引用本文： 王辉, 王茜, 张辉, 史伟, 赖振权, 崔逸爽, 李琪佳, 王志强. 带蒂筋膜瓣包裹国产多孔钽修复兔桡骨节段性骨缺损实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(10): 1200-1207. doi: 10.7507/1002-1892.201611048 复制
由各种创伤、肿瘤及先天性疾病造成的骨缺损，尤其是长骨节段性骨缺损，一直是骨科治疗领域亟待解决的难题。近年来，对骨移植替代材料逐渐深入的研究与发展，为骨组织的修复重建提供了新的思路和方法。目前常用的可降解材料虽然具有与松质骨相似的微观三维立体多孔结构，适合于骨的长入和矿化，但其力学强度不足，限制了其在关节、脊柱及肢体等负重部位骨缺损中的应用[1]。多孔钽金属凭借其良好的机械性能、抗疲劳性、生物相容性、三维多孔结构、高孔隙率、低弹性模量、高摩擦系数、抗腐蚀性、骨传导性及低细菌黏附性等特点，广泛应用于关节、脊柱及肢体负重部位骨缺损的修复[2-6]。目前临床上应用的多孔钽骨移植替代材料由美国 Zimmer 公司生产，由于其价格昂贵，难以在临床中广泛推广。因此，多孔钽材料国产化一直是国内科研工作者攻关的课题。由重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构自主研发的国产多孔钽材料，经过前期体内、外实验，已证实具有良好的生物相容性[3, 7-10]。为了进一步增强国产多孔钽体内骨传导性，本研究尝试采用带蒂筋膜瓣包裹多孔钽修复兔桡骨节段性骨缺损，通过影像学、组织形态学及生物力学等方法，检测其骨缺损的修复能力，为今后国产多孔钽应用于临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
6～8 月龄新西兰大白兔 60 只，雌雄不限，体质量 2.5～3.0 kg，由华北理工大学动物实验中心提供。
多孔钽棒（重庆润泽医疗器械有限公司），外观呈深灰色，表面及横断面可见均匀分布的孔径为 400～600 μm 的蜂窝状孔隙，孔隙率为 65%～80%。采用粉末浇注高温煅烧技术，制成直径为 3.5 mm，高 15～25 mm 的多孔圆柱体（图 1）。
图1
多孔钽棒外观
Figure1.
The appearance of the porous tantalum
微型摆锯（北京骨科研究所）；光学显微镜（Olympus 公司，日本）；数字化 X 线机（Siemens 公司，德国）；ElectroForce 3200 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；explore Locus SP Micro-CT、Micview 三维重建处理软件及 ABA 专用骨骼分析软件（通用公司，美国）；Leica RM-2145 组织切片机、Leica SP 1600 硬组织切片机（Leica 公司，德国）。
1.2 兔桡骨节段性骨缺损模型建立
取新西兰大耳白兔 60 只，术前禁食 12 h 后，以 10% 水合氯醛（3 mL/kg）缓慢腹腔注射麻醉。取右前肢桡侧中段长约 3.5 cm 切口，以桡骨弧顶为中心，用微型摆锯低速截骨 1.5 cm，生理盐水连续冷却降温，彻底切除骨缺损处及断端两侧骨膜及尺桡骨间骨间膜，注意保证断端平整，彻底止血，无菌生理盐水反复冲洗伤口，建立兔桡骨节段性骨缺损模型（图 2a）。
图2
手术步骤
a. 兔桡骨节段性骨缺损模型；b. 骨缺损处植入多孔钽棒；c. 实验组多孔钽棒表面筋膜包裹；d. 闭合切口
Figure2. Surgical proceduresa. The model of segmental bone defects in rabbit’s radius; b. The porous tantalum implanted in bone defect; c. The porous tantalum encapsulated with pedicled fascial flap in experimental group; d. Closed incision
1.3 实验分组及方法
将实验动物随机分为两组，每组 30 只，实验组为多孔钽棒+筋膜包裹组，对照组为单纯多孔钽棒组。将长 15 mm、直径 3.5 mm 的圆柱形多孔钽棒分别以嵌插方式植入两组右侧桡骨骨缺损处（图 2b）。其中实验组筋膜瓣制备及固定：于切口周围皮下筋膜组织层锐性切取约 30 mm×25 mm 大小富含毛细血管网的薄层带蒂筋膜瓣，保留宽度为 30 mm 蒂部，将筋膜瓣穿过肌肉隧道，转移至骨缺损处，环形包裹嵌插至桡骨骨缺损处的植入物，并将筋膜用 7-0 显微缝合线固定于远、近端周围骨膜组织上（图 2c）[11]。为预防感染，材料植入后再次生理盐水冲洗，局部喷洒青霉素注射液，用肌肉包裹覆盖缺损区域，依次用 5-0 可吸收线间断逐层缝合伤口，不作内、外固定（图 2d）。术后立即肌肉注射青霉素 40 万 U/只，连续 3 d，伤口处涂抹聚维酮碘溶液消毒，同时术后即刻行 X 线片检查，确认植入物位置是否良好。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 术后观察实验动物饮食、日常活动能力、伤口愈合情况（如有无肿胀、分泌物、植入物排出）、动物死亡情况及实验前后体质量变化。
