引用本文： 张辉, 王茜, 甘洪全, 史伟, 刘永庆, 张大鹏, 李琪佳, 王志强. 多孔钽复合BMP-7修复兔软骨及软骨下骨缺损的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(7): 836-842. doi: 10.7507/1002-1892.20160171 复制
软骨损伤和缺损是目前世界骨科领域面临的难题之一，治疗方法有骨移植、生物活性支架材料替代、人工假体置换等。骨移植是临床上最常用方法，但自体骨来源有限且会对患者造成二次伤害，同种异体骨可能存在排斥反应和传染疾病等问题。生物活性支架材料的微观结构与松质骨相似，适合于骨的长入和矿化，但力学强度不足，在关节、脊柱等负重较大的部位应用常受到限制[1-2]；医用金属材料强度高、硬度高，韧性、抗疲劳性较好，但弹性模量远高于正常骨，易引起应力遮挡，导致假体松动[3]。而多孔金属钽具有十二面体排列的空间立体微观结构，在其内部具有纵横交错、相互连通的微孔结构，使其具有孔隙率高、弹性模量低及表面摩擦系数高等物理特性；同时，其具有生物相容性好、抗腐蚀能力强以及具备良好骨传导性的生物学特性，使其成为理想的骨缺损修复材料[4]。BMP-7又称成骨蛋白1，是BMP家族中的一员[5]。BMP-7具有很强的异位成骨作用，可在异位诱导新骨形成，在体外能促进软骨细胞增殖，增强软骨细胞外基质合成，促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌，在骨缺损修复及软骨分化过程中发挥重要作用[6-9]。有研究报道，应用腺病毒作为载体将BMP-7基因重组至兔软骨细胞中，将细胞体外培养后植入兔关节软骨缺损模型，发现其软骨缺损修复明显好于未植入细胞的兔关节软骨缺损组[10]。我们的前期研究发现，BMP-7与多孔钽复合后能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质分泌，促进软骨基因表达[11]。本研究进一步将多孔钽与BMP-7复合后，植入兔股骨内髁软骨缺损模型，通过大体观察、组织学观察、扫描电镜、Micro-CT等方法，观察复合物对兔关节软骨及软骨下骨缺损修复的情况，为多孔钽的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年新西兰大耳白兔48只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，由华北理工大学实验动物中心提供。
体内植入的多孔钽件（重庆润泽医疗器械有限公司），采用粉末浇注高温煅烧技术制成直径4 mm、长10 mm的圆柱体，分别按顺序在蒸馏水、丙酮溶液及70%乙醇溶液中超声清洗20 min，蒸馏水清洗、高压蒸汽灭菌后备用。多孔钽表面及断面可见分布均匀的呈立体连通的蜂窝状结构，孔径400～600μm，孔隙率75%～85%。500倍扫描电镜观察可见分布均匀的直径400～600μm的微孔结构，1 000倍扫描电镜下可见微孔直径为50～200μm，且微孔的孔隙间相互连通。见图 1。
图1
多孔钽外观及微观结构观察ⓐ多孔钽外观ⓑ扫描电镜观察（×500）ⓒ扫描电镜观察（×1 000） 图 2术后各时间点各组软骨修复情况大体观察ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周ⓖC组4周ⓗC组8周ⓘC组12周
Figure1.
