引用本文： 高润子, 夏天卫, 刘金柱, 袁兆丰, 环大维, 沈计荣. 基于“三柱结构”的中日友好医院分型L2型及L3型股骨头坏死标本骨微结构及病理学研究. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(8): 1003-1010. doi: 10.7507/1002-1892.202203108 复制
股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常见病与难治病，我国约有812万15岁以上非创伤ONFH患者且增长速度逐年上升[1-2]。中日友好医院（CJFH）分型是目前国内较为常用的ONFH分型标准[3]，但该分型基于股骨头“三柱理论”，主观性较强，缺乏形态学、病理学等证据支持，且其从单一层面的二维图像划分股骨头，无法反映股骨头的立体空间状态。随着对ONFH病理生理学研究的不断深入，研究者们发现除了局部组织缺血缺氧的病理状态以外，骨细胞和成骨细胞数量减少[4-5]、血管内皮细胞损伤[6]、破骨细胞活性增强[7]、BMSCs成骨分化能力降低[8]、内皮祖细胞成血管分化能力限制[9]等病理现象均参与到ONFH的发生发展过程。股骨颈基底部旋转截骨术旨在将坏死区受累较小的内侧柱和/或中间柱旋转至外侧柱部位，替代坏死范围较大的原外侧柱，避免股骨头进一步塌陷，维持髋关节功能，并为坏死区修复提供相对良好的力学环境，但目前仍缺乏相关基础研究证据[10-13]。
本研究尝试通过Micro-CT立体分析CJFH分型L2型及L3型ONFH标本三柱间的骨微结构差异，为股骨颈基底部旋转截骨术治疗ONFH提供形态学证据；同时通过病理学研究比较ONFH标本三柱间骨细胞凋亡的差异，为后期使用股骨颈基底部旋转截骨术联合抗细胞凋亡的传统中医药及现代生物医药方法治疗ONFH提供研究方向。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入标准：① 符合ONFH诊断标准，接受人工全髋关节置换术治疗，并知情同意将关节置换产生的股骨头用于后续Micro-CT扫描及病理学研究。② 影像学检查提示股骨头坏死范围大，软骨下骨塌陷明显；或伴有髋关节间隙狭窄，股骨头及髋臼广泛增生或囊性变等髋关节骨关节炎表现。③ CJFH分型L2型及L3型，国际骨循环协会（ARCO）分期ⅢC～Ⅳ期。
排除标准：① 伴严重心脑血管、消化、呼吸系统疾病，严重肝肾功能不全，严重营养不良，恶性肿瘤及精神疾病，血压、血糖控制不佳等手术相对、绝对禁忌证者。② 既往接受包括死骨清理、打压植骨、髓芯减压等已对股骨头内骨小梁结构造成破坏的保髋手术者。
2020年4月—2021年2月共纳入20例（20髋）患者，其中4例（4髋）Micro-CT扫描时发现股骨头三柱结构被取头器等手术操作破坏，予以剔除。最终16例（16髋）纳入后续研究，其中男9例，女7例；年龄24～72岁，平均51.9岁。CJFH分型：L2型7例，L3型9例。ARCO分期：ⅢC期6例，Ⅳ期10例。
1.2 主要试剂及仪器
中性组织固定液（南京化学试剂有限公司）；EDTA脱钙液（北京雷根生物技术有限公司）；免疫组织化学抗原修复缓冲液（Dako公司，丹麦）；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）免疫组织化学一抗（福州迈新生物技术开发有限公司）；酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司）；无水乙醇、二甲苯、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。显微镜载玻片、盖玻片（海门市神鹰实验器械厂）；电化黏附载玻片（江苏汇达医疗器械有限公司）。
Hiscan XM型Micro-CT、Hiscan Analyzer软件V3.0、Hiscan Reconstruct软件V3.0（苏州海斯菲德信息科技有限公司）；STP420ES自动脱水机（Thermo Fisher公司，美国）；PH60病理组织漂烘仪（常州派斯杰医疗设备有限公司）；Tissue-Tek组织包埋机、BM450组织包埋冷冻台、Tissue-Tek Prisma Plus全自动染色封片机（SAKURA公司，日本）；CR-601ST轮转式石蜡切片机（金华克拉泰仪器有限公司）；PT200抗原修复仪（Dako公司，丹麦）；DM 4B正置光学显微镜（Leica公司，德国）。
1.3 标本处理
手术取得患者股骨头标本后，及时用5～10倍体积中性组织固定液固定24～48 h；然后用PBS洗30 min×3次，再用纯水洗30 min×3次，充分冲洗中性组织固定液，中止标本固定；−80℃冰箱储存备用。
1.4 骨微结构研究
1.4.1 Micro-CT扫描
取出股骨头标本固定于Micro-CT载物台，用海绵泡沫垫高标本。由于人体股骨头标本体积较大，超过Micro-CT最大扫描窗，因此以胶带固定股骨头，使其在载物台上保持不动，分2～3段不间断扫描，获得完整股骨头扫描数据。扫描参数：分辨率70 μm，电压80 kV，电流100 μA，单次曝光时间50 ms，扫描角度间隔0.5°。
1.4.2 Micro-CT切割“三柱结构”
将股骨头扫描后得到的Micro-CT数据导入Hiscan Reconstruct软件V3.0进行数据重建，再使用Hiscan Analyzer软件V3.0进行三维模型重建，并在三维立体结构上对股骨头进行“三柱切割”。调取软件“free cut”功能，外侧立方体框架可实现对股骨头360° 切割；调整股骨头方向，将立方体框架调整成正中冠状位层面，还原CJFH分型所描述的股骨头“三柱结构”划分层面；使正中冠状位矩形与股骨头内外侧骨质呈切线，读取此时两切线之间距离，以股骨头正中冠状位内侧切线为股骨头宽度0的位置，以股骨头正中冠状位外侧切线为股骨头宽度1的位置，按占据股骨头宽度30%、40%、30%的“三柱结构”定义，计算股骨头宽度30%、70%所在位置，以此两点移动内、外侧切线，初步切割内侧柱、中间柱和外侧柱空间结构。见图1。