1.4.2 X线片观察 分别于术后当日及 4、8、16 周将实验动物麻醉后，在相同条件（100 mA、50 kV、10 ms）和投照距离（75 cm）行右侧桡骨正位 DR 数字 X 线片检查，观察骨缺损修复情况。
1.4.3 HE染色观察 两组分别于术后 4、8、16 周采用空气栓塞法各处死 3 只动物，以骨缺损区为中心截取长 2.5 cm 骨组织标本，经 4% 多聚甲醛固定、5% 硝酸-甲醛脱钙液脱钙后取出多孔钽棒。自来水冲洗除酸、常规脱水，透明，浸蜡，包埋；用 Leica RM-2145 组织切片机切片，厚度 4 μm，在标本中心处纵向冠状面切取 2～3 片；经铺片、贴片、烘片、脱蜡、脱水后，行 HE 染色，光镜下观察两组植入物与宿主骨界面新骨生成情况。
1.4.4 甲苯胺蓝染色观察 两组分别于术后 4、8、16 周同上法各处死 3 只动物并截取长 2.5 cm 骨组织标本，经 4% 多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、包埋液包埋后，Leica SP 1600 硬组织切片机沿平行于多孔钽棒的纵轴切片，厚度约 150 μm；再磨片至 20 μm 厚，干燥，脱塑；行甲苯胺蓝染色，光镜下观察两组植入物与宿主骨界面及孔隙内的新骨生成情况。
1.4.5 生物力学测试 术后 16 周每组同上法各处死 6 只动物，取植入物新鲜标本，完整剔净软组织，在生物力学试验机上用夹具将桡骨两端固定，于植入物中点施加载荷，作三点弯曲生物力学测定。试验参数：夹具跨度 50 mm，速度 10 mm/min，最大压力负荷 1 000 N。测量时保持各标本位置一致，并保持标本湿润状态，匀速加载，直至骨折。记录两组标本最大载荷力，并通过以下公式计算出两组标本抗弯曲强度：Fmax×3×L/2bh2。其中 Fmax 为最大载荷力，L 为桡骨夹具跨度，b、h 分别为桡骨中点施加负荷处横截面的宽度及高度。
1.4.6 Micro-CT检测 术后 16 周每组同上法各处死 6 只动物，以植入物为中心，截取长度为 2.5 cm 带尺、桡骨的组织块。使用 Micro-CT 机对标本进行扫描，用 Micview 软件进行三维重建；然后选取桡骨缺损植骨部位设定为分析感兴趣区域（region of interest，ROI）；采用 MicroviewABA2.1.2 软件定量分析骨缺损处新生骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。最后采用 Overlay 叠加的方法以不同颜色来复合显示各个标本骨缺损区域内的植入材料和新生骨。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后 2 h 内动物逐渐苏醒，回笼饲养；术后 3～7 d 精神状态好转，食量增加，术侧肢体逐渐部分负重活动；2 周后肢体活动基本恢复正常，跛行消失，体质量恢复至术前水平。术后切口均 Ⅰ 期愈合，无感染、植入物脱出现象；手术动物全部成活。
2.2 X 线片观察
术后当日，可见两组植入物位置良好，无明显位移；术后 4 周，两组骨缺损处植入物影像清晰，植入物与宿主骨结合牢固无松动，界面密度减低，其中实验组界面周围少量低密度云雾状影像；术后 8 周，两组界面周围均可见云雾状骨痂形成，密度明显增高，植入物位置良好，实验组骨痂形成多于对照组；术后 16 周，两组界面骨结合牢固，未见植入物松动、折断及移位现象，骨折线消失，实验组骨痂塑形好于对照组。见图 3。
图3
两组术后各时间点 X 线片观察
a. 实验组术后当日；b. 实验组术后 4 周；c. 实验组术后 8 周；d. 实验组术后 16 周；e. 对照组术后当日；f. 对照组术后 4 周；g. 对照组术后 8 周；h. 对照组术后 16 周
Figure3. X-ray films observation at each time point after operation in 2 groupsa. At the day after operation in experimental group; b. At 4 weeks after operation in experimental group; c. At 8 weeks after operation in experimental group; d. At 16 weeks after operation in experimental group; e. At the day after operation in control group; f. At 4 weeks after operation in control group; g. At 8 weeks after operation in control group; h. At 16 weeks after operation in control group
