引用本文： 袁宁, 刘运德, 李雪, 张连祥, 侯敏, 李银霞, 李朝阳. 庆大霉素和 O-羧甲基壳聚糖对硫酸钙骨水泥改性研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(3): 306-312. doi: 10.7507/1002-1892.201604048 复制
可注射型骨修复材料可以在缺损部位任意塑形，原位自固化为具有多孔微结构的支架材料并发挥骨传导作用，具有操作简便、创伤小的优点，可广泛应用于骨缺损的填充、修复，具有广阔应用前景[1]。硫酸钙骨水泥（calcium sulfate cement，CSC）作为骨修复材料已有 100 多年历史[2]。临床应用证实 CSC 安全且具有良好生物相容性[3]。但是单纯 CSC 不仅注射性能不理想，还存在降解速率过快，与骨组织生成速率不匹配，容易形成“骨真空区”，造成其力学性能过快衰减，另外还存在骨诱导性差等问题，限制了 CSC 进一步临床应用。
研究表明，多种无机盐、有机物等可以作为改性剂，对硫酸钙形貌和行为进行调控[4-5]。O-羧甲基壳聚糖（oxygen-carboxymethylated chitosan，O-CMC）是壳聚糖经羧甲基化后的产物，具有无毒、无味以及良好成膜性、水溶性、增稠性等优点，而且生物相容性和生物降解性良好。从理论上来说，O-CMC 是一种理想的 CSC 改性材料。
单纯 CSC 作为骨替代材料，存在易感染的缺陷。庆大霉素是一种广谱抗菌药，与 CSC 直接均匀混合后，随着硫酸钙降解其会逐渐释放[6]；采用该混合物修复骨缺损可有效防治感染性并发症[7]。研究表明，将药物负载在聚合物中再与硫酸钙复合所制得的复合材料，具有更好的药物释放动力学曲线[8]。为此，我们首先在 CSC 液相中添加不同浓度 O-CMC，制备 O-CMC/硫酸钙复合骨水泥（O-CMC/CSC），分析 O-CMC 浓度对 CSC 可注射性、降解行为、成骨活性及抗压强度方面的影响，并在此基础上选择性能较佳的 O-CMC/CSC 加入庆大霉素，探究其抗压强度和抗菌性。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
小鼠成纤维细胞 L929 细胞、革兰阴性大肠杆菌、革兰阳性金黄色葡萄球菌（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。半水硫酸钙（Acros Organics 公司，美国）；O-CMC（南京森贝伽生物科技有限公司）；庆大霉素（烟台只楚药业有限公司）。
电子天平 [梅特勒-托利多（常州）精密仪器有限公司]；恒温恒湿振荡器[纳诺斯克（天津）科技有限公司]；WDW-20 微控电子万能试验机（长春科新试验仪器有限公司）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）、D8 ADVANCE X 射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD；Bruker 公司，德国）；CO2 恒温培养箱（Shellab 公司，美国）；等离子体原子发射光谱仪（Varian 公司，美国）；酶联免疫检测仪（Biotek 公司，美国）。
1.2 O-CMC/CSC 制备方法及观测
1.2.1 CSC 制备 将半水硫酸钙粉末与去离子水按照 0.5 g/mL 的固液比均匀混合，搅拌约 2 min。将混合均匀后的浆体转移至聚四氟乙烯模具中，顶端抹平，置于 37℃、100% 相对湿度环境中进行固化。待 CSC 试样完全固化后，取出待用。
1.2.2 O-CMC/CSC 制备 分别按照 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt% 质量比将 O-CMC 加入去离子水中，搅拌约 10 min 使其完全溶解，制备不同浓度的 O-CMC 水溶液。按照 1.2.1 方法将半水硫酸钙粉末与不同浓度的 O-CMC 水溶液混合制样。
1.2.3 观测指标 ① 可注射性测试：将半水硫酸钙粉末分别与质量比为 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC 水溶液混合，混合约 2 min 后，将调匀的浆体移至 5 mL 注射器内，每隔 1 min 注射 1 次，直至材料无法顺利注射，记录可注射时间（min），即开始混合至无法顺利注射的时间。实验重复 6 次。以 CSC 作为对照。
② 抗压强度测试：参照文献[9]方法测试材料抗压强度。将 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直径 6 mm、高 12 mm 试样，置于 37℃、100% 相对湿度环境下固化，分别于 1、3、7、14、28 d 取出试样（n=6），用万能试验机以 1 mm/min 速度测试其抗压强度。
③ 降解率测试：通过模拟体液（simulated body fluid，SBF）[10]浸泡实验测试材料降解行为。取 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直径 6 mm、高 10 mm 试样，两端磨平，称重，记为浸泡前质量。然后将试样浸泡于含 5 mL SBF 溶液的离心管中，置于 37℃、100% 相对湿度环境。于浸泡 1、2、3、4、5、6 周时取出试样（n=6），用去离子水洗涤，自然干燥 24 h 后，再次称重，记为浸泡后质量。实验过程中，每 2 天更换 1 次 SBF 溶液。按照以下公式计算降解率，降解率=（浸泡前质量—浸泡后质量）/浸泡前质量×100%。以 CSC 作为对照。
④ SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 浓度测试：降解率测试样品浸泡过程中，于 0、1、2、4、8、12、24、48 h 取离心管中 SBF 溶液（n=3），测量其 pH 值。于 1、3、5、7、14 d 取离心管中 SBF 溶液（n=3），采用等离子体原子发射光谱仪测量其 Ca2+ 浓度。
⑤ 成分与形貌表征观察：取 0.3 wt%、0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，置于 SBF 溶液中浸泡，于浸泡后 1、14、35 d 取 0.5wt%O-CMC/CSC，取断面经表面干燥处理后，采用 XRD 进行成分分析。浸泡 2、5 周取 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC，取断面经真空镀膜仪表面喷金处理后，采用扫描电镜观察表面形貌；以 CSC 作为对照。
⑥ 细胞毒性测试：采用 L929 细胞，按照 MTT 法检测 CSC 及 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 细胞毒性[7]。于培养 1、3 d 测量吸光度（A）值，每个试样设 5 个复孔。以培养基作为空白对照，将空白对照 1 d 时A 值作为细胞成活率 100%，计算 5 种 O-CMC/CSC 细胞相对成活率。
综合以上检测指标，确定最佳性能 O-CMC/CSC，并以此复合庆大霉素，进行后续实验。
1.3 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备及观测
1.3.1 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备 按照 0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 质量比将庆大霉素加入最佳性能 O-CMC/CSC 对应浓度的 O-CMC 水溶液中，搅拌约 10 min，使其完全溶解，然后将半水硫酸钙粉与溶液按照上述 1.2.2 方法混合制样。
1.3.2 观测指标 ① 抗压强度测试：将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备成直径 6 mm、高 12 mm 试样，置于 37℃、100% 相对湿度环境下固化 24 h（n=6），然后用万能试验机以 1 mm/min 速度测试其抗压强度。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
② 庆大霉素释放量测试：将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备成直径 6 mm、高 10 mm 试样，两端磨平，置于含 5 mL PBS 溶液的离心管中浸泡，离心管置于 37℃、100% 相对湿度摇床，以 60 r/min 频率进行振荡。于浸泡后 1、3、6、9、12、24 h 以及 2 、3、4、5、6、7 d 取浸泡液（n=6），测量其庆大霉素含量。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
③ 抑菌性测试：采用革兰阴性大肠杆菌和革兰阳性金黄色葡萄球菌作为模型细菌。首先制备铺有细菌的 LB 琼脂板，控制菌液浓度为 1×106 CFU/mL，每个琼脂板上涂抹 100 μL 菌液，然后将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC（直径 12 mm、高 2 mm）置于铺有细菌的 LB 琼脂板上，37℃ 培养箱中孵育 24 h，测量各试样抑菌区域。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
1.4 统计学方法
采用 SPSS11.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 O-CMC/CSC制备
2.1.1 可注射性测试 CSC 可注射时间为（3.5±0.2）min，各浓度 O-CMC/CSC 可注射时间均超过 5 min，并且随 O-CMC 浓度增加而显著延长，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1a。
图1
O-CMC/CSC制备观察 a. 可注射时间； b. 抗压强度； c. 降解率； d. SBF 溶液 pH 值； e. SBF 溶液 Ca2+ 浓度； f. 浸泡 2 周时形貌表征观察（扫描电镜×10 k） 从左至右分别为 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； g. 浸泡 5 周时形貌表征观察（扫描电镜×10 k） 从左至右分别为 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； h. XRD 分析材料成分； i. 细胞毒性测试
Figure1.