图1
Micro-CT切割股骨头“三柱结构”
a. 对扫描及重建后的数据进行三维重建；b. 调取软件“free cut”功能，外侧立方体框架可实现对股骨头360° 切割；c. 调整股骨头方向，计算股骨头宽度30%、70%所在位置，以此两点移动内、外侧切线；d～f. 初步切割出内侧柱、中间柱和外侧柱的空间结构
Figure1. “Three-columns structure” of the femoral head cut by Micro-CTa. Three-dimensional reconstruction of the scanned and reconstructed data; b. By using the “free cut” function of the software, the outer cube frame could realize 360° cutting of the femoral head; c. Adjusted the direction of the femoral head, calculated the position of 30% and 70% of the width of the femoral head, and moved the inner and outer tangents at these two points; d-f. Preliminarily cut out the spatial structure of medial column, middle column, and lateral column
1.4.3 去股骨颈及皮质骨的“三柱结构”数据重建
由于重建时残余的股骨颈结构会被计算入“三柱结构”中，而股骨距等致密结构会影响对“三柱结构”骨参数的分析，因此通过上述三维层面初步切割股骨头“三柱结构”后，尚不能直接对股骨头“三柱结构”进行骨量参数及骨小梁参数分析。同样，如果将皮质骨结构纳入对骨小梁结构相关骨参数的计算，也会影响对“三柱结构”骨小梁的判断，因此需予以去除。
将初步切割的股骨头三柱分别以新的数据对象导出，形成新的数据文件；在二维层面去除股骨颈，并在多个二维层面选取不包含皮质骨的区域，达到去除皮质骨的目的。见图2。
图2
用于不同骨参数计算的股骨头“三柱结构”划分
a～c. 将完成初步切割的外侧柱、中间柱、内侧柱保存为新的数据对象；d. 去除股骨颈并保存为新的数据对象；e、f. 二维层面去除皮质骨前后，绿色区域为不包括皮质骨的保留骨质；g～i. 去除股骨颈（上）和去除股骨颈及皮质骨（下）的外侧柱、中间柱、内侧柱
Figure2. Division of “three-columns structure” of femoral head for calculation of different bone parametersa-c. Saved the lateral column, middle column, and medial column after preliminary cutting as new data objects; d. Removed the femoral neck and saved it as a new data object; e, f. Before and after cortical bone removal on the two-dimensional plane, the green area was the reserved bone without cortical bone; g-i. The lateral column, middle column, and medial column after removal of the femoral neck (upper) and removal of the femoral neck and cortical bone (lower)
1.4.4 骨参数指标测量
去除股骨颈部分产生的数据用于分析骨量参数，包括骨体积分数（bone volume to total volume，BV/TV）和骨表面积骨体积比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）；去除股骨颈和皮质骨部分产生的数据用于分析骨小梁参数，包括骨小梁分离度（trabecular spacing/separation，Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）。
1.5 股骨头标本病理学研究
1.5.1 股骨头标本切割
取完成Micro-CT扫描的股骨头标本，根据解剖标志物区分内、外侧。尽量在最大冠状位位置使用摆锯切割股骨头，形成1块厚度为5～8 mm的含有股骨头“三柱结构”的冠状面骨块。对剩余股骨头标本行矢状位切割，按照占股骨头宽度30%、40%、30%，分别切割内侧柱、中间柱、外侧柱骨块，厚度5～8 mm。见图3。
图3
摆锯切割股骨头“三柱结构”
a. 完整股骨头标本；b. 最大冠状位切割包含股骨头“三柱结构”的骨块；c～e. 剩余股骨头组织切割出内侧柱、中间柱、外侧柱骨块