Appearance and microstructure observation of porous tantalum ⓐGeneral observation ⓑSEM observation (×500) ⓒSEM observation (×1 000) Fig. 2 General observation of cartilage repair after operation ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks ⓔGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks ⓖGroup C at 4 weeks ⓗGroup C at 8 weeks ⓘGroup C at 12 weeks
重组人BMP-7（recombinant human BMP-7，rhBMP-7；ProSpec公司，以色列）。JSM-6030LV扫描电镜（电子株式会社，日本）；Leica1600硬组织切片机（Leica公司，德国）；SP2600铣片机、Minimet1000磨片机（Buehler公司，美国）；eXplore Locus SP型Micro-CT（GE公司，美国）。Advanced Bone Analysis软件（GE Healthcare公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 复合BMP-7多孔钽材料制备
取5 mg rhBMP-7溶入10 mL浓度为6 mol/L的尿素溶液，将多孔钽材料浸入其中，4℃放置12 h，然后冰冻干燥处理，透析除水，氯仿蒸气消毒后备用。
1.2.2 实验分组及方法
取48只新西兰大白兔随机分为3组，分别为复合BMP-7多孔钽组（A组）、多孔钽组（B组）及对照组（C组），每组16只。实验动物以5%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉后，取右侧膝前正中切口，长约2 cm，沿髌骨内缘切开关节囊，将髌骨向外脱出后显露股骨内髁，克氏针钻孔后以直径4 mm钻头沿股骨轴向钻孔，深度约6 mm，制备兔股骨内髁软骨缺损模型。生理盐水冲洗伤口后，A、B组分别植入直径4 mm、长约5 mm的复合BMP-7多孔钽及多孔钽，C组不植入材料。再次冲洗后逐层缝合伤口，术后单笼饲养，允许患肢负重；术后3 d每天用络合碘消毒伤口并肌肉注射青霉素8万U预防感染。每组分别于术后4、8、16周采用空气栓塞法各处死5只实验动物，取出术侧股骨，于股骨髁上0.5 cm处切断，保留带有植入材料的髁部，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 动物术后观察
术后观察动物存活、切口愈合及活动情况。
1.3.2 大体观察
术后各时间点肉眼观察3组软骨缺损部位大体愈合情况，A、B组按软骨缺损修复大体观察评分标准[12-13]评价修复效果。
1.3.3 扫描电镜观察
术后各时间点取出A、B组植入材料，0.1%PBS清洗2遍，叔丁醇梯度脱水，— 10℃冰冻1 h，真空干燥机内干燥，将材料用导电胶固定于铜台上，喷金，扫描电镜观察材料表面软骨组织及骨组织生长情况。
1.3.4 组织学观察
术后各时间点A、B组大体观察后，将植入材料连同周围0.5 cm组织取出，固定、脱水、渗透、包埋、切片，片厚20μm，甲苯胺蓝染色，光镜下观察组织空隙内软骨及骨长入情况和多孔钽周围成骨情况。
1.3.5 Micro-CT观测
术后16周A、B组各随机选取3只动物标本，对多孔钽及周围骨质进行Micro-CT扫描，行三维重建并行骨形态计量学分析，观察并分析各组材料与组织接触界面及周围的骨质情况。取多孔钽材料周围直径5 mm的圆柱状区域为感兴趣区域，设定重建阈值为1 000，采用Advanced Bone Analysis软件分析。软件自动生成的主要参数包括：骨小梁间隙（trabecular bone space，Tb.Sp）、组织骨密度（trabecular mineral density，TMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 动物术后观察
手术均顺利完成，实验动物均于术后3 h内自然苏醒，自行饮水；2 d后进食情况同术前；3～5 d术侧肢体可部分负重，2周后基本恢复正常步态；手术切口均Ⅰ期愈合，缝线自行脱落。共有5只动物（A组1只、B组2只、C组2只）因腹泻死亡，后期均予以补齐。
2.2 大体观察
A组术后4周可见缺损区域植入材料表面出现少量软骨样组织，8、16周缺损部位逐渐被新生软骨组织完全覆盖，表面平整光滑；B组术后4周缺损区域植入材料表面未见新生软骨组织，8、16周缺损部位也逐渐覆盖新生软骨组织，但表面不平整，修复程度较A组差；C组术后4、8、16周缺损区均未修复，表面逐渐被纤维组织填充。见图 2。除术后4周A、B组软骨缺损修复大体观察评分比较差异无统计学意义（P > 0.05）外，术后8、16周A组评分均高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点A、B组软骨缺损修复大体观察评分比较（n=5，2.3 扫描电镜观察
术后4周，A、B组材料表面均可见少量钙盐沉积及新生软骨和成骨细胞，成骨细胞通过伪足附着于多孔钽表面，孔隙内有少量新生骨组织长入，但B组材料表面钙盐沉积及新生软骨和成骨细胞较A组少。8、16周，A组材料表面逐渐出现较多钙盐沉积，新生软骨及成骨细胞连接成片状，细胞外基质逐渐覆盖多孔钽表面，孔隙内出现大量新生骨组织长入；B组材料表面钙盐沉积数量及细胞外基质覆盖度均不及A组。见图 3。
图3
术后各时间点A、B组扫描电镜观察（×1 000）ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周 图 4术后各时间点A、B组组织学观察（甲苯胺蓝×200）ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周
Figure3.