Physical and chemical properties of O-CMC/CSC a. The injection time; b. The compressive strength; c. The degradation rate; d. The pH value in simulated body fluid; e. The Ca2+ concentrations in simulated body fluid; f. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 2 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt%O-CMC/CSC, respectively; g. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 5 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt% O-CMC/CSC, respectively; h. X-ray diffraction patterns to identify the phases of different samples; i. The cytotoxicity of different samples
2.1.2 抗压强度测试 各浓度 O-CMC/CSC 抗压强度介于 11～18 MPa 之间，随 O-CMC 浓度增加，O-CMC/CSC 抗压强度呈先增加后降低趋势，其中 0.5wt%O-CMC/CSC 抗压强度最高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1b。
2.1.3 降解率测试 各时间点，CSC 降解率均高于各浓度 O-CMC/CSC，0.5wt%O-CMC/CSC 降解率高于 1.0wt%O-CMC/CSC，但差异均无统计学意义（P>0.05）。随时间延长，各浓度 O-CMC/CSC 降解率均逐渐增高，但组内各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1c。
2.1.4 SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 浓度测试 各浓度 O-CMC/CSC 浸泡 4 h 内 SBF 溶液 pH 值呈下降趋势，4～24 h pH 值逐渐上升，但上升速率随时间增加而减慢，但各时间点 pH 值比较差异无统计学意义（P>0.05）。浸泡 30 h 以内各浓度 O-CMC/CSC 浸泡液 pH 值低于 CSC，但随时间延长，各浓度复合骨水泥及 CSC 浸泡液 pH 值趋于一致。见图 1d。
随时间延长，CSC 及 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 在 SBF 中 Ca2+ 浓度增加速率均减缓。同一时间点，随着 O-CMC 浓度增加，Ca2+ 浓度降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1e。
2.1.5 成分与形貌表征观察 ① 扫描电镜观察：浸泡 2 周，CSC 可见片状二水硫酸钙晶粒，表面无新物质形成；0.3wt%O-CMC/CSC 不仅有片状二水硫酸钙晶体，还有部分颗粒状二水硫酸钙分布在片层状结构之间；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，其二水硫酸钙片状晶粒表面和它们之间的小颗粒状晶体出现了类似网状多孔结构。根据 XRD 图谱分析，在骨水泥试样表面形成的是羟基磷灰石。见图 1f。
浸泡 5 周，CSC 片状二水硫酸钙晶粒边缘产生少量多孔粒状物质；0.3wt%O-CMC/CSC 其片状二水硫酸钙晶粒大部分成为更小的不规则晶粒，表面有大量多孔物质形成；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC 未见片状二水硫酸钙晶体，可见大量整齐的片层状物质垂直骨水泥表面。见图 1g。
② XRD 分析：浸泡 1 d 时，0.5wt% O-CMC/CSC 主要显示为二水硫酸钙波峰；14 d 后二水硫酸钙波峰变弱；35 d 时，二水硫酸钙完全转变为钙磷盐，骨水泥表面无二水硫酸钙，而是明显的新物质波峰。见图 1h。
2.1.6 细胞毒性测试 培养 1 d 时，CSC 及不同浓度 O-CMC/CSC 细胞成活率约为 100%，3 d 时为 145%～165%。同一时间点，不同浓度 O-CMC/CSC 比较差异无统计学意义（P>0.05）。见 1i。
综合以上检测指标结果，确定采用以 0.5wt% O-CMC/CSC 进行后续实验。
2.2 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 观测
2.2.1 抗压强度测试 随庆大霉素含量增加，载庆大霉素的 O-CMC/CSC 抗压强度逐渐降低，且均低于 O-CMC/CSC，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2a。
图2
载庆大霉素的 O-CMC/CSC 观测 a. 抗压强度； b. 庆大霉素释放量； c. 大肠杆菌抑菌性测试 从左至右分别为载 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC； d. 金黄色葡萄球菌抑菌性测试 从左至右分别为载 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC
Figure2.