Figure3. Cutting “three-columns structure” of the femoral head with oscillation sawa. Intact femoral head specimen; b. The largest coronal bone block included the “three-columns structure” of the femoral head; c-e. The remaining femoral head tissue was cut into the medial column, middle column, and lateral column bone blocks
1.5.2 组织切片制作
将切割的骨块以EDTA脱钙4～5周，每周更换1次脱钙液；第3周更换脱钙液时开始检查骨组织脱钙情况，以大头针可轻松穿过骨组织为脱钙完成，避免脱钙过度影响组织切片染色。将脱钙后标本经乙醇梯度脱水过夜、二甲苯透明（30 min～2 h）处理后，石蜡包埋切片，片厚3～5 μm，展片、烘干约20 min备用。
1.5.3 HE染色观察
取部分冠状位大骨块切片常规行HE染色观察。200倍光镜下，于内侧柱、中间柱、外侧柱部位分别选取5个不同视野，计算空骨陷窝率 ［公式为：空骨陷窝数/（空骨陷窝数+正常骨细胞数）×100%］，取均值。
1.5.4 免疫组织化学染色观察
取部分三柱小骨块切片（每例患者选3张切片）脱蜡后行抗原修复，随后加入Bax、Bcl-2免疫组织化学一抗，4℃孵育过夜；PBS冲洗3 min×3次，加入酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃温育20 min；PBS冲洗3 min×3次，DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明后封片。200倍光镜下于内侧柱、中间柱、外侧柱切片分别选取5个不同视野，按以下公式计算Bcl-2及Bax染色阳性细胞率：阳性染色骨细胞数/视野内所有骨细胞数×100%，取均值。
1.6 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 骨微结构研究
CJFH分型L2型ONFH股骨头，三柱间BV/TV、Tb.Th和Tb.N比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中内侧柱各指标最大，外侧柱最小；外侧柱BS/BV和Tb.Sp显著大于内侧柱和中间柱，差异有统计学意义（P<0.05）；内侧柱和中间柱比较差异无统计学意义（P>0.05）。CJFH分型L3型ONFH股骨头，三柱间BS/BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N各骨参数指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。
表1
CJFH分型L2型ONFH股骨头“三柱结构”骨参数分析（n=7，
）
Table1.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L2 ONFH femoral head (n=7, 
)
表2
CJFH分型L3型ONFH股骨头“三柱结构”骨参数分析（n=9，
）
Table2.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L3 ONFH femoral head (n=9, 
)
2.2 股骨头标本病理学研究
2.2.1 标本大体观察
CJFH分型L2型ONFH股骨头标本可见外侧柱、中间柱广泛软骨下骨折及坏死区，坏死区骨质呈黄色泥沙样改变，骨小梁结构消失；硬化带为高密度白色条带，主要在软骨下骨折区域及正常骨组织区域与坏死区间隔部位，其骨小梁粗壮，骨小梁间隙狭小。内侧柱几乎为正常骨组织，骨小梁结构清晰。CJFH分型L3型ONFH股骨头标本软骨下骨折贯穿整个冠状位“三柱结构”，坏死区（无骨小梁结构）的范围波及至内侧柱。见图4。
图4
ONFH股骨头冠状位大体观察
N：坏死区、软骨下骨塌陷区 S：硬化带 H：健康区 a. CJFH分型L2型；b. CJFH分型L3型
Figure4. Coronal observation of ONFH femoral headN: Necrotic area, subchondral bone collapse area S: Sclerotic zone H: Healthy area a. CJFH type L2; b. CJFH type L3
2.2.2 HE染色观察
CJFH分型L2、L3型ONFH股骨头冠状位HE染色示，股骨头内骨髓大量坏死或发生脂肪变性；骨小梁结构扭曲、变细、断裂；软骨下骨骨折，软骨与软骨下骨分离；骨小梁上存在大量空骨陷窝，残存的骨细胞细胞核变扁，被挤压到细胞质一端。CJFH分型L3型病理改变重于L2型。见图5。
图5
CJFH分型L3型ONFH股骨头冠状位HE染色观察
a. 整体观（×200）；b. 骨髓坏死及脂肪变性（×500）；c. 骨小梁结构扭曲、变细、断裂（×500）；d. 软骨下骨折（×500）；e. 骨小梁见大量空骨陷窝（×250）
Figure5. HE staining observation of coronal CJFH type L3 ONFH femoral heada. Overall view (×200); b. Necrosis and steatosis of bone marrow (×500); c. Bone trabecular structure was distorted, thinned, and broken (×500); d. Subchondral fracture (×500); e. A large number of empty bone lacunae were found on the bone trabecula (×250)
