引用本文： 关焕帅, 曹若木, 赵奕威, 张杰闻, 李恒, 段续东, 李沂阳, 孔宁, 田润, 王坤正, 杨佩. 褪黑素对卵巢摘除大鼠体内炎症状态及BMSCs成骨能力影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(8): 1011-1020. doi: 10.7507/1002-1892.202304001 复制
骨质疏松症是一种全身骨矿物质密度降低、骨微结构破坏和骨脆性增加的疾病[1]，已成为全球最严重的公共卫生问题之一，给绝经后妇女和老人带来严重危害[2]。据调查，截至2016年中国已有1.4亿人患有骨质疏松症[3]，专家推测至2050年，中国的骨质疏松症或骨密度降低患者数将达到2.12亿[4]。目前临床应用的抗骨质疏松症药物如双磷酸盐等存在副作用大、价格高、患者依从性差等缺点[5]。因此，探索新的针对骨质疏松症的治疗手段具有重要意义。
骨稳态失衡是导致骨质疏松症发生的重要原因，而骨形成和骨吸收共同决定着骨稳态。骨形成和骨吸收之间的不平衡与各种疾病有关，其中炎症会导致过度骨吸收以及骨形成受损[6-7]。促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可促进破骨细胞生成，增强破骨细胞功能，引起骨吸收增加[8]；此外，它们还可以抑制成骨细胞生成，导致骨形成减少[9]。骨质疏松症的发生可能与炎症有关，有研究者发现雌激素水平降低和衰老促进体内低度炎症并与骨量减少相关[10-13]，且许多炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在骨质疏松症发病过程中增加[7，14]。Wang等[15]发现衰老骨细胞产生的炎症可介导与年龄相关的骨质流失。Cline-Smith等[10]则通过观察卵巢摘除（ovariectomy，OVX）小鼠，发现雌激素缺失可诱导树突状细胞产生高水平的IL-17和IL-15，激活由记忆T细胞介导的慢性低度炎症，进而在破骨形成和骨质流失中发挥作用。一项横断面研究显示，全身免疫炎症指数与绝经后妇女的骨密度降低和骨质疏松症有关，而与绝经前妇女无关[16]。此外，Damani等[7]通过对12个月随机对照试验受试者的基线数据进行横断面二次分析，发现炎症标志物与绝经后妇女的骨密度、几何形状和强度等成负相关，表明炎症标志物可能是绝经后骨质流失的重要介质。因此，改善骨质疏松症患者体内的低度炎症状态，可能为骨质疏松症的治疗提供新思路。
褪黑素（melatonin，MT）是一种主要由松果体分泌的激素，几乎存在于哺乳动物体内的所有部位[17]。其已被证实能发挥多种生理作用，例如昼夜节律、调节睡眠、抑制炎症、抗氧化应激等。许多研究表明，MT参与骨量的调节，可以减轻绝经后骨质疏松症的骨丢失[18]。Ren等[19]发现MT可以通过PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路修复铁过载大鼠的骨质疏松性骨缺陷；而Da等[20]发现MT通过增强成骨细胞的柠檬酸盐分泌，对绝经后的骨质流失起保护作用。此外，MT还被证实可以上调BMSCs的成骨作用[21-22]，增强骨形成。然而，MT能否降低骨质疏松症的低度炎症和挽救炎症状态下的成骨分化尚不明确。脂多糖是革兰阴性菌的外膜成分，可以激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信号通路并诱导促炎细胞因子表达，已在诱导炎症等方面得到广泛应用[23]。既往相关研究表明，脂多糖可以抑制MSCs的成骨分化[24]，因此我们选择脂多糖刺激BMSCs产生炎症反应。本研究旨在探究口服MT对OVX大鼠骨量和体内炎症的影响，并进一步探究MT能否减弱脂多糖诱导的炎症环境对BMSCs成骨分化的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
清洁级SD雌性大鼠18只（15只为12周龄，体质量290～310 g，平均302.0 g；3只为3周龄，体质量45、51、53 g），由西安交通大学医学院实验动物中心提供，分笼饲养，每笼5只，室内温度22～24°C，相对湿度50%～60%，自然昼夜照明，光照时间12 h，自由饮水，标准实验室啮齿动物饲料喂食。
MT（MCE公司，美国）；脂多糖（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基、FBS、青/链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO公司，美国）；PBS（武汉塞维尔生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Donjindo公司，日本）；抗CD90、CD105、CD34、CD45流式抗体（BioLegend公司，美国）；ALP、茜素红染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol试剂（TaKaRa公司，日本）；PCR逆转录试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）；SYBR Green qPCR试剂（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。