2.3 HE染色观察
术后 4 周，实验组钽-骨界面纤维结缔组织膜较薄，其间有大量成纤维细胞、大量新生毛细血管和新生软骨基质生成，以及新生软骨化骨生成；对照组钽-骨界面纤维结缔组织膜较实验组稍厚，其间可见增生的毛细血管、成纤维细胞及部分软骨化骨。术后 8 周，实验组钽-骨界面纤维膜基本消失，软骨化骨明显增多，毛细血管及成纤维细胞减少，大量成骨细胞增生，新生骨与界面紧密接触；对照组钽-骨界面纤维膜基本消失，新生软骨化骨增多并长入宿主骨内，仍可见较多小血管。术后 16 周，实验组钽-骨界面已形成了片状软骨化骨，同时呈编织状的骨小梁结构形成，部分区域骨小梁增粗形成了片状骨，界面纤维膜消失，新生骨与宿主骨融合；对照组钽-骨界面同样形成了编织状的骨小梁结构，小梁弯曲状排列，界面纤维膜消失。见图 4。
图4
两组术后各时间点 HE 染色观察（×100）
a. 实验组术后 4 周；b.实验组术后 8 周；c. 实验组术后 16 周；d. 对照组术后 4 周；e. 对照组术后 8 周；f. 对照组术后 16 周
Figure4. HE staining observation at each time point after operation in 2 groups (×100)a. At 4 weeks after operation in experimental group; b. At 8 weeks after operation in experimental group; c. At 16 weeks after operation in experimental group; d. At 4 weeks after operation in control group; e. At 8 weeks after operation in control group; f. At 16 weeks after operation in control group
2.4 甲苯胺蓝染色观察
术后 4 周，实验组钽-骨界面结合较紧密，钽棒孔洞内可见少量蓝染新生骨组织从边缘长入，并见小血管长入；对照组钽-骨界面紧密结合，但二者之间可见薄层结缔组织膜，可见小血管形成但未见明显新骨长入。术后 8 周，实验组钽-骨界面及钽棒孔洞内可见新生骨组织长入并伴随大量小血管长入，多孔钽周边也见薄层新生骨组织包绕；对照组呈条索状新生骨小梁向多孔钽深层长入，充满孔洞，同时伴有纤维组织及血管长入。术后 16 周，实验组骨缺损区域多孔钽孔隙内部更深层已被新骨填充大部分，钽-骨界面无缝隙；对照组新生骨已充满多孔钽孔洞大部分，并与孔洞壁紧密结合，孔洞内仍可见纤维及血管。见图 5。
图5
两组术后各时间点甲苯胺蓝染色观察（×200）
a. 实验组术后 4 周；b.实验组术后 8 周；c. 实验组术后 16 周；d. 对照组术后 4 周；e. 对照组术后 8 周；f. 对照组术后 16 周
Figure5. Toluidine blue staining observation at each time point after operation in 2 groups (×200)a. At 4 weeks after operation in experimental group; b. At 8 weeks after operation in experimental group; c. At 16 weeks after operation in experimental group; d. At 4 weeks after operation in control group; e. At 8 weeks after operation in control group; f. At 16 weeks after operation in control group
2.5 生物力学测试
术后 16 周，两组三点弯曲试验测定结果显示，实验组最大载荷力和抗弯曲强度分别为（96.54±7.21）N、（91.26±1.76）MPa，均明显大于对照组[分别为（82.65±5.65）N、（78.53±1.16）MPa]，差异有统计学意义（t=3.715，P=0.004；t=14.801，P=0.000）。
2.6 Micro-CT 检测
术后 16 周 Micro-CT 冠状面、横断面扫描及三维重建图像可见两组材料与骨界面及周围表面孔隙内均有骨组织生长，界面骨结合牢固；两组材料均未出现断裂；其中实验组新生骨痂明显多于对照组。见图 6。定量分析示，实验组新生骨 BV/TV 为 32.63%±3.56%，显著高于对照组的 25.07%±4.34%，差异有统计学意义（t=3.299，P=0.008）。
图6