CJFH分型L2型ONFH股骨头，内侧柱、中间柱、外侧柱空骨陷窝率分别为85.9%±0.5%、87.9%±0.5%、91.5%±0.4%，L3型ONFH股骨头分别为87.6%±0.4%、87.2%±0.6%、90.9%±0.5%，三柱间比较差异均无统计学意义（F=2.679，P=0.096；F=1.499，P=0.244）。
2.2.3 免疫组织化学染色观察
CJFH分型L2型和L3型ONFH股骨头“三柱结构”小骨块石蜡切片行Bcl-2及Bax免疫组织化学染色后，出现大量组织切片脱片，未脱片的切片仅见少量散在棕色染团，且阳性染色不在细胞质表达，为非特异性染色（图6），无法进行阳性细胞率计算。
图6
CJFH分型L3型ONFH股骨头“三柱结构”小骨块免疫组织化学染色观察示均为非特异性染色（×1 000）
a. Bax；b. Bcl-2
Figure6. The “three-column structure” of the small bone masses in the CJFH type L3 ONFH femoral head were observed by immunohistochemical staining showed non-specific staining (×1 000)a. Bax; b. Bcl-2
3 讨论
Micro-CT是一种非破坏性三维成像技术，可在不破坏样本情况下清楚显示样本内部显微结构，空间分辨率极高，可达微米级。与临床CT普遍采用的扇形X线束不同，Micro-CT通常采用锥形X线束，以提高射线利用率和空间分辨率，且在采集相同三维图像时速度远快于扇形X线束。其通过计算机软件将矢状面、冠状面、横截面进行三维重建，以便对感兴趣区域进行二维和三维分析。使用Micro-CT微米级空间分辨率以及三维重建功能下的三维骨参数分析，可对ONFH骨小梁的空间结构进行测评[14]。
既往研究发现ONFH股骨头内坏死区、硬化带、正常区中骨小梁的结构存在显著差异。Wang等[11]发现坏死区BV/TV、Tb.N较正常区显著减小、Tb.Sp显著增大，坏死区骨小梁抗应力能力下降，最终变薄、断裂，导致股骨头塌陷。而股骨颈基底部旋转截骨术治疗CJFH分型L2型及L3型ONFH的原理尚缺乏直接证据支持。本研究通过Micro-CT扫描 CJFH分型L2型及L3型ONFH 患者股骨头标本后，三维层面分割出内侧柱、中间柱、外侧柱结构，骨参数分析提示CJFH分型L2型ONFH股骨头标本外侧柱BV/TV、Tb.Th、Tb.N较内侧柱及中间柱均明显减小，BS/BV、Tb.Sp较内侧柱及中间柱均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；CJFH分型L3型ONFH股骨头外侧柱的各骨参数指标与内侧柱及中间柱比较差异均无统计学意义（P>0.05）。因此，从骨小梁空间结构变弱导致股骨头塌陷的理由出发，采用股骨颈基底部旋转截骨术治疗CJFH分型L2型ONFH可为患者提供一个骨量更多、骨小梁结构更好的外侧负重区域[13，15]；而治疗L3型ONFH患者则不能改变外侧负重区的骨小梁情况。所以股骨颈基底部旋转截骨术更适用于治疗CJFH分型L2型ONFH患者，治疗L3型ONFH患者时需谨慎，可能需要通过其他保髋手术进行外侧柱重建。
本研究中HE染色发现ONFH股骨头内骨髓大量坏死，骨小梁结构扭曲，软骨下骨骨折且软骨与软骨下骨分离；骨小梁存在大量空骨陷窝，残存骨细胞的细胞核变扁，被挤压到细胞质一端。且CJFH分型L3型的病理改变重于L2型，与CJFH分型理论较为吻合。故也验证了上述结论，即CJFH分型L3型ONFH无法通过旋转截骨构建更好的外侧柱。
另外，本研究行免疫组织化学染色时，骨组织石蜡切片出现脱片、非特异性染色的情况。除了骨组织行免疫组织化学染色难度较大之外，本研究在标本处理过程中也存在许多有损蛋白及抗原的不良因素：① 多数标本固定是在手术完成后进行，间隔数小时，此过程中可能存在骨组织溶解、蛋白物质丢失。② Micro-CT扫描需要完整股骨头标本，因此在标本固定时未能取出大小、厚度适宜的骨组织进行固定，完整的股骨头样本可能存在固定液渗透困难、固定不充分的情况。③ 由于实验安排无法一次完成骨组织Micro-CT扫描和骨组织切割，期间数次将标本放置于−80℃，可能在多次冻融过程中存在蛋白和抗原丢失。④ 摆锯切割骨组织时，高速震动产生的高温可能导致骨组织中蛋白丢失。为解决这些可能的问题，后续在标本研究过程中，可单独进行ONFH骨组织免疫组织化学的研究，及时将股骨头标本切割成小组织块，在切割过程中滴水防止摆锯温度过高，对完成切割的小骨块立刻进行固定。
综上述，本研究通过Micro-CT 微米级空间分辨率和三维重建功能下的三维骨参数分析以及HE染色和免疫组织化学染色结果分析，得出了以下结论：① CJFH分型L2型ONFH的股骨头拥有骨小梁结构更好的内侧柱和中间柱，通过股骨颈基底部旋转截骨术可重建骨小梁结构更好、骨量更大的外侧柱。而CJFH分型L3型ONFH患者，股骨头内侧柱和中间柱与外侧柱相比，骨小梁结构均遭到广泛破坏，股骨颈基底部旋转截骨术可能无法帮助其重建较原先更好的外侧柱结构。因此对于年轻的L3型患者，需谨慎选择股骨颈基底部旋转截骨术进行保髋干预。② CJFH分型L2及L3型ONFH股骨头标本中，“三柱结构”空骨陷窝率均在85%以上。尽管CJFH分型L2型ONFH的内侧柱及中间柱骨小梁破坏较外侧柱小，但三柱之间空骨陷窝率比较差异无统计学意义，提示终末期ONFH“三柱结构”中骨小梁破坏虽有差异，但共同的病理过程与骨细胞凋亡有关[16-17]，且该过程应较骨小梁结构破坏发生更早。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准（2020NL-162-02）；患者均知情同意