SEM observation of scaffolds in groups A and B after operation (×1 000) ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks δGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks Fig. 4 Histological observation in groups A and B after operation (Toluidine blue×200) ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks ⓔGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks
2.4 组织学观察
甲苯胺蓝染色示，术后4周，A、B组宿主骨断端界面均可见少量新生软骨和成骨细胞，多孔钽表面成骨细胞附着较少，骨组织部分结合多孔钽表面。8周，A、B组多孔钽界面新生软骨及骨组织均明显增加，新生骨小梁出现并向多孔钽孔隙内生长，两组软骨缺损区域已部分被新生软骨样组织覆盖，新生软骨组织与多孔钽结合较为紧密。4、8周时，A组多孔钽表面新生软骨和成骨细胞较B组多。16周，A、B组多孔钽表面紧密附着大量新生骨组织，无纤维包囊，较多骨小梁向多孔钽孔隙内生长，并与周围皮质骨相连；A组软骨缺损区域已完全被新生软骨组织覆盖，新生软骨组织与多孔钽结合非常紧密，与周围正常软骨组织结合在一起，B组软骨缺损区域大部分被新生软骨组织覆盖。见图 4。
2.5 Micro-CT观测
术后16周，A组TMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均高于B组，Tb.Sp低于B组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
术后16周A、B组材料骨形态计量学分析结果（n=5，3 讨论
软骨及软骨下骨的损伤和缺损是骨科领域难题之一，骨移植材料替代是目前治疗软骨缺损的方法之一。适宜的骨移植材料不仅需要具有通透的空间结构、合适的力学特性，还需有一定的骨诱导性，即良好的骨长入特性；同时，软骨缺损多伴有软骨下骨损伤，因此适宜的软骨缺损修复材料除具备上述性能外，还应为软骨下骨缺损提供良好支撑，为软骨损伤修复提供支撑平台。
多孔钽材料因具有良好的生物相容性、较高的孔隙率（75%～80%）、适合骨组织长入的孔径大小（400～600μm）及与人体松质骨相似的弹性模量（0.2～0.5 GPa），也被称作“金属小梁”，其良好的空间三维立体结构利于骨组织长入，并可为细胞、血管、组织代谢产物及营养物质运输提供有利的空间环境[14]。有研究发现多孔钽具备良好的组织相容性及骨长入特性[15]，在国内外关节置换或翻修术后骨缺损、股骨头缺血性坏死后骨缺损等中多有应用[16]。但多孔钽作为金属小梁，其金属特性制约了骨诱导性。为改善多孔钽的生物活性、加速骨长入时间，有研究者采用生物活性因子（如BMP系列因子）与材料相结合，可有效提高材料的生物活性，促进细胞成骨分化，如BMP-7可诱导未分化MSCs向软骨细胞和成骨细胞方向分化，在骨缺损修复过程中发挥重要作用[6-7]。目前多为多孔材料复合生物活性因子对成骨方面的研究[17]，对软骨缺损修复的报道较少见。鉴于此，本研究采用多孔钽材料与BMP-7复合后植入兔股骨内髁软骨缺损模型，通过大体观察、组织学、扫描电镜等方法，观察多孔钽与BMP-7复合后对兔关节软骨及软骨下骨缺损修复的情况。
本研究成功建立了兔股骨内髁软骨缺损模型，软骨缺损区域选择股骨内髁负重区，因软骨负重区是临床疾病好发部位，选取股骨内髁负重区较符合临床实验研究特点。Shapiro等[18]认为缺损直径< 3 mm，深度达不到软骨下骨，6周后可自行部分或全部修复，故本研究中软骨缺损区域直径为4 mm；而兔软骨厚度为1～2 mm，深度达3 mm才能损伤全层软骨，因此造模深度设定为5 mm。结果显示，对照组术后各时间点软骨缺损区域均仅被纤维组织及纤维软骨覆盖，未得到自行修复，而多孔钽复合BMP-7组和单纯多孔钽组均得到了不同程度修复，提示此模型建立成功，也提示软骨下骨结构被破坏可导致软骨生物力学性能改变，不利于表面软骨缺损的修复[19]。