术后 16 周两组 Micro-CT 检查（浅蓝色为钽金属，黄色为新生骨）
从左至右分别为冠状面、横断面扫描及三维重建图像a. 实验组；b. 对照组
Figure6. Micro-CT at 16 weeks after operation in 2 groups (light blue was tantalum, yellow was new bone)From left to right for coronal, cross-sectional, and three-dimensional reconstruction images a. Experimental group; b. Control group
3 讨论
目前，自体骨移植术是治疗骨缺损最有效的方法。然而，对于大范围骨缺损，自体骨有时不能满足骨量需求，同时自体骨移植术供区取骨后往往造成一定并发症，从而限制了其临床应用[12]。多孔骨替代材料由于具有与天然骨相似的三维空间结构，现已成为较理想的骨替代材料。研究表明，多孔结构能够促进组织向植入物内部长入，加速植入物与宿主骨之间的骨传导及骨整合，能有效增强植入物的稳定性[13-14]。大的连通孔及孔径能为血管长入材料及血管管腔的发育成熟提供更大空间，使骨组织工程支架材料迅速地再血管化，从而促进新生骨组织的生长和发育[15]。本研究所采用的多孔钽支架材料是经粉末浇注高温煅烧技术制备，呈三维立体结构，具有与骨骼相近的弹性模量（2.8～3.2 GPa）、较高的孔隙率（65%～80%）、适合骨组织长入的孔径（400～600 μm）及连通小孔（50～200 μm）、良好的抗腐蚀性及高表面摩擦力等优点，符合理想骨移植替代材料的基本要求。判断一种骨替代材料研发成功与否，不仅要求对其进行基础理化性能和体外生物相容性等实验评估，还必须将其植入体内骨缺损部位，检测其体内生物相容性、骨传导、骨诱导能力，进而评价其骨缺损修复能力。因此，本实验在前期体外实验评定基础上，将支架材料植入动物体内节段性骨缺损部位，以评估其骨修复能力。
对于动物模型的选择，结合大量国内外文献[16-17]，我们最终选择采用 1.5 cm 的兔桡骨骨缺损模型，此模型是用于验证骨移植材料有效性及安全性的常用模型，并且广泛应用于节段性骨缺损修复的体内动物实验中[18-20]。
骨替代材料移植修复过程主要由再血管化、骨再生、骨整合几个基本环节组成，其中再血管化是最基本的环节[21]。带蒂筋膜瓣包裹植入物后可使其表面丰富的毛细血管从各个方向长入多孔材料接触面，增加了材料血供，可使血液中的营养物质、氧气及成骨细胞前体细胞进入骨缺损处，为骨再生及骨整合提供了有利条件。同时，筋膜瓣作为屏障膜包裹植入物，使骨缺损区形成一个成骨空间，可将成纤维细胞、上皮细胞、纤维蛋白等物质阻挡在其外侧，而成骨细胞及成骨因子则在成骨空间内大量积聚，使血液中的营养物质、氧气及成骨细胞前体细胞进入骨缺损处，促使成骨细胞活跃、加快局部新骨形成，提高了多孔材料的骨整合能力。此外，丰富的血运还可以提高骨缺损部位抗感染能力，是临床上常用的治疗骨缺损、骨髓炎的方法之一。
本研究中我们采用以下措施，避免了外在因素对结果的影响：① 两组选择的新西兰大耳白兔在月龄及体质量上完全相同，并且为同一批次动物。② 实验条件相同，均在同一间清洁级手术室完成，严格按照无菌操作。③ 实验时桡骨截断部位及断端骨间膜、骨膜切除范围完全按照经典术式操作方法，避免骨缺损自行愈合，排除了实验部位及骨膜和骨间膜对骨缺损愈合的影响。④ 手术操作均为同一位高年资医师操作，标本采集也为同一操作者完成，二者均不知晓对方操作情况，排除人为因素对实验结果的影响。此外，由于筋膜菲薄并且非常柔软，对多孔钽起不到限制作用，可以排除此方面对实验结果的干扰。因此，本研究不存在其他因素对实验结果的影响，两组实验差异仅为有无使用带血管筋膜瓣所致。
影像学分析结果显示，无论是二维 X 线片上，还是三维 Micro-CT 重建图像上，实验组骨痂形成时间均早于对照组，骨痂形成量多于对照组，说明早期的血管化直接影响了骨缺损修复全过程。此结果与既往研究结果一致[22]。
我们通过脱钙组织切片 HE 染色及不脱钙硬组织切片甲苯胺蓝染色光镜下观察发现，实验组早期界面有大量新生毛细血管和新生软骨基质生成，并向孔隙内部生长，且形成的纤维组织膜明显薄于对照组，说明筋膜瓣作为屏障具有阻挡纤维组织的能力，同时还增加了材料表面血供，促进了成骨细胞分化、黏附与增殖，加快新骨生成。
此外，生物力学测试也是检验骨移植材料体内研究的一项重要指标。通过三点弯曲试验可评估植入物与宿主骨界面的力学性能。本研究结果显示，术后 16 周实验组最大载荷力和抗弯曲强度均高于对照组，说明筋膜包裹后可加快植入物与宿主骨界面骨痂生长速度及后期新骨塑形，提高了骨缺损部位的力学稳定性。这一点与既往研究相一致[23]。
综上述，应用筋膜瓣包裹国产多孔钽修复兔节段性骨缺损，无论是骨痂生成速度，还是骨痂生长的质和量均得到明显提高，有利于骨缺损的修复。经前期实验已证实[8-9]，国产多孔钽通过带蒂筋膜瓣促进其再血管化，而更好地发挥其良好的促成骨作用。但本研究动物体内多孔钽植入实验仅观察到术后 16 周，对于大段骨缺损来说，虽然骨塑形已基本完成，但还需更长时间观察骨形成变化，将在接下来实验中进一步补充、完善。此外，对于材料内血管化的定量分析及机制等还需进一步研究。