微量移液器（Eppendorf公司，德国）；25 cm2培养瓶、6孔板、96孔板（浙江硕华生命科学研究股份有限公司）；酶标仪（Omega公司，德国）；倒置显微镜（Nikon公司，日本）；PCR、实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Y.Cheetah Micro-CT系统（Yxlon公司，德国）；VG Studio Max 3.0软件（Volume Graphics公司，德国）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 MT对OVX大鼠骨量及血清炎症因子的影响
1.2.1 动物模型制备及分组方法
取15只12周龄SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为3组，假手术组、OVX组、OVX+MT组，每组5只。假手术组大鼠仅接受双侧侧腹部切开缝合，OVX组行双侧OVX，OVX+MT组在双侧OVX术后进行100 mg/（kg·d）MT口服干预。干预8周后用戊巴比妥过量麻醉处死大鼠，取血液和股骨样本备用。
1.2.2 Micro-CT检测
取大鼠股骨样本以4%多聚甲醛固定3 d后，使用Micro-CT系统对股骨远端微结构进行扫描，使用VG Studio Max 3.0软件行三维重建，并定量检测骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）来评价骨量及骨微结构情况。
1.2.3 ELISA检测
将大鼠血液样本以300×g离心15 min，小心吸取上清并置于新的EP管中；使用ELISA检测试剂盒检测血清中的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。
1.3 MT对脂多糖刺激引起BMSCs炎症及成骨能力改变的影响
1.3.1 BMSCs的分离及培养
将3只3周龄SD大鼠用过量戊巴比妥麻醉处死后置于75%乙醇中浸泡，分离股骨后用PBS冲洗。剪开股骨两端，用适量DMEM培养基将骨髓冲至离心管中，反复多次，150×g离心5 min后用完全培养基（含10%FBS和1%青/链霉素溶液的DMEM培养基）重悬，在37°C、5%CO2孵箱中培养，每3天换液1次，细胞达80%～90%融合时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，按照1∶（2～3）比例传代。取对数生长期的第3代细胞，采用流式细胞仪检测表面标志物CD90、CD105、CD34、CD45表达。取第3～5代细胞用于后续实验。
1.3.2 MT最佳药物浓度测定
实验分为5组，分别为空白对照组及1、10、100、1 000 µmol/L MT干预组。用完全培养基按1×103个/孔密度将BMSCs接种于96孔板中，在37°C、5%CO2孵箱中培养过夜，贴壁后进行相应干预。于干预0、24、48、72 h时将培养液吸出，加入90 µL DMEM培养液和10 µL CCK-8试剂，孵育约4 h后使用酶标仪测定450 nm处吸光度（A）值。根据A值判断细胞增殖与活力，A值越高细胞越多、活力越好，选择不影响细胞活性的最大浓度为MT最佳药物浓度。
1.3.3 细胞实验分组及ELISA检测
将BMSCs以1×106个/孔或5×105个/孔密度接种于6孔板或12孔板中，培养至60%～70%融合。首先将细胞分为4组，分别为A组 ［成骨诱导培养基（含0.1 µmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL抗坏血酸的完全培养基）培养］、B组（成骨诱导培养基+1 μg/mL脂多糖培养）、C组（成骨诱导培养基+5 μg/mL脂多糖培养）、D组（成骨诱导培养基+10 μg/mL脂多糖培养）。每2～3天换液1次，收集各组培养48 h的培养液，同1.2.3方法用ELISA法检测细胞培养液中炎症因子表达水平。根据CCK-8法和ELISA检测结果，用刺激炎症效果最显著浓度的脂多糖以及最佳药物浓度的MT加成骨诱导培养基对细胞进行干预，并设为E组，同样采用ELISA法检测各炎症因子表达水平。取A、D、E组细胞进行后续检测。
1.3.4 ALP染色
培养7 d后吸去培养液，PBS清洗2次后加入4%多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗2次后加入ALP染液，室温下避光染色约60 min；吸去染色液后用PBS洗涤并拍照，之后使用Image J软件分析阳性面积百分比。
1.3.5 茜素红染色
培养14 d后吸去培养液，PBS清洗2次后使用4%多聚甲醛固定30 min；用双蒸水冲洗后加入茜素红染色液染色，室温下染色约30 min后，再次用双蒸水冲洗2次后拍照，之后使用Image J软件分析阳性面积百分比。
1.3.6 RT-qPCR检测