本研究大体观察发现，随时间增加，A、B组材料与宿主骨间结合逐渐紧密，在软骨缺损区域逐渐出现新生软骨组织并逐步覆盖缺损区域，A组软骨修复整体情况优于B组；C组缺损区均未修复，表面逐渐被纤维组织填充。提示多孔钽植入后修复了软骨下骨缺损，材料较高的孔径及孔隙连通率利于BMP-7的渗透释放及宿主骨产生的细胞因子向缺损区域转移，可为软骨修复提供有利条件，与相关研究结论一致[20]。同时本研究通过组织学和扫描电镜观察组织在材料内部的长入情况，结果显示术后随时间增加，多孔钽与宿主骨界面上逐渐出现新生软骨和成骨细胞，骨组织逐渐与多孔钽紧密结合，软骨缺损区域也逐渐被新生软骨样组织覆盖，提示多孔钽材料生物相容性好良好。同时我们通过Micro-CT对材料植入16周的样本进行三维重建，行骨形态计量学分析，结果提示材料最终与周围宿主骨形成了良好的整合，多孔钽复合BMP-7组骨小梁数量及厚度明显优于多孔钽组，此结果与相关研究结果一致[21-22]。提示多孔钽经BMP-7修饰后可提高材料的生物活性，促进细胞的分化，利于软骨及软骨下骨缺损的修复。
综上述，本研究提示多孔钽具有良好的组织相容性，与BMP-7复合后可与宿主形成稳定的连接与整合，对软骨及软骨下骨缺损修复起良好作用，验证了多孔钽作为组织工程支架材料的优越性，同时也为进一步软骨及骨损伤的修复提供了新的实验依据。
软骨损伤和缺损是目前世界骨科领域面临的难题之一，治疗方法有骨移植、生物活性支架材料替代、人工假体置换等。骨移植是临床上最常用方法，但自体骨来源有限且会对患者造成二次伤害，同种异体骨可能存在排斥反应和传染疾病等问题。生物活性支架材料的微观结构与松质骨相似，适合于骨的长入和矿化，但力学强度不足，在关节、脊柱等负重较大的部位应用常受到限制[1-2]；医用金属材料强度高、硬度高，韧性、抗疲劳性较好，但弹性模量远高于正常骨，易引起应力遮挡，导致假体松动[3]。而多孔金属钽具有十二面体排列的空间立体微观结构，在其内部具有纵横交错、相互连通的微孔结构，使其具有孔隙率高、弹性模量低及表面摩擦系数高等物理特性；同时，其具有生物相容性好、抗腐蚀能力强以及具备良好骨传导性的生物学特性，使其成为理想的骨缺损修复材料[4]。BMP-7又称成骨蛋白1，是BMP家族中的一员[5]。BMP-7具有很强的异位成骨作用，可在异位诱导新骨形成，在体外能促进软骨细胞增殖，增强软骨细胞外基质合成，促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌，在骨缺损修复及软骨分化过程中发挥重要作用[6-9]。有研究报道，应用腺病毒作为载体将BMP-7基因重组至兔软骨细胞中，将细胞体外培养后植入兔关节软骨缺损模型，发现其软骨缺损修复明显好于未植入细胞的兔关节软骨缺损组[10]。我们的前期研究发现，BMP-7与多孔钽复合后能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质分泌，促进软骨基因表达[11]。本研究进一步将多孔钽与BMP-7复合后，植入兔股骨内髁软骨缺损模型，通过大体观察、组织学观察、扫描电镜、Micro-CT等方法，观察复合物对兔关节软骨及软骨下骨缺损修复的情况，为多孔钽的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
成年新西兰大耳白兔48只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，由华北理工大学实验动物中心提供。
体内植入的多孔钽件（重庆润泽医疗器械有限公司），采用粉末浇注高温煅烧技术制成直径4 mm、长10 mm的圆柱体，分别按顺序在蒸馏水、丙酮溶液及70%乙醇溶液中超声清洗20 min，蒸馏水清洗、高压蒸汽灭菌后备用。多孔钽表面及断面可见分布均匀的呈立体连通的蜂窝状结构，孔径400～600μm，孔隙率75%～85%。500倍扫描电镜观察可见分布均匀的直径400～600μm的微孔结构，1 000倍扫描电镜下可见微孔直径为50～200μm，且微孔的孔隙间相互连通。见图 1。
图1
多孔钽外观及微观结构观察ⓐ多孔钽外观ⓑ扫描电镜观察（×500）ⓒ扫描电镜观察（×1 000） 图 2术后各时间点各组软骨修复情况大体观察ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周ⓖC组4周ⓗC组8周ⓘC组12周
Figure1.