由各种创伤、肿瘤及先天性疾病造成的骨缺损，尤其是长骨节段性骨缺损，一直是骨科治疗领域亟待解决的难题。近年来，对骨移植替代材料逐渐深入的研究与发展，为骨组织的修复重建提供了新的思路和方法。目前常用的可降解材料虽然具有与松质骨相似的微观三维立体多孔结构，适合于骨的长入和矿化，但其力学强度不足，限制了其在关节、脊柱及肢体等负重部位骨缺损中的应用[1]。多孔钽金属凭借其良好的机械性能、抗疲劳性、生物相容性、三维多孔结构、高孔隙率、低弹性模量、高摩擦系数、抗腐蚀性、骨传导性及低细菌黏附性等特点，广泛应用于关节、脊柱及肢体负重部位骨缺损的修复[2-6]。目前临床上应用的多孔钽骨移植替代材料由美国 Zimmer 公司生产，由于其价格昂贵，难以在临床中广泛推广。因此，多孔钽材料国产化一直是国内科研工作者攻关的课题。由重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构自主研发的国产多孔钽材料，经过前期体内、外实验，已证实具有良好的生物相容性[3, 7-10]。为了进一步增强国产多孔钽体内骨传导性，本研究尝试采用带蒂筋膜瓣包裹多孔钽修复兔桡骨节段性骨缺损，通过影像学、组织形态学及生物力学等方法，检测其骨缺损的修复能力，为今后国产多孔钽应用于临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
6～8 月龄新西兰大白兔 60 只，雌雄不限，体质量 2.5～3.0 kg，由华北理工大学动物实验中心提供。
多孔钽棒（重庆润泽医疗器械有限公司），外观呈深灰色，表面及横断面可见均匀分布的孔径为 400～600 μm 的蜂窝状孔隙，孔隙率为 65%～80%。采用粉末浇注高温煅烧技术，制成直径为 3.5 mm，高 15～25 mm 的多孔圆柱体（图 1）。
图1
多孔钽棒外观
Figure1.
The appearance of the porous tantalum
微型摆锯（北京骨科研究所）；光学显微镜（Olympus 公司，日本）；数字化 X 线机（Siemens 公司，德国）；ElectroForce 3200 生物力学试验机（BOSE 公司，美国）；explore Locus SP Micro-CT、Micview 三维重建处理软件及 ABA 专用骨骼分析软件（通用公司，美国）；Leica RM-2145 组织切片机、Leica SP 1600 硬组织切片机（Leica 公司，德国）。
1.2 兔桡骨节段性骨缺损模型建立
取新西兰大耳白兔 60 只，术前禁食 12 h 后，以 10% 水合氯醛（3 mL/kg）缓慢腹腔注射麻醉。取右前肢桡侧中段长约 3.5 cm 切口，以桡骨弧顶为中心，用微型摆锯低速截骨 1.5 cm，生理盐水连续冷却降温，彻底切除骨缺损处及断端两侧骨膜及尺桡骨间骨间膜，注意保证断端平整，彻底止血，无菌生理盐水反复冲洗伤口，建立兔桡骨节段性骨缺损模型（图 2a）。
图2
手术步骤
a. 兔桡骨节段性骨缺损模型；b. 骨缺损处植入多孔钽棒；c. 实验组多孔钽棒表面筋膜包裹；d. 闭合切口
Figure2. Surgical proceduresa. The model of segmental bone defects in rabbit’s radius; b. The porous tantalum implanted in bone defect; c. The porous tantalum encapsulated with pedicled fascial flap in experimental group; d. Closed incision
1.3 实验分组及方法
将实验动物随机分为两组，每组 30 只，实验组为多孔钽棒+筋膜包裹组，对照组为单纯多孔钽棒组。将长 15 mm、直径 3.5 mm 的圆柱形多孔钽棒分别以嵌插方式植入两组右侧桡骨骨缺损处（图 2b）。其中实验组筋膜瓣制备及固定：于切口周围皮下筋膜组织层锐性切取约 30 mm×25 mm 大小富含毛细血管网的薄层带蒂筋膜瓣，保留宽度为 30 mm 蒂部，将筋膜瓣穿过肌肉隧道，转移至骨缺损处，环形包裹嵌插至桡骨骨缺损处的植入物，并将筋膜用 7-0 显微缝合线固定于远、近端周围骨膜组织上（图 2c）[11]。为预防感染，材料植入后再次生理盐水冲洗，局部喷洒青霉素注射液，用肌肉包裹覆盖缺损区域，依次用 5-0 可吸收线间断逐层缝合伤口，不作内、外固定（图 2d）。术后立即肌肉注射青霉素 40 万 U/只，连续 3 d，伤口处涂抹聚维酮碘溶液消毒，同时术后即刻行 X 线片检查，确认植入物位置是否良好。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 术后观察实验动物饮食、日常活动能力、伤口愈合情况（如有无肿胀、分泌物、植入物排出）、动物死亡情况及实验前后体质量变化。