Physical and antibacterial properties of O-CMC/CSC with gentamicin a. The compressive strength; b. The release profile of gentamicin; c. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstEscherichia Coli From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively; d. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstStaphylococcus Aureus From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively
2.2.2 庆大霉素释放量测试 同一时间点，载庆大霉素的 O-CMC/CSC 其庆大霉素释放量随含量增加而显著增加，比较差异有统计学意义（P<0.05）。各载庆大霉素的 O-CMC/CSC 均于 1 d 内释放速率最快，约占总释放量的 80%，之后释放速率变慢，释放量趋于平缓。见图 2b。
2.2.3 抑菌性测试 大肠杆菌抑菌性测试显示，不含庆大霉素的 O-CMC/CSC 无抑菌圈，载 1.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直径为（20.0±3.2）mm，较载 0.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC（17.0±1.8）、（16.0±1.5）mm 扩大，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
金黄色葡萄球菌抑菌性测试结果与大肠杆菌抑菌性测试，不含庆大霉素的 O-CMC/CSC 无抑菌圈，载 1.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直径为（37.0±5.5）mm，较载 0.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC（32.0±4.8）、（34.0±5.0）mm 扩大，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2c、d。
3 讨论
材料的可注射性是指无论注射压力大小，其被注射时所含相能保持均匀状态（各种相不发生分离）的能力。目前，对于材料可注射性的表征缺少统一标准。骨修复材料的可注射性评价指标主要包括注射率、注射力、注射压力和可注射时间等，注射率越大或者注射力、注射压力越小，可注射时间越长，说明骨水泥可注射性越好。本实验主要测试了样品的可注射时间。结果显示，加入 O-CMC 后 CSC 可注射时间延长，主要原因可能是 O-CMC 长链上含有较多的 -COOH 和 -OH，在半水硫酸钙水化过程中产生大量 Ca2+，-COOH 和 -OH 与 Ca2+ 发生螯合作用，使得溶液中的 Ca2+ 变少，从而半水硫酸钙向二水硫酸钙转化过程变慢，即延长了 CSC 的固化时间，使浆体可塑时间变长。-COOH 和 -OH 的含量越多，螯合的 Ca2+ 越多，因此 CSC 的可注射时间随 O-CMC 的浓度增加而增加。由此可见，通过控制液相中 O-CMC 的浓度可以控制 O-CMC/CSC 的可注射时间，为 CSC 的临床应用提供了更多可能。
在临床治疗使用中，骨修复材料需要在骨缺损部位提供一定力学支撑，足够的力学强度是成骨前期的保证。为了达到一定力学强度，二水硫酸钙晶粒和 O-CMC 必须达到一种力学稳态，即一个二水硫酸钙晶粒周围必须完全被 O-CMC 包裹。本实验结果显示，二水硫酸钙晶粒和 O-CMC 有达到这种稳态的趋势，其中含 0.5wt%O-CMC 的复合骨水泥达到最大力学强度，抗压强度最大。但随着 O-CMC 的继续添加，O-CMC 会破坏二水硫酸钙晶粒原有的自固化结构，二水硫酸钙晶粒之间的自固化链接被破坏，复合骨水泥变得疏松，孔隙率增加，力学强度下降。松质骨抗压强度在 5～10 MPa之间[11-12]。本实验各浓度 O-CMC/CSC 抗压强度介于 11～18 MPa 之间，能满足骨缺损部位临床使用要求。
O-CMC/CSC 在降解过程中会产生钙磷盐类物质，且随着 O-CMC 浓度的增加，钙磷盐类物质产生越多。根据 XRD 图谱分析，在骨水泥试样表面形成的是羟基磷灰石。羟基磷灰石具有良好的骨传导性，并能产生骨性结合，结合扫描电镜观察结果，与对照组 CSC 相比，添加 O-CMC 有助于提高 CSC 的生物活性。
骨修复材料降解性能是评价植入材料的另一个重要指标，材料本身的理化性质决定了其降解性能。CSC 的缺点是降解过快，无法与新骨生成速率相匹配。CSC 在 SBF 溶液中降解过快，可能是因为其含有较多的微孔结构，孔隙率较大，结构疏松，容易降解。O-CMC 作为一种高分子材料，降解速率明显低于 CSC，而且适量的 O-CMC 可以填补 CSC 中的孔隙，使 O-CMC/CSC 孔隙率降低，孔径变小，降解速率降低。
有研究认为，CSC 在降解过程中会产生局部酸度，虽然酸度过高会引起无菌炎症，但移植部位适度的酸性环境被认为有助于骨骼重建，酸性环境能够使局部骨组织部位脱矿，促进生长因子如 BMP 等的生成，从而促使 BMSCs 分化成为成骨细胞，有助于新骨形成[13]。本实验结果显示，虽然浸泡 48 h 内 O-CMC/CSC 浸泡液的 pH 值有所下降，但仍在安全范围内，且有利于成骨。
虽然 Ca2+ 可能改变骨吸收/骨重建的平衡，刺激成骨细胞分化，抑制破骨细胞吸收[14]，有利于新骨形成，但高钙环境容易引起炎性反应，如瞬态高钙血症等，而稍高浓度的 Ca2+ 环境（6～8 mmol/L）有利于成骨类细胞分化。O-CMC/CSC 在降解过程中会产生钙磷盐类物质，但 Ca2+ 浓度最终稳定在 6～8 mmol/L，且释放曲线更平稳，提示添加 O-CMC 改善了 CSC 骨再生的 Ca2+ 微环境和生物活性。