培养7 d后吸去培养液，使用TRIzol法提取细胞中的总RNA，再按照说明书将RNA逆转录为cDNA。之后按照以下条件进行RT-qPCR：95℃、3 min；95℃、5 s，60℃、32 s，42个循环。以GAPDH为内参，采用2–ΔΔCt法计算目的基因Ⅰ型胶原α1链（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，Col1a1）、RUNX家族转录因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）mRNA相对表达量。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MT对OVX大鼠骨量及血清炎症因子的影响
2.1.1 MT对OVX大鼠骨量的影响
Micro-CT检测示，OVX组大鼠骨量较假手术组减少，骨小梁明显稀疏，排列紊乱；而OVX+MT组大鼠骨量较OVX组有所增加，骨小梁稀疏程度得到改善，排列更加规则有序。见图1a～c。定量检测示，假手术组和OVX+MT组BV/TV、Tb.N均显著高于OVX组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和OVX+MT组间差异亦有统计学意义（P<0.05）。3组间Tb.Th比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1d～f。
图1
大鼠股骨远端Micro-CT检测
a～c. 分别为大鼠股骨远端重建图、水平面图、冠状面图 从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+MT组；d～f. 各组骨相关参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N比较 *
a-c. Reconstruction figures, transverse position figures, and coronal position figures of distal femurs in rats From left to right for Sham group, OVX group, and OVX+MT group, respectively; d-f. Comparison of BV/TV, Tb.Th, and Tb.N in each group *
2.1.2 MT对OVX大鼠体内炎症的影响
ELISA检测示，OVX组大鼠体内炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著高于假手术组和OVX+MT组，差异有统计学意义（P<0.05）；OVX+MT组IL-6、TNF-α表达水平高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05），两组间IL-1β表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2
ELISA检测各组大鼠血清炎症因子表达水平
*
*
2.2 MT对脂多糖刺激引起BMSCs炎症及成骨能力改变的影响
2.2.1 BMSCs形态学观察、鉴定及MT对BMSCs活力的影响
倒置显微镜观察示原代细胞呈长梭形。流式分析结果示，细胞CD90和CD105为阳性表达，CD34和CD45为阴性表达，符合MSCs的表达特性。CCK-8法检测示，随时间延长各组A值均逐渐增加，0、24、48 h时各组间A值比较差异均无统计学意义（P>0.05）； 72 h时1 000 µmol/L MT干预组细胞活力明显低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，为了不影响细胞活力，选择100 µmol/L MT进行后续实验。见图3。
图3
BMSCs形态学观察、流式鉴定及CCK-8检测
a. 原代BMSCs形态学观察（倒置显微镜×40）；b～e. BMSCs的流式分析鉴定；f. CCK-8法检测各组细胞活力 *
a. The morphology of primary BMSCs (Inverted microscope×40); b-e. Flow cytometry detection of BMSCs; f. Cell viability detected by CCK-8 assay *
2.2.2 MT对脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影响
ELISA检测示，加入脂多糖刺激后，B～D组细胞培养液中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平明显升高，与A组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；并且呈浓度依赖性，D组各炎症因子表达水平明显高于B、C组，差异有统计学意义（P<0.05）；因此选择10 μg/mL作为脂多糖刺激炎症最显著浓度进行后续检测。E组加入MT干预后，各炎症因子表达水平较D组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4 a。