1.4.2 X线片观察 分别于术后当日及 4、8、16 周将实验动物麻醉后，在相同条件（100 mA、50 kV、10 ms）和投照距离（75 cm）行右侧桡骨正位 DR 数字 X 线片检查，观察骨缺损修复情况。
1.4.3 HE染色观察 两组分别于术后 4、8、16 周采用空气栓塞法各处死 3 只动物，以骨缺损区为中心截取长 2.5 cm 骨组织标本，经 4% 多聚甲醛固定、5% 硝酸-甲醛脱钙液脱钙后取出多孔钽棒。自来水冲洗除酸、常规脱水，透明，浸蜡，包埋；用 Leica RM-2145 组织切片机切片，厚度 4 μm，在标本中心处纵向冠状面切取 2～3 片；经铺片、贴片、烘片、脱蜡、脱水后，行 HE 染色，光镜下观察两组植入物与宿主骨界面新骨生成情况。
1.4.4 甲苯胺蓝染色观察 两组分别于术后 4、8、16 周同上法各处死 3 只动物并截取长 2.5 cm 骨组织标本，经 4% 多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、包埋液包埋后，Leica SP 1600 硬组织切片机沿平行于多孔钽棒的纵轴切片，厚度约 150 μm；再磨片至 20 μm 厚，干燥，脱塑；行甲苯胺蓝染色，光镜下观察两组植入物与宿主骨界面及孔隙内的新骨生成情况。
1.4.5 生物力学测试 术后 16 周每组同上法各处死 6 只动物，取植入物新鲜标本，完整剔净软组织，在生物力学试验机上用夹具将桡骨两端固定，于植入物中点施加载荷，作三点弯曲生物力学测定。试验参数：夹具跨度 50 mm，速度 10 mm/min，最大压力负荷 1 000 N。测量时保持各标本位置一致，并保持标本湿润状态，匀速加载，直至骨折。记录两组标本最大载荷力，并通过以下公式计算出两组标本抗弯曲强度：Fmax×3×L/2bh2。其中 Fmax 为最大载荷力，L 为桡骨夹具跨度，b、h 分别为桡骨中点施加负荷处横截面的宽度及高度。
1.4.6 Micro-CT检测 术后 16 周每组同上法各处死 6 只动物，以植入物为中心，截取长度为 2.5 cm 带尺、桡骨的组织块。使用 Micro-CT 机对标本进行扫描，用 Micview 软件进行三维重建；然后选取桡骨缺损植骨部位设定为分析感兴趣区域（region of interest，ROI）；采用 MicroviewABA2.1.2 软件定量分析骨缺损处新生骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。最后采用 Overlay 叠加的方法以不同颜色来复合显示各个标本骨缺损区域内的植入材料和新生骨。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后 2 h 内动物逐渐苏醒，回笼饲养；术后 3～7 d 精神状态好转，食量增加，术侧肢体逐渐部分负重活动；2 周后肢体活动基本恢复正常，跛行消失，体质量恢复至术前水平。术后切口均 Ⅰ 期愈合，无感染、植入物脱出现象；手术动物全部成活。
2.2 X 线片观察
术后当日，可见两组植入物位置良好，无明显位移；术后 4 周，两组骨缺损处植入物影像清晰，植入物与宿主骨结合牢固无松动，界面密度减低，其中实验组界面周围少量低密度云雾状影像；术后 8 周，两组界面周围均可见云雾状骨痂形成，密度明显增高，植入物位置良好，实验组骨痂形成多于对照组；术后 16 周，两组界面骨结合牢固，未见植入物松动、折断及移位现象，骨折线消失，实验组骨痂塑形好于对照组。见图 3。
图3
两组术后各时间点 X 线片观察
a. 实验组术后当日；b. 实验组术后 4 周；c. 实验组术后 8 周；d. 实验组术后 16 周；e. 对照组术后当日；f. 对照组术后 4 周；g. 对照组术后 8 周；h. 对照组术后 16 周
Figure3. X-ray films observation at each time point after operation in 2 groupsa. At the day after operation in experimental group; b. At 4 weeks after operation in experimental group; c. At 8 weeks after operation in experimental group; d. At 16 weeks after operation in experimental group; e. At the day after operation in control group; f. At 4 weeks after operation in control group; g. At 8 weeks after operation in control group; h. At 16 weeks after operation in control group