在细胞相容性方面，我们将空白对照 1 d 时的A 值作为 100%，根据各组样品细胞相对成活率来判断样品的细胞活性。A 值间接反映细胞数量，一定细胞数量范围内结晶物形成的量与细胞数成正比，A 值越高可以认为细胞生长越好[15]。O-CMC/CSC 与 CSC 的测试结果之间没有显著性差异，提示均可以促进细胞增殖，具有良好细胞活性。
庆大霉素在硫酸钙基体中主要以 2 种形态存在，分别为以物理吸附在硫酸钙表面和内部微孔孔壁，以及与硫酸钙基体或凝胶产生化学螯合。释放初期主要是物理吸附的庆大霉素扩散释放，而在释放后期则主要是与硫酸钙基体或凝胶产生化学螯合的庆大霉素的溶解释放，这部分的庆大霉素释放相对较困难，所以缓释初期庆大霉素的释放速度明显大于释放后期的释放速度[16]。载 0.5wt% 庆大霉素的样品释放量较少，释放出的药物浓度太低，难以达到抗菌、消炎的治疗效果；而载药量达 1.5wt% 的样品中，庆大霉素释放不完全，只释放了总载药量的 66.7% 左右。载药量为 2.5wt% 的样品其释放量达到了 72%，既能保证治疗所需要的药物浓度，又能使药物达到高效释放，效果较佳。样品对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌测试均表明，含庆大霉素 1.5wt% 时的抑菌效果较好，且样品对金黄色葡萄球菌的抑菌性比对大肠杆菌好。
综上所述，CSC 经 O-CMC 和庆大霉素改性后，提高了其在骨修复领域应用的可行性，但要应用于临床还有待更深入、系统地研究。
可注射型骨修复材料可以在缺损部位任意塑形，原位自固化为具有多孔微结构的支架材料并发挥骨传导作用，具有操作简便、创伤小的优点，可广泛应用于骨缺损的填充、修复，具有广阔应用前景[1]。硫酸钙骨水泥（calcium sulfate cement，CSC）作为骨修复材料已有 100 多年历史[2]。临床应用证实 CSC 安全且具有良好生物相容性[3]。但是单纯 CSC 不仅注射性能不理想，还存在降解速率过快，与骨组织生成速率不匹配，容易形成“骨真空区”，造成其力学性能过快衰减，另外还存在骨诱导性差等问题，限制了 CSC 进一步临床应用。
研究表明，多种无机盐、有机物等可以作为改性剂，对硫酸钙形貌和行为进行调控[4-5]。O-羧甲基壳聚糖（oxygen-carboxymethylated chitosan，O-CMC）是壳聚糖经羧甲基化后的产物，具有无毒、无味以及良好成膜性、水溶性、增稠性等优点，而且生物相容性和生物降解性良好。从理论上来说，O-CMC 是一种理想的 CSC 改性材料。
单纯 CSC 作为骨替代材料，存在易感染的缺陷。庆大霉素是一种广谱抗菌药，与 CSC 直接均匀混合后，随着硫酸钙降解其会逐渐释放[6]；采用该混合物修复骨缺损可有效防治感染性并发症[7]。研究表明，将药物负载在聚合物中再与硫酸钙复合所制得的复合材料，具有更好的药物释放动力学曲线[8]。为此，我们首先在 CSC 液相中添加不同浓度 O-CMC，制备 O-CMC/硫酸钙复合骨水泥（O-CMC/CSC），分析 O-CMC 浓度对 CSC 可注射性、降解行为、成骨活性及抗压强度方面的影响，并在此基础上选择性能较佳的 O-CMC/CSC 加入庆大霉素，探究其抗压强度和抗菌性。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
小鼠成纤维细胞 L929 细胞、革兰阴性大肠杆菌、革兰阳性金黄色葡萄球菌（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。半水硫酸钙（Acros Organics 公司，美国）；O-CMC（南京森贝伽生物科技有限公司）；庆大霉素（烟台只楚药业有限公司）。
电子天平 [梅特勒-托利多（常州）精密仪器有限公司]；恒温恒湿振荡器[纳诺斯克（天津）科技有限公司]；WDW-20 微控电子万能试验机（长春科新试验仪器有限公司）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）、D8 ADVANCE X 射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD；Bruker 公司，德国）；CO2 恒温培养箱（Shellab 公司，美国）；等离子体原子发射光谱仪（Varian 公司，美国）；酶联免疫检测仪（Biotek 公司，美国）。
1.2 O-CMC/CSC 制备方法及观测
1.2.1 CSC 制备 将半水硫酸钙粉末与去离子水按照 0.5 g/mL 的固液比均匀混合，搅拌约 2 min。将混合均匀后的浆体转移至聚四氟乙烯模具中，顶端抹平，置于 37℃、100% 相对湿度环境中进行固化。待 CSC 试样完全固化后，取出待用。
1.2.2 O-CMC/CSC 制备 分别按照 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt% 质量比将 O-CMC 加入去离子水中，搅拌约 10 min 使其完全溶解，制备不同浓度的 O-CMC 水溶液。按照 1.2.1 方法将半水硫酸钙粉末与不同浓度的 O-CMC 水溶液混合制样。
1.2.3 观测指标 ① 可注射性测试：将半水硫酸钙粉末分别与质量比为 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC 水溶液混合，混合约 2 min 后，将调匀的浆体移至 5 mL 注射器内，每隔 1 min 注射 1 次，直至材料无法顺利注射，记录可注射时间（min），即开始混合至无法顺利注射的时间。实验重复 6 次。以 CSC 作为对照。
② 抗压强度测试：参照文献[9]方法测试材料抗压强度。将 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直径 6 mm、高 12 mm 试样，置于 37℃、100% 相对湿度环境下固化，分别于 1、3、7、14、28 d 取出试样（n=6），用万能试验机以 1 mm/min 速度测试其抗压强度。