作者贡献声明 高润子：研究设计、数据收集整理及统计分析、文章撰写；夏天卫、刘金柱、袁兆丰、环大维：病例收集、标本处理；沈计荣：研究指导、行政及经费支持
股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常见病与难治病，我国约有812万15岁以上非创伤ONFH患者且增长速度逐年上升[1-2]。中日友好医院（CJFH）分型是目前国内较为常用的ONFH分型标准[3]，但该分型基于股骨头“三柱理论”，主观性较强，缺乏形态学、病理学等证据支持，且其从单一层面的二维图像划分股骨头，无法反映股骨头的立体空间状态。随着对ONFH病理生理学研究的不断深入，研究者们发现除了局部组织缺血缺氧的病理状态以外，骨细胞和成骨细胞数量减少[4-5]、血管内皮细胞损伤[6]、破骨细胞活性增强[7]、BMSCs成骨分化能力降低[8]、内皮祖细胞成血管分化能力限制[9]等病理现象均参与到ONFH的发生发展过程。股骨颈基底部旋转截骨术旨在将坏死区受累较小的内侧柱和/或中间柱旋转至外侧柱部位，替代坏死范围较大的原外侧柱，避免股骨头进一步塌陷，维持髋关节功能，并为坏死区修复提供相对良好的力学环境，但目前仍缺乏相关基础研究证据[10-13]。
本研究尝试通过Micro-CT立体分析CJFH分型L2型及L3型ONFH标本三柱间的骨微结构差异，为股骨颈基底部旋转截骨术治疗ONFH提供形态学证据；同时通过病理学研究比较ONFH标本三柱间骨细胞凋亡的差异，为后期使用股骨颈基底部旋转截骨术联合抗细胞凋亡的传统中医药及现代生物医药方法治疗ONFH提供研究方向。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入标准：① 符合ONFH诊断标准，接受人工全髋关节置换术治疗，并知情同意将关节置换产生的股骨头用于后续Micro-CT扫描及病理学研究。② 影像学检查提示股骨头坏死范围大，软骨下骨塌陷明显；或伴有髋关节间隙狭窄，股骨头及髋臼广泛增生或囊性变等髋关节骨关节炎表现。③ CJFH分型L2型及L3型，国际骨循环协会（ARCO）分期ⅢC～Ⅳ期。
排除标准：① 伴严重心脑血管、消化、呼吸系统疾病，严重肝肾功能不全，严重营养不良，恶性肿瘤及精神疾病，血压、血糖控制不佳等手术相对、绝对禁忌证者。② 既往接受包括死骨清理、打压植骨、髓芯减压等已对股骨头内骨小梁结构造成破坏的保髋手术者。
2020年4月—2021年2月共纳入20例（20髋）患者，其中4例（4髋）Micro-CT扫描时发现股骨头三柱结构被取头器等手术操作破坏，予以剔除。最终16例（16髋）纳入后续研究，其中男9例，女7例；年龄24～72岁，平均51.9岁。CJFH分型：L2型7例，L3型9例。ARCO分期：ⅢC期6例，Ⅳ期10例。
1.2 主要试剂及仪器
中性组织固定液（南京化学试剂有限公司）；EDTA脱钙液（北京雷根生物技术有限公司）；免疫组织化学抗原修复缓冲液（Dako公司，丹麦）；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）免疫组织化学一抗（福州迈新生物技术开发有限公司）；酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司）；无水乙醇、二甲苯、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。显微镜载玻片、盖玻片（海门市神鹰实验器械厂）；电化黏附载玻片（江苏汇达医疗器械有限公司）。
Hiscan XM型Micro-CT、Hiscan Analyzer软件V3.0、Hiscan Reconstruct软件V3.0（苏州海斯菲德信息科技有限公司）；STP420ES自动脱水机（Thermo Fisher公司，美国）；PH60病理组织漂烘仪（常州派斯杰医疗设备有限公司）；Tissue-Tek组织包埋机、BM450组织包埋冷冻台、Tissue-Tek Prisma Plus全自动染色封片机（SAKURA公司，日本）；CR-601ST轮转式石蜡切片机（金华克拉泰仪器有限公司）；PT200抗原修复仪（Dako公司，丹麦）；DM 4B正置光学显微镜（Leica公司，德国）。
1.3 标本处理
手术取得患者股骨头标本后，及时用5～10倍体积中性组织固定液固定24～48 h；然后用PBS洗30 min×3次，再用纯水洗30 min×3次，充分冲洗中性组织固定液，中止标本固定；−80℃冰箱储存备用。
1.4 骨微结构研究
1.4.1 Micro-CT扫描
取出股骨头标本固定于Micro-CT载物台，用海绵泡沫垫高标本。由于人体股骨头标本体积较大，超过Micro-CT最大扫描窗，因此以胶带固定股骨头，使其在载物台上保持不动，分2～3段不间断扫描，获得完整股骨头扫描数据。扫描参数：分辨率70 μm，电压80 kV，电流100 μA，单次曝光时间50 ms，扫描角度间隔0.5°。
1.4.2 Micro-CT切割“三柱结构”
将股骨头扫描后得到的Micro-CT数据导入Hiscan Reconstruct软件V3.0进行数据重建，再使用Hiscan Analyzer软件V3.0进行三维模型重建，并在三维立体结构上对股骨头进行“三柱切割”。调取软件“free cut”功能，外侧立方体框架可实现对股骨头360° 切割；调整股骨头方向，将立方体框架调整成正中冠状位层面，还原CJFH分型所描述的股骨头“三柱结构”划分层面；使正中冠状位矩形与股骨头内外侧骨质呈切线，读取此时两切线之间距离，以股骨头正中冠状位内侧切线为股骨头宽度0的位置，以股骨头正中冠状位外侧切线为股骨头宽度1的位置，按占据股骨头宽度30%、40%、30%的“三柱结构”定义，计算股骨头宽度30%、70%所在位置，以此两点移动内、外侧切线，初步切割内侧柱、中间柱和外侧柱空间结构。见图1。