2.3 HE染色观察
术后 4 周，实验组钽-骨界面纤维结缔组织膜较薄，其间有大量成纤维细胞、大量新生毛细血管和新生软骨基质生成，以及新生软骨化骨生成；对照组钽-骨界面纤维结缔组织膜较实验组稍厚，其间可见增生的毛细血管、成纤维细胞及部分软骨化骨。术后 8 周，实验组钽-骨界面纤维膜基本消失，软骨化骨明显增多，毛细血管及成纤维细胞减少，大量成骨细胞增生，新生骨与界面紧密接触；对照组钽-骨界面纤维膜基本消失，新生软骨化骨增多并长入宿主骨内，仍可见较多小血管。术后 16 周，实验组钽-骨界面已形成了片状软骨化骨，同时呈编织状的骨小梁结构形成，部分区域骨小梁增粗形成了片状骨，界面纤维膜消失，新生骨与宿主骨融合；对照组钽-骨界面同样形成了编织状的骨小梁结构，小梁弯曲状排列，界面纤维膜消失。见图 4。
图4
两组术后各时间点 HE 染色观察（×100）
a. 实验组术后 4 周；b.实验组术后 8 周；c. 实验组术后 16 周；d. 对照组术后 4 周；e. 对照组术后 8 周；f. 对照组术后 16 周
Figure4. HE staining observation at each time point after operation in 2 groups (×100)a. At 4 weeks after operation in experimental group; b. At 8 weeks after operation in experimental group; c. At 16 weeks after operation in experimental group; d. At 4 weeks after operation in control group; e. At 8 weeks after operation in control group; f. At 16 weeks after operation in control group
2.4 甲苯胺蓝染色观察
术后 4 周，实验组钽-骨界面结合较紧密，钽棒孔洞内可见少量蓝染新生骨组织从边缘长入，并见小血管长入；对照组钽-骨界面紧密结合，但二者之间可见薄层结缔组织膜，可见小血管形成但未见明显新骨长入。术后 8 周，实验组钽-骨界面及钽棒孔洞内可见新生骨组织长入并伴随大量小血管长入，多孔钽周边也见薄层新生骨组织包绕；对照组呈条索状新生骨小梁向多孔钽深层长入，充满孔洞，同时伴有纤维组织及血管长入。术后 16 周，实验组骨缺损区域多孔钽孔隙内部更深层已被新骨填充大部分，钽-骨界面无缝隙；对照组新生骨已充满多孔钽孔洞大部分，并与孔洞壁紧密结合，孔洞内仍可见纤维及血管。见图 5。
图5
两组术后各时间点甲苯胺蓝染色观察（×200）
a. 实验组术后 4 周；b.实验组术后 8 周；c. 实验组术后 16 周；d. 对照组术后 4 周；e. 对照组术后 8 周；f. 对照组术后 16 周
Figure5. Toluidine blue staining observation at each time point after operation in 2 groups (×200)a. At 4 weeks after operation in experimental group; b. At 8 weeks after operation in experimental group; c. At 16 weeks after operation in experimental group; d. At 4 weeks after operation in control group; e. At 8 weeks after operation in control group; f. At 16 weeks after operation in control group
2.5 生物力学测试
术后 16 周，两组三点弯曲试验测定结果显示，实验组最大载荷力和抗弯曲强度分别为（96.54±7.21）N、（91.26±1.76）MPa，均明显大于对照组[分别为（82.65±5.65）N、（78.53±1.16）MPa]，差异有统计学意义（t=3.715，P=0.004；t=14.801，P=0.000）。
2.6 Micro-CT 检测
术后 16 周 Micro-CT 冠状面、横断面扫描及三维重建图像可见两组材料与骨界面及周围表面孔隙内均有骨组织生长，界面骨结合牢固；两组材料均未出现断裂；其中实验组新生骨痂明显多于对照组。见图 6。定量分析示，实验组新生骨 BV/TV 为 32.63%±3.56%，显著高于对照组的 25.07%±4.34%，差异有统计学意义（t=3.299，P=0.008）。
图6
术后 16 周两组 Micro-CT 检查（浅蓝色为钽金属，黄色为新生骨）
从左至右分别为冠状面、横断面扫描及三维重建图像a. 实验组；b. 对照组