图4
MT对脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影响
*
*
ALP染色、茜素红染色及RT-qPCR检测示，与A组比较，D组ALP和茜素红阳性面积百分比以及Col1a1、Runx2 mRNA相对表达量均显著降低，经MT干预后E组上述指标均显著提升，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b～d。
3 讨论
绝经后骨质疏松症的特征是雌激素减少、骨量降低和骨微结构破坏，其发生与骨形成和骨吸收失衡密不可分。MT作为松果体产生的一种激素，可在多种疾病中发挥抗炎和抗氧化作用[18]。越来越多证据表明MT对骨骼健康起有益作用[18-19，25]。研究者发现血浆MT水平降低与骨量减少之间存在关联[26]。Cao等[27]发现绝经后骨质疏松症女性的血清MT水平有明显降低，OVX大鼠中也可观察到血清MT浓度降低，绝经后骨质疏松症发展的骨代谢标志物也与血清MT的变化显著相关[18]；此外，在松果体摘除的羊中可观察到骨量减少和骨微结构破坏[28]；这些结果均提示绝经后骨质疏松症与MT相关。MT可以通过调节PRMT1介导的信号传导来抑制OVX小鼠的破骨细胞生成和骨质流失[29]，也可以通过肝细胞生长因子/Wnt/β-连锁蛋白信号通路促进BMSCs的成骨分化[21]。此外，MT可以通过MT受体2/NF-κB信号通路抑制破骨细胞生成[22]。这些结果显示MT可能是一种新的绝经后骨质疏松症治疗手段。
绝经后骨质疏松症的发生可能与炎症有关。炎症在许多疾病中发挥重要作用，绝经后雌激素水平降低，炎症因子在体内积累，导致骨形成受损和骨量减少[30-31]。炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α刺激破骨细胞的分化、激活和存活，增强其活性，导致骨吸收增加[32]。研究表明，绝经后骨质疏松症女性血清中高表达IL-1β、IL-6和TNF-α[33-34]；去OVX大鼠血清中炎症因子水平也显著升高[35-36]；提示炎症反应可能参与了绝经后骨质疏松症的发生与发展，炎症标志物可能是绝经后骨质流失的重要介质。而MT具有抗炎特性及维持骨量的功能，其可能通过抑制体内的低度炎症状态来挽救绝经后骨质疏松症患者的骨量，但这需要进一步验证。本研究中，Micro-CT扫描显示OVX大鼠的骨量明显减少，提示骨质疏松症模型建立成功；ELISA检测示OVX大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著升高，提示其体内存在炎症。经MT治疗后OVX大鼠体内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著降低，提示MT可能通过降低体内炎症对绝经后骨质疏松症的骨量产生影响，与既往研究结果类似[21-22]。炎症因子可以通过激活NF-κB信号通路来介导骨生理学，增加骨质疏松症和骨脆性骨折风险[14]；TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和MAPK信号通路，增强RANKL和巨噬细胞集落刺激因子的产生并下调骨保护素的表达，导致骨重塑缺陷[6]。OVX后大鼠海马体中的TLR4和活性NF-κB水平显著增加，进而引起神经炎症[37]；而TLR4/NF-κB信号通路已被证明在其他疾病中可以介导MT发挥抗炎特性[38]，因此也可能介导MT抑制绝经后骨质疏松症引起的低度炎症，但仍需进一步研究明确。
BMSCs具有自我更新和多向分化的潜能，是维持骨稳态的重要造骨细胞[39]。在炎症环境下，BMSCs表现出促炎表型，产生促炎因子[40]。炎症可抑制BMSCs成骨分化，炎症相关NF-κB信号通路的持续表达可以减少BMSCs的迁移和成骨分化，而炎症因子则诱导BMSCs凋亡和抑制BMSCs成骨分化[40]。脂多糖已被证明可以在BMSCs[41]和MC3T3-E1细胞[42]中诱导炎症并引起成骨分化的抑制作用。本研究发现脂多糖浓度依赖性地诱导BMSCs培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，其中10 μg/mL脂多糖能显著增加培养液中炎症因子的产生，诱导炎症环境。而MT干预能显著降低细胞培养液中炎症因子水平，抑制脂多糖诱导的炎症。Col1a1和Runx2是常用的成骨分化标志物，其表达水平在一定程度上能反映成骨能力；而ALP和骨矿化水平则是直接反映成骨能力的指标[43]。在本研究中，脂多糖诱导的炎症环境下BMSCs的ALP水平和矿化能力明显下降，Col1a1和Runx2的水平也明显下降，表明脂多糖诱导的炎症环境明显抑制了BMSCs的成骨。MT通过Wnt/β-catenin通路促进BMSCs成骨分化，通过PPARγ通路抑制BMSCs成脂分化[44-45]；通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤并促进成骨[46]。TLR4是细菌内毒素的信号受体，脂多糖可以激活TLR4，进而导致NF-κB激活，从而调节各种炎症介质表达，最终引起组织破坏[47]。本研究发现，MT干预能增加脂多糖诱导下BMSCs的成骨能力，表明其可以减弱脂多糖对BMSCs的成骨抑制从而挽救其成骨能力，且这种作用可能通过TLR4/NF-κB信号通路实现。