图1
Micro-CT切割股骨头“三柱结构”
a. 对扫描及重建后的数据进行三维重建；b. 调取软件“free cut”功能，外侧立方体框架可实现对股骨头360° 切割；c. 调整股骨头方向，计算股骨头宽度30%、70%所在位置，以此两点移动内、外侧切线；d～f. 初步切割出内侧柱、中间柱和外侧柱的空间结构
Figure1. “Three-columns structure” of the femoral head cut by Micro-CTa. Three-dimensional reconstruction of the scanned and reconstructed data; b. By using the “free cut” function of the software, the outer cube frame could realize 360° cutting of the femoral head; c. Adjusted the direction of the femoral head, calculated the position of 30% and 70% of the width of the femoral head, and moved the inner and outer tangents at these two points; d-f. Preliminarily cut out the spatial structure of medial column, middle column, and lateral column
1.4.3 去股骨颈及皮质骨的“三柱结构”数据重建
由于重建时残余的股骨颈结构会被计算入“三柱结构”中，而股骨距等致密结构会影响对“三柱结构”骨参数的分析，因此通过上述三维层面初步切割股骨头“三柱结构”后，尚不能直接对股骨头“三柱结构”进行骨量参数及骨小梁参数分析。同样，如果将皮质骨结构纳入对骨小梁结构相关骨参数的计算，也会影响对“三柱结构”骨小梁的判断，因此需予以去除。
将初步切割的股骨头三柱分别以新的数据对象导出，形成新的数据文件；在二维层面去除股骨颈，并在多个二维层面选取不包含皮质骨的区域，达到去除皮质骨的目的。见图2。
图2
用于不同骨参数计算的股骨头“三柱结构”划分
a～c. 将完成初步切割的外侧柱、中间柱、内侧柱保存为新的数据对象；d. 去除股骨颈并保存为新的数据对象；e、f. 二维层面去除皮质骨前后，绿色区域为不包括皮质骨的保留骨质；g～i. 去除股骨颈（上）和去除股骨颈及皮质骨（下）的外侧柱、中间柱、内侧柱
Figure2. Division of “three-columns structure” of femoral head for calculation of different bone parametersa-c. Saved the lateral column, middle column, and medial column after preliminary cutting as new data objects; d. Removed the femoral neck and saved it as a new data object; e, f. Before and after cortical bone removal on the two-dimensional plane, the green area was the reserved bone without cortical bone; g-i. The lateral column, middle column, and medial column after removal of the femoral neck (upper) and removal of the femoral neck and cortical bone (lower)
1.4.4 骨参数指标测量
去除股骨颈部分产生的数据用于分析骨量参数，包括骨体积分数（bone volume to total volume，BV/TV）和骨表面积骨体积比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）；去除股骨颈和皮质骨部分产生的数据用于分析骨小梁参数，包括骨小梁分离度（trabecular spacing/separation，Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）。
1.5 股骨头标本病理学研究
1.5.1 股骨头标本切割
取完成Micro-CT扫描的股骨头标本，根据解剖标志物区分内、外侧。尽量在最大冠状位位置使用摆锯切割股骨头，形成1块厚度为5～8 mm的含有股骨头“三柱结构”的冠状面骨块。对剩余股骨头标本行矢状位切割，按照占股骨头宽度30%、40%、30%，分别切割内侧柱、中间柱、外侧柱骨块，厚度5～8 mm。见图3。
图3
摆锯切割股骨头“三柱结构”
a. 完整股骨头标本；b. 最大冠状位切割包含股骨头“三柱结构”的骨块；c～e. 剩余股骨头组织切割出内侧柱、中间柱、外侧柱骨块
Figure3. Cutting “three-columns structure” of the femoral head with oscillation sawa. Intact femoral head specimen; b. The largest coronal bone block included the “three-columns structure” of the femoral head; c-e. The remaining femoral head tissue was cut into the medial column, middle column, and lateral column bone blocks