Figure6. Micro-CT at 16 weeks after operation in 2 groups (light blue was tantalum, yellow was new bone)From left to right for coronal, cross-sectional, and three-dimensional reconstruction images a. Experimental group; b. Control group
3 讨论
目前，自体骨移植术是治疗骨缺损最有效的方法。然而，对于大范围骨缺损，自体骨有时不能满足骨量需求，同时自体骨移植术供区取骨后往往造成一定并发症，从而限制了其临床应用[12]。多孔骨替代材料由于具有与天然骨相似的三维空间结构，现已成为较理想的骨替代材料。研究表明，多孔结构能够促进组织向植入物内部长入，加速植入物与宿主骨之间的骨传导及骨整合，能有效增强植入物的稳定性[13-14]。大的连通孔及孔径能为血管长入材料及血管管腔的发育成熟提供更大空间，使骨组织工程支架材料迅速地再血管化，从而促进新生骨组织的生长和发育[15]。本研究所采用的多孔钽支架材料是经粉末浇注高温煅烧技术制备，呈三维立体结构，具有与骨骼相近的弹性模量（2.8～3.2 GPa）、较高的孔隙率（65%～80%）、适合骨组织长入的孔径（400～600 μm）及连通小孔（50～200 μm）、良好的抗腐蚀性及高表面摩擦力等优点，符合理想骨移植替代材料的基本要求。判断一种骨替代材料研发成功与否，不仅要求对其进行基础理化性能和体外生物相容性等实验评估，还必须将其植入体内骨缺损部位，检测其体内生物相容性、骨传导、骨诱导能力，进而评价其骨缺损修复能力。因此，本实验在前期体外实验评定基础上，将支架材料植入动物体内节段性骨缺损部位，以评估其骨修复能力。
对于动物模型的选择，结合大量国内外文献[16-17]，我们最终选择采用 1.5 cm 的兔桡骨骨缺损模型，此模型是用于验证骨移植材料有效性及安全性的常用模型，并且广泛应用于节段性骨缺损修复的体内动物实验中[18-20]。
骨替代材料移植修复过程主要由再血管化、骨再生、骨整合几个基本环节组成，其中再血管化是最基本的环节[21]。带蒂筋膜瓣包裹植入物后可使其表面丰富的毛细血管从各个方向长入多孔材料接触面，增加了材料血供，可使血液中的营养物质、氧气及成骨细胞前体细胞进入骨缺损处，为骨再生及骨整合提供了有利条件。同时，筋膜瓣作为屏障膜包裹植入物，使骨缺损区形成一个成骨空间，可将成纤维细胞、上皮细胞、纤维蛋白等物质阻挡在其外侧，而成骨细胞及成骨因子则在成骨空间内大量积聚，使血液中的营养物质、氧气及成骨细胞前体细胞进入骨缺损处，促使成骨细胞活跃、加快局部新骨形成，提高了多孔材料的骨整合能力。此外，丰富的血运还可以提高骨缺损部位抗感染能力，是临床上常用的治疗骨缺损、骨髓炎的方法之一。
本研究中我们采用以下措施，避免了外在因素对结果的影响：① 两组选择的新西兰大耳白兔在月龄及体质量上完全相同，并且为同一批次动物。② 实验条件相同，均在同一间清洁级手术室完成，严格按照无菌操作。③ 实验时桡骨截断部位及断端骨间膜、骨膜切除范围完全按照经典术式操作方法，避免骨缺损自行愈合，排除了实验部位及骨膜和骨间膜对骨缺损愈合的影响。④ 手术操作均为同一位高年资医师操作，标本采集也为同一操作者完成，二者均不知晓对方操作情况，排除人为因素对实验结果的影响。此外，由于筋膜菲薄并且非常柔软，对多孔钽起不到限制作用，可以排除此方面对实验结果的干扰。因此，本研究不存在其他因素对实验结果的影响，两组实验差异仅为有无使用带血管筋膜瓣所致。
影像学分析结果显示，无论是二维 X 线片上，还是三维 Micro-CT 重建图像上，实验组骨痂形成时间均早于对照组，骨痂形成量多于对照组，说明早期的血管化直接影响了骨缺损修复全过程。此结果与既往研究结果一致[22]。
我们通过脱钙组织切片 HE 染色及不脱钙硬组织切片甲苯胺蓝染色光镜下观察发现，实验组早期界面有大量新生毛细血管和新生软骨基质生成，并向孔隙内部生长，且形成的纤维组织膜明显薄于对照组，说明筋膜瓣作为屏障具有阻挡纤维组织的能力，同时还增加了材料表面血供，促进了成骨细胞分化、黏附与增殖，加快新骨生成。
此外，生物力学测试也是检验骨移植材料体内研究的一项重要指标。通过三点弯曲试验可评估植入物与宿主骨界面的力学性能。本研究结果显示，术后 16 周实验组最大载荷力和抗弯曲强度均高于对照组，说明筋膜包裹后可加快植入物与宿主骨界面骨痂生长速度及后期新骨塑形，提高了骨缺损部位的力学稳定性。这一点与既往研究相一致[23]。
综上述，应用筋膜瓣包裹国产多孔钽修复兔节段性骨缺损，无论是骨痂生成速度，还是骨痂生长的质和量均得到明显提高，有利于骨缺损的修复。经前期实验已证实[8-9]，国产多孔钽通过带蒂筋膜瓣促进其再血管化，而更好地发挥其良好的促成骨作用。但本研究动物体内多孔钽植入实验仅观察到术后 16 周，对于大段骨缺损来说，虽然骨塑形已基本完成，但还需更长时间观察骨形成变化，将在接下来实验中进一步补充、完善。此外，对于材料内血管化的定量分析及机制等还需进一步研究。