Appearance and microstructure observation of porous tantalum ⓐGeneral observation ⓑSEM observation (×500) ⓒSEM observation (×1 000) Fig. 2 General observation of cartilage repair after operation ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks ⓔGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks ⓖGroup C at 4 weeks ⓗGroup C at 8 weeks ⓘGroup C at 12 weeks
重组人BMP-7（recombinant human BMP-7，rhBMP-7；ProSpec公司，以色列）。JSM-6030LV扫描电镜（电子株式会社，日本）；Leica1600硬组织切片机（Leica公司，德国）；SP2600铣片机、Minimet1000磨片机（Buehler公司，美国）；eXplore Locus SP型Micro-CT（GE公司，美国）。Advanced Bone Analysis软件（GE Healthcare公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 复合BMP-7多孔钽材料制备
取5 mg rhBMP-7溶入10 mL浓度为6 mol/L的尿素溶液，将多孔钽材料浸入其中，4℃放置12 h，然后冰冻干燥处理，透析除水，氯仿蒸气消毒后备用。
1.2.2 实验分组及方法
取48只新西兰大白兔随机分为3组，分别为复合BMP-7多孔钽组（A组）、多孔钽组（B组）及对照组（C组），每组16只。实验动物以5%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉后，取右侧膝前正中切口，长约2 cm，沿髌骨内缘切开关节囊，将髌骨向外脱出后显露股骨内髁，克氏针钻孔后以直径4 mm钻头沿股骨轴向钻孔，深度约6 mm，制备兔股骨内髁软骨缺损模型。生理盐水冲洗伤口后，A、B组分别植入直径4 mm、长约5 mm的复合BMP-7多孔钽及多孔钽，C组不植入材料。再次冲洗后逐层缝合伤口，术后单笼饲养，允许患肢负重；术后3 d每天用络合碘消毒伤口并肌肉注射青霉素8万U预防感染。每组分别于术后4、8、16周采用空气栓塞法各处死5只实验动物，取出术侧股骨，于股骨髁上0.5 cm处切断，保留带有植入材料的髁部，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 动物术后观察
术后观察动物存活、切口愈合及活动情况。
1.3.2 大体观察
术后各时间点肉眼观察3组软骨缺损部位大体愈合情况，A、B组按软骨缺损修复大体观察评分标准[12-13]评价修复效果。
1.3.3 扫描电镜观察
术后各时间点取出A、B组植入材料，0.1%PBS清洗2遍，叔丁醇梯度脱水，— 10℃冰冻1 h，真空干燥机内干燥，将材料用导电胶固定于铜台上，喷金，扫描电镜观察材料表面软骨组织及骨组织生长情况。
1.3.4 组织学观察
术后各时间点A、B组大体观察后，将植入材料连同周围0.5 cm组织取出，固定、脱水、渗透、包埋、切片，片厚20μm，甲苯胺蓝染色，光镜下观察组织空隙内软骨及骨长入情况和多孔钽周围成骨情况。
1.3.5 Micro-CT观测
术后16周A、B组各随机选取3只动物标本，对多孔钽及周围骨质进行Micro-CT扫描，行三维重建并行骨形态计量学分析，观察并分析各组材料与组织接触界面及周围的骨质情况。取多孔钽材料周围直径5 mm的圆柱状区域为感兴趣区域，设定重建阈值为1 000，采用Advanced Bone Analysis软件分析。软件自动生成的主要参数包括：骨小梁间隙（trabecular bone space，Tb.Sp）、组织骨密度（trabecular mineral density，TMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 动物术后观察
