAP表达较实验组明显增加，结合BBB评分结果实验组运动功能恢复优于对照组，说明干细胞移植后对脊髓损伤运动功能恢复有一定作用。干细胞移植后会激起体内神经相关细胞生理生化上的改变，运动神经元虽然大量坏死丢失，但胶质细胞也剧增，在形成胶质瘢痕的同时，胶质细胞本身也释放神经营养因子，协助脊髓再生。
胶质细胞增生为脊髓损伤修复期中持续且普遍存在的标志性病理生理过程，与炎性反应的细胞因子关系密切。这类胶质细胞常出现在损伤区周围，是由急性脊髓损伤后炎性因子激活[11]。在脊髓损伤不同时期，胶质细胞的活化增生也有不同作用。急性损伤后，早期炎性反应较重，胶质细胞大量增生，活化的胶质细胞在阻挡损伤区域扩大上起着积极作用[12]。而中晚期胶质细胞继续活化易形成胶质瘢痕，阻挡神经轴突的再生延长[13]，阻碍了神经环路的重建，造成了神经上、下单元物质信息交流障碍，影响脊髓损伤修复；但与此同时，有部分胶质细胞也释放神经营养因子，对脊髓损伤修复起到积极作用。本研究中对照组GFAP表达量显著高于实验组，即对照组中存在星形胶质细胞增生的现象，导致胶质瘢痕阻碍神经再生修复。苏国辉[14]认为胶质瘢痕中的主要成分硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sul fate proteoglycan，CSPGs）是阻碍轴突再生的化学性屏障。BMSCs移植治疗脊髓损伤可减少胶质瘢痕形成，可能是通过BMSCs分泌神经营养因子中和损伤部位不利因素，如降低星形胶质细胞核内CSPGs表达来减缓胶质瘢痕形成，促进神经再生修复[15]。但有关移植BMSCs分泌的细胞因子减弱胶质瘢痕形成的机制仍需进一步探讨。
炎性反应对脊髓损伤后期修复具有一定影响，炎性反应导致的神经毒性、神经元凋亡坏死等会影响神经再生。本研究比较了脊髓损伤5周后两组脊髓中相关炎性反应细胞因子的表达情况。结果显示，实验组中Leptin与CNTF均较对照组升高。Leptin是一类具有抗炎性作用的细胞因子，在急性炎性刺激的应答中具有时间依赖性[16]。Leptin可降低内毒素诱导的TNF水平，减弱TNF-α诱导的炎性级联反应[17]，上调凋亡基因Bax、Caspase-3表达，减少神经细胞凋亡。CNTF能促使多种神经细胞的存活，是维持脊髓运动神经元存活及突起生长的神经营养因子，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中具有重要作用。脊髓损伤后CNTF可作用于损伤部位的神经元或神经胶质细胞而发挥神经营养作用，它是中枢神经系统的一个损伤修复因子[18]。GM-CSF是一种多效能的细胞因子，一方面可促进粒细胞、巨噬细胞分化成熟，提高机体防御能力，另一方面活化的巨噬细胞可分泌多种促炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，扩大炎性反应，形成炎性瀑布流[19]。对照组脊髓损伤后功能恢复较实验组差，GM-CSF、IL-1β与TNF-α均较实验组升高，说明损伤后导致的炎性级联反应严重阻碍了脊髓修复进程。另外脊髓中枢神经中的胶质细胞可产生炎性因子和趋化因子，调控炎性细胞进入脊髓损伤区域[20]，对照组GFAP高表达与促炎性因子GM-CSF、IL-1β、TNF-α大量存在对脊髓损伤修复过程起到一定的阻碍作用。而实验组中Leptin与CNTF的高水平表达促进了脊髓损伤后神经的再生修复，可能通过减弱TNF-α诱发的炎性瀑布与分泌神经营养因子等方式协助脊髓损伤再生。这些细胞因子参与损伤修复活动可能是由移植的BMSCs产生或是由损伤微环境启动修复机制共同参与作用，具体机制有待进一步明确。
综上述，脊髓损伤后炎性反应引起胶质细胞活化增生产生不利于脊髓修复的微环境，脊髓组织结构受到严重破坏导致细胞大量死亡，炎性因子以及坏死细胞内释放的蛋白酶导致细胞骨架蛋白降解，神经元细胞大量死亡。当外源性BMSCs移植进入损伤区后，释放神经营养因子，对脊髓损伤修复起到积极作用，在合适脊髓修复的胶质增生化程度较低的微环境里，GFAP阳性细胞也会释放神经营养因子协同BMSCs分泌的神经因子促进脊髓修复。BMSCs对脊髓损伤的修复可能是通过胶质细胞与其自身共同合理调节促炎性因子与抗炎性因子的释放，以及分泌相关神经营养因子，从旁分泌途径上达到神经修复的作用，但这些炎性因子在脊髓损伤修复过程中发挥的具体作用机制有待进一步探究。