1.5.2 组织切片制作
将切割的骨块以EDTA脱钙4～5周，每周更换1次脱钙液；第3周更换脱钙液时开始检查骨组织脱钙情况，以大头针可轻松穿过骨组织为脱钙完成，避免脱钙过度影响组织切片染色。将脱钙后标本经乙醇梯度脱水过夜、二甲苯透明（30 min～2 h）处理后，石蜡包埋切片，片厚3～5 μm，展片、烘干约20 min备用。
1.5.3 HE染色观察
取部分冠状位大骨块切片常规行HE染色观察。200倍光镜下，于内侧柱、中间柱、外侧柱部位分别选取5个不同视野，计算空骨陷窝率 ［公式为：空骨陷窝数/（空骨陷窝数+正常骨细胞数）×100%］，取均值。
1.5.4 免疫组织化学染色观察
取部分三柱小骨块切片（每例患者选3张切片）脱蜡后行抗原修复，随后加入Bax、Bcl-2免疫组织化学一抗，4℃孵育过夜；PBS冲洗3 min×3次，加入酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃温育20 min；PBS冲洗3 min×3次，DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明后封片。200倍光镜下于内侧柱、中间柱、外侧柱切片分别选取5个不同视野，按以下公式计算Bcl-2及Bax染色阳性细胞率：阳性染色骨细胞数/视野内所有骨细胞数×100%，取均值。
1.6 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 骨微结构研究
CJFH分型L2型ONFH股骨头，三柱间BV/TV、Tb.Th和Tb.N比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中内侧柱各指标最大，外侧柱最小；外侧柱BS/BV和Tb.Sp显著大于内侧柱和中间柱，差异有统计学意义（P<0.05）；内侧柱和中间柱比较差异无统计学意义（P>0.05）。CJFH分型L3型ONFH股骨头，三柱间BS/BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N各骨参数指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。
表1
CJFH分型L2型ONFH股骨头“三柱结构”骨参数分析（n=7，）
Table1.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L2 ONFH femoral head (n=7, )
表2
CJFH分型L3型ONFH股骨头“三柱结构”骨参数分析（n=9，）
Table2.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L3 ONFH femoral head (n=9, )
2.2 股骨头标本病理学研究
2.2.1 标本大体观察
CJFH分型L2型ONFH股骨头标本可见外侧柱、中间柱广泛软骨下骨折及坏死区，坏死区骨质呈黄色泥沙样改变，骨小梁结构消失；硬化带为高密度白色条带，主要在软骨下骨折区域及正常骨组织区域与坏死区间隔部位，其骨小梁粗壮，骨小梁间隙狭小。内侧柱几乎为正常骨组织，骨小梁结构清晰。CJFH分型L3型ONFH股骨头标本软骨下骨折贯穿整个冠状位“三柱结构”，坏死区（无骨小梁结构）的范围波及至内侧柱。见图4。
图4
ONFH股骨头冠状位大体观察
N：坏死区、软骨下骨塌陷区 S：硬化带 H：健康区 a. CJFH分型L2型；b. CJFH分型L3型
Figure4. Coronal observation of ONFH femoral headN: Necrotic area, subchondral bone collapse area S: Sclerotic zone H: Healthy area a. CJFH type L2; b. CJFH type L3
2.2.2 HE染色观察
CJFH分型L2、L3型ONFH股骨头冠状位HE染色示，股骨头内骨髓大量坏死或发生脂肪变性；骨小梁结构扭曲、变细、断裂；软骨下骨骨折，软骨与软骨下骨分离；骨小梁上存在大量空骨陷窝，残存的骨细胞细胞核变扁，被挤压到细胞质一端。CJFH分型L3型病理改变重于L2型。见图5。
图5
CJFH分型L3型ONFH股骨头冠状位HE染色观察
a. 整体观（×200）；b. 骨髓坏死及脂肪变性（×500）；c. 骨小梁结构扭曲、变细、断裂（×500）；d. 软骨下骨折（×500）；e. 骨小梁见大量空骨陷窝（×250）
Figure5. HE staining observation of coronal CJFH type L3 ONFH femoral heada. Overall view (×200); b. Necrosis and steatosis of bone marrow (×500); c. Bone trabecular structure was distorted, thinned, and broken (×500); d. Subchondral fracture (×500); e. A large number of empty bone lacunae were found on the bone trabecula (×250)