手术均顺利完成，实验动物均于术后3 h内自然苏醒，自行饮水；2 d后进食情况同术前；3～5 d术侧肢体可部分负重，2周后基本恢复正常步态；手术切口均Ⅰ期愈合，缝线自行脱落。共有5只动物（A组1只、B组2只、C组2只）因腹泻死亡，后期均予以补齐。
2.2 大体观察
A组术后4周可见缺损区域植入材料表面出现少量软骨样组织，8、16周缺损部位逐渐被新生软骨组织完全覆盖，表面平整光滑；B组术后4周缺损区域植入材料表面未见新生软骨组织，8、16周缺损部位也逐渐覆盖新生软骨组织，但表面不平整，修复程度较A组差；C组术后4、8、16周缺损区均未修复，表面逐渐被纤维组织填充。见图 2。除术后4周A、B组软骨缺损修复大体观察评分比较差异无统计学意义（P > 0.05）外，术后8、16周A组评分均高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点A、B组软骨缺损修复大体观察评分比较（n=5，2.3 扫描电镜观察
术后4周，A、B组材料表面均可见少量钙盐沉积及新生软骨和成骨细胞，成骨细胞通过伪足附着于多孔钽表面，孔隙内有少量新生骨组织长入，但B组材料表面钙盐沉积及新生软骨和成骨细胞较A组少。8、16周，A组材料表面逐渐出现较多钙盐沉积，新生软骨及成骨细胞连接成片状，细胞外基质逐渐覆盖多孔钽表面，孔隙内出现大量新生骨组织长入；B组材料表面钙盐沉积数量及细胞外基质覆盖度均不及A组。见图 3。
图3
术后各时间点A、B组扫描电镜观察（×1 000）ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周 图 4术后各时间点A、B组组织学观察（甲苯胺蓝×200）ⓐA组4周ⓑA组8周ⓒA组12周ⓓB组4周ⓔB组8周ⓕB组12周
Figure3.
SEM observation of scaffolds in groups A and B after operation (×1 000) ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks δGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks Fig. 4 Histological observation in groups A and B after operation (Toluidine blue×200) ⓐGroup A at 4 weeks ⓑGroup A at 8 weeks ⓒGroup A at 12 weeks ⓓGroup B at 4 weeks ⓔGroup B at 8 weeks ⓕGroup B at 12 weeks
2.4 组织学观察
甲苯胺蓝染色示，术后4周，A、B组宿主骨断端界面均可见少量新生软骨和成骨细胞，多孔钽表面成骨细胞附着较少，骨组织部分结合多孔钽表面。8周，A、B组多孔钽界面新生软骨及骨组织均明显增加，新生骨小梁出现并向多孔钽孔隙内生长，两组软骨缺损区域已部分被新生软骨样组织覆盖，新生软骨组织与多孔钽结合较为紧密。4、8周时，A组多孔钽表面新生软骨和成骨细胞较B组多。16周，A、B组多孔钽表面紧密附着大量新生骨组织，无纤维包囊，较多骨小梁向多孔钽孔隙内生长，并与周围皮质骨相连；A组软骨缺损区域已完全被新生软骨组织覆盖，新生软骨组织与多孔钽结合非常紧密，与周围正常软骨组织结合在一起，B组软骨缺损区域大部分被新生软骨组织覆盖。见图 4。
2.5 Micro-CT观测