③ 降解率测试：通过模拟体液（simulated body fluid，SBF）[10]浸泡实验测试材料降解行为。取 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直径 6 mm、高 10 mm 试样，两端磨平，称重，记为浸泡前质量。然后将试样浸泡于含 5 mL SBF 溶液的离心管中，置于 37℃、100% 相对湿度环境。于浸泡 1、2、3、4、5、6 周时取出试样（n=6），用去离子水洗涤，自然干燥 24 h 后，再次称重，记为浸泡后质量。实验过程中，每 2 天更换 1 次 SBF 溶液。按照以下公式计算降解率，降解率=（浸泡前质量—浸泡后质量）/浸泡前质量×100%。以 CSC 作为对照。
④ SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 浓度测试：降解率测试样品浸泡过程中，于 0、1、2、4、8、12、24、48 h 取离心管中 SBF 溶液（n=3），测量其 pH 值。于 1、3、5、7、14 d 取离心管中 SBF 溶液（n=3），采用等离子体原子发射光谱仪测量其 Ca2+ 浓度。
⑤ 成分与形貌表征观察：取 0.3 wt%、0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，置于 SBF 溶液中浸泡，于浸泡后 1、14、35 d 取 0.5wt%O-CMC/CSC，取断面经表面干燥处理后，采用 XRD 进行成分分析。浸泡 2、5 周取 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC，取断面经真空镀膜仪表面喷金处理后，采用扫描电镜观察表面形貌；以 CSC 作为对照。
⑥ 细胞毒性测试：采用 L929 细胞，按照 MTT 法检测 CSC 及 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 细胞毒性[7]。于培养 1、3 d 测量吸光度（A）值，每个试样设 5 个复孔。以培养基作为空白对照，将空白对照 1 d 时A 值作为细胞成活率 100%，计算 5 种 O-CMC/CSC 细胞相对成活率。
综合以上检测指标，确定最佳性能 O-CMC/CSC，并以此复合庆大霉素，进行后续实验。
1.3 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备及观测
1.3.1 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备 按照 0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 质量比将庆大霉素加入最佳性能 O-CMC/CSC 对应浓度的 O-CMC 水溶液中，搅拌约 10 min，使其完全溶解，然后将半水硫酸钙粉与溶液按照上述 1.2.2 方法混合制样。
1.3.2 观测指标 ① 抗压强度测试：将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备成直径 6 mm、高 12 mm 试样，置于 37℃、100% 相对湿度环境下固化 24 h（n=6），然后用万能试验机以 1 mm/min 速度测试其抗压强度。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
② 庆大霉素释放量测试：将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC 制备成直径 6 mm、高 10 mm 试样，两端磨平，置于含 5 mL PBS 溶液的离心管中浸泡，离心管置于 37℃、100% 相对湿度摇床，以 60 r/min 频率进行振荡。于浸泡后 1、3、6、9、12、24 h 以及 2 、3、4、5、6、7 d 取浸泡液（n=6），测量其庆大霉素含量。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
③ 抑菌性测试：采用革兰阴性大肠杆菌和革兰阳性金黄色葡萄球菌作为模型细菌。首先制备铺有细菌的 LB 琼脂板，控制菌液浓度为 1×106 CFU/mL，每个琼脂板上涂抹 100 μL 菌液，然后将制备的 3 种载庆大霉素的 O-CMC/CSC（直径 12 mm、高 2 mm）置于铺有细菌的 LB 琼脂板上，37℃ 培养箱中孵育 24 h，测量各试样抑菌区域。以未载庆大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作为对照。
1.4 统计学方法
采用 SPSS11.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 O-CMC/CSC制备
2.1.1 可注射性测试 CSC 可注射时间为（3.5±0.2）min，各浓度 O-CMC/CSC 可注射时间均超过 5 min，并且随 O-CMC 浓度增加而显著延长，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1a。
图1
O-CMC/CSC制备观察 a. 可注射时间； b. 抗压强度； c. 降解率； d. SBF 溶液 pH 值； e. SBF 溶液 Ca2+ 浓度； f. 浸泡 2 周时形貌表征观察（扫描电镜×10 k） 从左至右分别为 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； g. 浸泡 5 周时形貌表征观察（扫描电镜×10 k） 从左至右分别为 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； h. XRD 分析材料成分； i. 细胞毒性测试
Figure1.