综上述，本研究发现OVX大鼠体内存在炎症，MT治疗可能通过抑制OVX大鼠体内的炎症减少骨丢失，挽救骨量。脂多糖刺激能引起BMSCs细胞培养液中炎症因子增多，抑制成骨分化；MT干预能减少炎症因子产生，挽救BMSCs的成骨能力。但具体作用机制有待进一步研究明确。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
伦理声明 研究方案经西安交通大学医学部医学生物科研伦理委员会批准（2021-1566）；实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2020-005
作者贡献声明 关焕帅：论文撰写、数据采集及资料收集；曹若木、赵奕威、张杰闻：数据收集及论文修改；李恒、段续东、李沂阳：数据收集及分析；孔宁、田润：论文指导；王坤正、杨佩：课题设计及经费支持
骨质疏松症是一种全身骨矿物质密度降低、骨微结构破坏和骨脆性增加的疾病[1]，已成为全球最严重的公共卫生问题之一，给绝经后妇女和老人带来严重危害[2]。据调查，截至2016年中国已有1.4亿人患有骨质疏松症[3]，专家推测至2050年，中国的骨质疏松症或骨密度降低患者数将达到2.12亿[4]。目前临床应用的抗骨质疏松症药物如双磷酸盐等存在副作用大、价格高、患者依从性差等缺点[5]。因此，探索新的针对骨质疏松症的治疗手段具有重要意义。
骨稳态失衡是导致骨质疏松症发生的重要原因，而骨形成和骨吸收共同决定着骨稳态。骨形成和骨吸收之间的不平衡与各种疾病有关，其中炎症会导致过度骨吸收以及骨形成受损[6-7]。促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可促进破骨细胞生成，增强破骨细胞功能，引起骨吸收增加[8]；此外，它们还可以抑制成骨细胞生成，导致骨形成减少[9]。骨质疏松症的发生可能与炎症有关，有研究者发现雌激素水平降低和衰老促进体内低度炎症并与骨量减少相关[10-13]，且许多炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在骨质疏松症发病过程中增加[7，14]。Wang等[15]发现衰老骨细胞产生的炎症可介导与年龄相关的骨质流失。Cline-Smith等[10]则通过观察卵巢摘除（ovariectomy，OVX）小鼠，发现雌激素缺失可诱导树突状细胞产生高水平的IL-17和IL-15，激活由记忆T细胞介导的慢性低度炎症，进而在破骨形成和骨质流失中发挥作用。一项横断面研究显示，全身免疫炎症指数与绝经后妇女的骨密度降低和骨质疏松症有关，而与绝经前妇女无关[16]。此外，Damani等[7]通过对12个月随机对照试验受试者的基线数据进行横断面二次分析，发现炎症标志物与绝经后妇女的骨密度、几何形状和强度等成负相关，表明炎症标志物可能是绝经后骨质流失的重要介质。因此，改善骨质疏松症患者体内的低度炎症状态，可能为骨质疏松症的治疗提供新思路。
褪黑素（melatonin，MT）是一种主要由松果体分泌的激素，几乎存在于哺乳动物体内的所有部位[17]。其已被证实能发挥多种生理作用，例如昼夜节律、调节睡眠、抑制炎症、抗氧化应激等。许多研究表明，MT参与骨量的调节，可以减轻绝经后骨质疏松症的骨丢失[18]。Ren等[19]发现MT可以通过PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路修复铁过载大鼠的骨质疏松性骨缺陷；而Da等[20]发现MT通过增强成骨细胞的柠檬酸盐分泌，对绝经后的骨质流失起保护作用。此外，MT还被证实可以上调BMSCs的成骨作用[21-22]，增强骨形成。然而，MT能否降低骨质疏松症的低度炎症和挽救炎症状态下的成骨分化尚不明确。脂多糖是革兰阴性菌的外膜成分，可以激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信号通路并诱导促炎细胞因子表达，已在诱导炎症等方面得到广泛应用[23]。既往相关研究表明，脂多糖可以抑制MSCs的成骨分化[24]，因此我们选择脂多糖刺激BMSCs产生炎症反应。本研究旨在探究口服MT对OVX大鼠骨量和体内炎症的影响，并进一步探究MT能否减弱脂多糖诱导的炎症环境对BMSCs成骨分化的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
清洁级SD雌性大鼠18只（15只为12周龄，体质量290～310 g，平均302.0 g；3只为3周龄，体质量45、51、53 g），由西安交通大学医学院实验动物中心提供，分笼饲养，每笼5只，室内温度22～24°C，相对湿度50%～60%，自然昼夜照明，光照时间12 h，自由饮水，标准实验室啮齿动物饲料喂食。