CJFH分型L2型ONFH股骨头，内侧柱、中间柱、外侧柱空骨陷窝率分别为85.9%±0.5%、87.9%±0.5%、91.5%±0.4%，L3型ONFH股骨头分别为87.6%±0.4%、87.2%±0.6%、90.9%±0.5%，三柱间比较差异均无统计学意义（F=2.679，P=0.096；F=1.499，P=0.244）。
2.2.3 免疫组织化学染色观察
CJFH分型L2型和L3型ONFH股骨头“三柱结构”小骨块石蜡切片行Bcl-2及Bax免疫组织化学染色后，出现大量组织切片脱片，未脱片的切片仅见少量散在棕色染团，且阳性染色不在细胞质表达，为非特异性染色（图6），无法进行阳性细胞率计算。
图6
CJFH分型L3型ONFH股骨头“三柱结构”小骨块免疫组织化学染色观察示均为非特异性染色（×1 000）
a. Bax；b. Bcl-2
Figure6. The “three-column structure” of the small bone masses in the CJFH type L3 ONFH femoral head were observed by immunohistochemical staining showed non-specific staining (×1 000)a. Bax; b. Bcl-2
3 讨论
Micro-CT是一种非破坏性三维成像技术，可在不破坏样本情况下清楚显示样本内部显微结构，空间分辨率极高，可达微米级。与临床CT普遍采用的扇形X线束不同，Micro-CT通常采用锥形X线束，以提高射线利用率和空间分辨率，且在采集相同三维图像时速度远快于扇形X线束。其通过计算机软件将矢状面、冠状面、横截面进行三维重建，以便对感兴趣区域进行二维和三维分析。使用Micro-CT微米级空间分辨率以及三维重建功能下的三维骨参数分析，可对ONFH骨小梁的空间结构进行测评[14]。
既往研究发现ONFH股骨头内坏死区、硬化带、正常区中骨小梁的结构存在显著差异。Wang等[11]发现坏死区BV/TV、Tb.N较正常区显著减小、Tb.Sp显著增大，坏死区骨小梁抗应力能力下降，最终变薄、断裂，导致股骨头塌陷。而股骨颈基底部旋转截骨术治疗CJFH分型L2型及L3型ONFH的原理尚缺乏直接证据支持。本研究通过Micro-CT扫描 CJFH分型L2型及L3型ONFH 患者股骨头标本后，三维层面分割出内侧柱、中间柱、外侧柱结构，骨参数分析提示CJFH分型L2型ONFH股骨头标本外侧柱BV/TV、Tb.Th、Tb.N较内侧柱及中间柱均明显减小，BS/BV、Tb.Sp较内侧柱及中间柱均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；CJFH分型L3型ONFH股骨头外侧柱的各骨参数指标与内侧柱及中间柱比较差异均无统计学意义（P>0.05）。因此，从骨小梁空间结构变弱导致股骨头塌陷的理由出发，采用股骨颈基底部旋转截骨术治疗CJFH分型L2型ONFH可为患者提供一个骨量更多、骨小梁结构更好的外侧负重区域[13，15]；而治疗L3型ONFH患者则不能改变外侧负重区的骨小梁情况。所以股骨颈基底部旋转截骨术更适用于治疗CJFH分型L2型ONFH患者，治疗L3型ONFH患者时需谨慎，可能需要通过其他保髋手术进行外侧柱重建。
本研究中HE染色发现ONFH股骨头内骨髓大量坏死，骨小梁结构扭曲，软骨下骨骨折且软骨与软骨下骨分离；骨小梁存在大量空骨陷窝，残存骨细胞的细胞核变扁，被挤压到细胞质一端。且CJFH分型L3型的病理改变重于L2型，与CJFH分型理论较为吻合。故也验证了上述结论，即CJFH分型L3型ONFH无法通过旋转截骨构建更好的外侧柱。
另外，本研究行免疫组织化学染色时，骨组织石蜡切片出现脱片、非特异性染色的情况。除了骨组织行免疫组织化学染色难度较大之外，本研究在标本处理过程中也存在许多有损蛋白及抗原的不良因素：① 多数标本固定是在手术完成后进行，间隔数小时，此过程中可能存在骨组织溶解、蛋白物质丢失。② Micro-CT扫描需要完整股骨头标本，因此在标本固定时未能取出大小、厚度适宜的骨组织进行固定，完整的股骨头样本可能存在固定液渗透困难、固定不充分的情况。③ 由于实验安排无法一次完成骨组织Micro-CT扫描和骨组织切割，期间数次将标本放置于−80℃，可能在多次冻融过程中存在蛋白和抗原丢失。④ 摆锯切割骨组织时，高速震动产生的高温可能导致骨组织中蛋白丢失。为解决这些可能的问题，后续在标本研究过程中，可单独进行ONFH骨组织免疫组织化学的研究，及时将股骨头标本切割成小组织块，在切割过程中滴水防止摆锯温度过高，对完成切割的小骨块立刻进行固定。
综上述，本研究通过Micro-CT 微米级空间分辨率和三维重建功能下的三维骨参数分析以及HE染色和免疫组织化学染色结果分析，得出了以下结论：① CJFH分型L2型ONFH的股骨头拥有骨小梁结构更好的内侧柱和中间柱，通过股骨颈基底部旋转截骨术可重建骨小梁结构更好、骨量更大的外侧柱。而CJFH分型L3型ONFH患者，股骨头内侧柱和中间柱与外侧柱相比，骨小梁结构均遭到广泛破坏，股骨颈基底部旋转截骨术可能无法帮助其重建较原先更好的外侧柱结构。因此对于年轻的L3型患者，需谨慎选择股骨颈基底部旋转截骨术进行保髋干预。② CJFH分型L2及L3型ONFH股骨头标本中，“三柱结构”空骨陷窝率均在85%以上。尽管CJFH分型L2型ONFH的内侧柱及中间柱骨小梁破坏较外侧柱小，但三柱之间空骨陷窝率比较差异无统计学意义，提示终末期ONFH“三柱结构”中骨小梁破坏虽有差异，但共同的病理过程与骨细胞凋亡有关[16-17]，且该过程应较骨小梁结构破坏发生更早。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准（2020NL-162-02）；患者均知情同意
作者贡献声明 高润子：研究设计、数据收集整理及统计分析、文章撰写；夏天卫、刘金柱、袁兆丰、环大维：病例收集、标本处理；沈计荣：研究指导、行政及经费支持