术后16周，A组TMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均高于B组，Tb.Sp低于B组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
术后16周A、B组材料骨形态计量学分析结果（n=5，3 讨论
软骨及软骨下骨的损伤和缺损是骨科领域难题之一，骨移植材料替代是目前治疗软骨缺损的方法之一。适宜的骨移植材料不仅需要具有通透的空间结构、合适的力学特性，还需有一定的骨诱导性，即良好的骨长入特性；同时，软骨缺损多伴有软骨下骨损伤，因此适宜的软骨缺损修复材料除具备上述性能外，还应为软骨下骨缺损提供良好支撑，为软骨损伤修复提供支撑平台。
多孔钽材料因具有良好的生物相容性、较高的孔隙率（75%～80%）、适合骨组织长入的孔径大小（400～600μm）及与人体松质骨相似的弹性模量（0.2～0.5 GPa），也被称作“金属小梁”，其良好的空间三维立体结构利于骨组织长入，并可为细胞、血管、组织代谢产物及营养物质运输提供有利的空间环境[14]。有研究发现多孔钽具备良好的组织相容性及骨长入特性[15]，在国内外关节置换或翻修术后骨缺损、股骨头缺血性坏死后骨缺损等中多有应用[16]。但多孔钽作为金属小梁，其金属特性制约了骨诱导性。为改善多孔钽的生物活性、加速骨长入时间，有研究者采用生物活性因子（如BMP系列因子）与材料相结合，可有效提高材料的生物活性，促进细胞成骨分化，如BMP-7可诱导未分化MSCs向软骨细胞和成骨细胞方向分化，在骨缺损修复过程中发挥重要作用[6-7]。目前多为多孔材料复合生物活性因子对成骨方面的研究[17]，对软骨缺损修复的报道较少见。鉴于此，本研究采用多孔钽材料与BMP-7复合后植入兔股骨内髁软骨缺损模型，通过大体观察、组织学、扫描电镜等方法，观察多孔钽与BMP-7复合后对兔关节软骨及软骨下骨缺损修复的情况。
本研究成功建立了兔股骨内髁软骨缺损模型，软骨缺损区域选择股骨内髁负重区，因软骨负重区是临床疾病好发部位，选取股骨内髁负重区较符合临床实验研究特点。Shapiro等[18]认为缺损直径< 3 mm，深度达不到软骨下骨，6周后可自行部分或全部修复，故本研究中软骨缺损区域直径为4 mm；而兔软骨厚度为1～2 mm，深度达3 mm才能损伤全层软骨，因此造模深度设定为5 mm。结果显示，对照组术后各时间点软骨缺损区域均仅被纤维组织及纤维软骨覆盖，未得到自行修复，而多孔钽复合BMP-7组和单纯多孔钽组均得到了不同程度修复，提示此模型建立成功，也提示软骨下骨结构被破坏可导致软骨生物力学性能改变，不利于表面软骨缺损的修复[19]。
本研究大体观察发现，随时间增加，A、B组材料与宿主骨间结合逐渐紧密，在软骨缺损区域逐渐出现新生软骨组织并逐步覆盖缺损区域，A组软骨修复整体情况优于B组；C组缺损区均未修复，表面逐渐被纤维组织填充。提示多孔钽植入后修复了软骨下骨缺损，材料较高的孔径及孔隙连通率利于BMP-7的渗透释放及宿主骨产生的细胞因子向缺损区域转移，可为软骨修复提供有利条件，与相关研究结论一致[20]。同时本研究通过组织学和扫描电镜观察组织在材料内部的长入情况，结果显示术后随时间增加，多孔钽与宿主骨界面上逐渐出现新生软骨和成骨细胞，骨组织逐渐与多孔钽紧密结合，软骨缺损区域也逐渐被新生软骨样组织覆盖，提示多孔钽材料生物相容性好良好。同时我们通过Micro-CT对材料植入16周的样本进行三维重建，行骨形态计量学分析，结果提示材料最终与周围宿主骨形成了良好的整合，多孔钽复合BMP-7组骨小梁数量及厚度明显优于多孔钽组，此结果与相关研究结果一致[21-22]。提示多孔钽经BMP-7修饰后可提高材料的生物活性，促进细胞的分化，利于软骨及软骨下骨缺损的修复。
综上述，本研究提示多孔钽具有良好的组织相容性，与BMP-7复合后可与宿主形成稳定的连接与整合，对软骨及软骨下骨缺损修复起良好作用，验证了多孔钽作为组织工程支架材料的优越性，同时也为进一步软骨及骨损伤的修复提供了新的实验依据。