Physical and chemical properties of O-CMC/CSC a. The injection time; b. The compressive strength; c. The degradation rate; d. The pH value in simulated body fluid; e. The Ca2+ concentrations in simulated body fluid; f. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 2 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt%O-CMC/CSC, respectively; g. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 5 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt% O-CMC/CSC, respectively; h. X-ray diffraction patterns to identify the phases of different samples; i. The cytotoxicity of different samples
2.1.2 抗压强度测试 各浓度 O-CMC/CSC 抗压强度介于 11～18 MPa 之间，随 O-CMC 浓度增加，O-CMC/CSC 抗压强度呈先增加后降低趋势，其中 0.5wt%O-CMC/CSC 抗压强度最高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1b。
2.1.3 降解率测试 各时间点，CSC 降解率均高于各浓度 O-CMC/CSC，0.5wt%O-CMC/CSC 降解率高于 1.0wt%O-CMC/CSC，但差异均无统计学意义（P>0.05）。随时间延长，各浓度 O-CMC/CSC 降解率均逐渐增高，但组内各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1c。
2.1.4 SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 浓度测试 各浓度 O-CMC/CSC 浸泡 4 h 内 SBF 溶液 pH 值呈下降趋势，4～24 h pH 值逐渐上升，但上升速率随时间增加而减慢，但各时间点 pH 值比较差异无统计学意义（P>0.05）。浸泡 30 h 以内各浓度 O-CMC/CSC 浸泡液 pH 值低于 CSC，但随时间延长，各浓度复合骨水泥及 CSC 浸泡液 pH 值趋于一致。见图 1d。
随时间延长，CSC 及 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 在 SBF 中 Ca2+ 浓度增加速率均减缓。同一时间点，随着 O-CMC 浓度增加，Ca2+ 浓度降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1e。
2.1.5 成分与形貌表征观察 ① 扫描电镜观察：浸泡 2 周，CSC 可见片状二水硫酸钙晶粒，表面无新物质形成；0.3wt%O-CMC/CSC 不仅有片状二水硫酸钙晶体，还有部分颗粒状二水硫酸钙分布在片层状结构之间；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，其二水硫酸钙片状晶粒表面和它们之间的小颗粒状晶体出现了类似网状多孔结构。根据 XRD 图谱分析，在骨水泥试样表面形成的是羟基磷灰石。见图 1f。
浸泡 5 周，CSC 片状二水硫酸钙晶粒边缘产生少量多孔粒状物质；0.3wt%O-CMC/CSC 其片状二水硫酸钙晶粒大部分成为更小的不规则晶粒，表面有大量多孔物质形成；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC 未见片状二水硫酸钙晶体，可见大量整齐的片层状物质垂直骨水泥表面。见图 1g。
② XRD 分析：浸泡 1 d 时，0.5wt% O-CMC/CSC 主要显示为二水硫酸钙波峰；14 d 后二水硫酸钙波峰变弱；35 d 时，二水硫酸钙完全转变为钙磷盐，骨水泥表面无二水硫酸钙，而是明显的新物质波峰。见图 1h。
2.1.6 细胞毒性测试 培养 1 d 时，CSC 及不同浓度 O-CMC/CSC 细胞成活率约为 100%，3 d 时为 145%～165%。同一时间点，不同浓度 O-CMC/CSC 比较差异无统计学意义（P>0.05）。见 1i。
综合以上检测指标结果，确定采用以 0.5wt% O-CMC/CSC 进行后续实验。
2.2 载庆大霉素的 O-CMC/CSC 观测
2.2.1 抗压强度测试 随庆大霉素含量增加，载庆大霉素的 O-CMC/CSC 抗压强度逐渐降低，且均低于 O-CMC/CSC，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2a。
图2
载庆大霉素的 O-CMC/CSC 观测 a. 抗压强度； b. 庆大霉素释放量； c. 大肠杆菌抑菌性测试 从左至右分别为载 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC； d. 金黄色葡萄球菌抑菌性测试 从左至右分别为载 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC
Figure2.
Physical and antibacterial properties of O-CMC/CSC with gentamicin a. The compressive strength; b. The release profile of gentamicin; c. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstEscherichia Coli From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively; d. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstStaphylococcus Aureus From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively
2.2.2 庆大霉素释放量测试 同一时间点，载庆大霉素的 O-CMC/CSC 其庆大霉素释放量随含量增加而显著增加，比较差异有统计学意义（P<0.05）。各载庆大霉素的 O-CMC/CSC 均于 1 d 内释放速率最快，约占总释放量的 80%，之后释放速率变慢，释放量趋于平缓。见图 2b。
2.2.3 抑菌性测试 大肠杆菌抑菌性测试显示，不含庆大霉素的 O-CMC/CSC 无抑菌圈，载 1.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直径为（20.0±3.2）mm，较载 0.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC（17.0±1.8）、（16.0±1.5）mm 扩大，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
金黄色葡萄球菌抑菌性测试结果与大肠杆菌抑菌性测试，不含庆大霉素的 O-CMC/CSC 无抑菌圈，载 1.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直径为（37.0±5.5）mm，较载 0.5wt%、2.5wt% 庆大霉素的 O-CMC/CSC（32.0±4.8）、（34.0±5.0）mm 扩大，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2c、d。
3 讨论
材料的可注射性是指无论注射压力大小，其被注射时所含相能保持均匀状态（各种相不发生分离）的能力。目前，对于材料可注射性的表征缺少统一标准。骨修复材料的可注射性评价指标主要包括注射率、注射力、注射压力和可注射时间等，注射率越大或者注射力、注射压力越小，可注射时间越长，说明骨水泥可注射性越好。本实验主要测试了样品的可注射时间。结果显示，加入 O-CMC 后 CSC 可注射时间延长，主要原因可能是 O-CMC 长链上含有较多的 -COOH 和 -OH，在半水硫酸钙水化过程中产生大量 Ca2+，-COOH 和 -OH 与 Ca2+ 发生螯合作用，使得溶液中的 Ca2+ 变少，从而半水硫酸钙向二水硫酸钙转化过程变慢，即延长了 CSC 的固化时间，使浆体可塑时间变长。-COOH 和 -OH 的含量越多，螯合的 Ca2+ 越多，因此 CSC 的可注射时间随 O-CMC 的浓度增加而增加。由此可见，通过控制液相中 O-CMC 的浓度可以控制 O-CMC/CSC 的可注射时间，为 CSC 的临床应用提供了更多可能。
在临床治疗使用中，骨修复材料需要在骨缺损部位提供一定力学支撑，足够的力学强度是成骨前期的保证。为了达到一定力学强度，二水硫酸钙晶粒和 O-CMC 必须达到一种力学稳态，即一个二水硫酸钙晶粒周围必须完全被 O-CMC 包裹。本实验结果显示，二水硫酸钙晶粒和 O-CMC 有达到这种稳态的趋势，其中含 0.5wt%O-CMC 的复合骨水泥达到最大力学强度，抗压强度最大。但随着 O-CMC 的继续添加，O-CMC 会破坏二水硫酸钙晶粒原有的自固化结构，二水硫酸钙晶粒之间的自固化链接被破坏，复合骨水泥变得疏松，孔隙率增加，力学强度下降。松质骨抗压强度在 5～10 MPa之间[11-12]。本实验各浓度 O-CMC/CSC 抗压强度介于 11～18 MPa 之间，能满足骨缺损部位临床使用要求。
O-CMC/CSC 在降解过程中会产生钙磷盐类物质，且随着 O-CMC 浓度的增加，钙磷盐类物质产生越多。根据 XRD 图谱分析，在骨水泥试样表面形成的是羟基磷灰石。羟基磷灰石具有良好的骨传导性，并能产生骨性结合，结合扫描电镜观察结果，与对照组 CSC 相比，添加 O-CMC 有助于提高 CSC 的生物活性。
骨修复材料降解性能是评价植入材料的另一个重要指标，材料本身的理化性质决定了其降解性能。CSC 的缺点是降解过快，无法与新骨生成速率相匹配。CSC 在 SBF 溶液中降解过快，可能是因为其含有较多的微孔结构，孔隙率较大，结构疏松，容易降解。O-CMC 作为一种高分子材料，降解速率明显低于 CSC，而且适量的 O-CMC 可以填补 CSC 中的孔隙，使 O-CMC/CSC 孔隙率降低，孔径变小，降解速率降低。
有研究认为，CSC 在降解过程中会产生局部酸度，虽然酸度过高会引起无菌炎症，但移植部位适度的酸性环境被认为有助于骨骼重建，酸性环境能够使局部骨组织部位脱矿，促进生长因子如 BMP 等的生成，从而促使 BMSCs 分化成为成骨细胞，有助于新骨形成[13]。本实验结果显示，虽然浸泡 48 h 内 O-CMC/CSC 浸泡液的 pH 值有所下降，但仍在安全范围内，且有利于成骨。
虽然 Ca2+ 可能改变骨吸收/骨重建的平衡，刺激成骨细胞分化，抑制破骨细胞吸收[14]，有利于新骨形成，但高钙环境容易引起炎性反应，如瞬态高钙血症等，而稍高浓度的 Ca2+ 环境（6～8 mmol/L）有利于成骨类细胞分化。O-CMC/CSC 在降解过程中会产生钙磷盐类物质，但 Ca2+ 浓度最终稳定在 6～8 mmol/L，且释放曲线更平稳，提示添加 O-CMC 改善了 CSC 骨再生的 Ca2+ 微环境和生物活性。
在细胞相容性方面，我们将空白对照 1 d 时的A 值作为 100%，根据各组样品细胞相对成活率来判断样品的细胞活性。A 值间接反映细胞数量，一定细胞数量范围内结晶物形成的量与细胞数成正比，A 值越高可以认为细胞生长越好[15]。O-CMC/CSC 与 CSC 的测试结果之间没有显著性差异，提示均可以促进细胞增殖，具有良好细胞活性。
庆大霉素在硫酸钙基体中主要以 2 种形态存在，分别为以物理吸附在硫酸钙表面和内部微孔孔壁，以及与硫酸钙基体或凝胶产生化学螯合。释放初期主要是物理吸附的庆大霉素扩散释放，而在释放后期则主要是与硫酸钙基体或凝胶产生化学螯合的庆大霉素的溶解释放，这部分的庆大霉素释放相对较困难，所以缓释初期庆大霉素的释放速度明显大于释放后期的释放速度[16]。载 0.5wt% 庆大霉素的样品释放量较少，释放出的药物浓度太低，难以达到抗菌、消炎的治疗效果；而载药量达 1.5wt% 的样品中，庆大霉素释放不完全，只释放了总载药量的 66.7% 左右。载药量为 2.5wt% 的样品其释放量达到了 72%，既能保证治疗所需要的药物浓度，又能使药物达到高效释放，效果较佳。样品对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌测试均表明，含庆大霉素 1.5wt% 时的抑菌效果较好，且样品对金黄色葡萄球菌的抑菌性比对大肠杆菌好。
综上所述，CSC 经 O-CMC 和庆大霉素改性后，提高了其在骨修复领域应用的可行性，但要应用于临床还有待更深入、系统地研究。