MT（MCE公司，美国）；脂多糖（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基、FBS、青/链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO公司，美国）；PBS（武汉塞维尔生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Donjindo公司，日本）；抗CD90、CD105、CD34、CD45流式抗体（BioLegend公司，美国）；ALP、茜素红染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol试剂（TaKaRa公司，日本）；PCR逆转录试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）；SYBR Green qPCR试剂（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。
微量移液器（Eppendorf公司，德国）；25 cm2培养瓶、6孔板、96孔板（浙江硕华生命科学研究股份有限公司）；酶标仪（Omega公司，德国）；倒置显微镜（Nikon公司，日本）；PCR、实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Y.Cheetah Micro-CT系统（Yxlon公司，德国）；VG Studio Max 3.0软件（Volume Graphics公司，德国）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 MT对OVX大鼠骨量及血清炎症因子的影响
1.2.1 动物模型制备及分组方法
取15只12周龄SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为3组，假手术组、OVX组、OVX+MT组，每组5只。假手术组大鼠仅接受双侧侧腹部切开缝合，OVX组行双侧OVX，OVX+MT组在双侧OVX术后进行100 mg/（kg·d）MT口服干预。干预8周后用戊巴比妥过量麻醉处死大鼠，取血液和股骨样本备用。
1.2.2 Micro-CT检测
取大鼠股骨样本以4%多聚甲醛固定3 d后，使用Micro-CT系统对股骨远端微结构进行扫描，使用VG Studio Max 3.0软件行三维重建，并定量检测骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）来评价骨量及骨微结构情况。
1.2.3 ELISA检测
将大鼠血液样本以300×g离心15 min，小心吸取上清并置于新的EP管中；使用ELISA检测试剂盒检测血清中的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。
1.3 MT对脂多糖刺激引起BMSCs炎症及成骨能力改变的影响
1.3.1 BMSCs的分离及培养
将3只3周龄SD大鼠用过量戊巴比妥麻醉处死后置于75%乙醇中浸泡，分离股骨后用PBS冲洗。剪开股骨两端，用适量DMEM培养基将骨髓冲至离心管中，反复多次，150×g离心5 min后用完全培养基（含10%FBS和1%青/链霉素溶液的DMEM培养基）重悬，在37°C、5%CO2孵箱中培养，每3天换液1次，细胞达80%～90%融合时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，按照1∶（2～3）比例传代。取对数生长期的第3代细胞，采用流式细胞仪检测表面标志物CD90、CD105、CD34、CD45表达。取第3～5代细胞用于后续实验。
1.3.2 MT最佳药物浓度测定
实验分为5组，分别为空白对照组及1、10、100、1 000 µmol/L MT干预组。用完全培养基按1×103个/孔密度将BMSCs接种于96孔板中，在37°C、5%CO2孵箱中培养过夜，贴壁后进行相应干预。于干预0、24、48、72 h时将培养液吸出，加入90 µL DMEM培养液和10 µL CCK-8试剂，孵育约4 h后使用酶标仪测定450 nm处吸光度（A）值。根据A值判断细胞增殖与活力，A值越高细胞越多、活力越好，选择不影响细胞活性的最大浓度为MT最佳药物浓度。
1.3.3 细胞实验分组及ELISA检测
将BMSCs以1×106个/孔或5×105个/孔密度接种于6孔板或12孔板中，培养至60%～70%融合。首先将细胞分为4组，分别为A组 ［成骨诱导培养基（含0.1 µmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL抗坏血酸的完全培养基）培养］、B组（成骨诱导培养基+1 μg/mL脂多糖培养）、C组（成骨诱导培养基+5 μg/mL脂多糖培养）、D组（成骨诱导培养基+10 μg/mL脂多糖培养）。每2～3天换液1次，收集各组培养48 h的培养液，同1.2.3方法用ELISA法检测细胞培养液中炎症因子表达水平。根据CCK-8法和ELISA检测结果，用刺激炎症效果最显著浓度的脂多糖以及最佳药物浓度的MT加成骨诱导培养基对细胞进行干预，并设为E组，同样采用ELISA法检测各炎症因子表达水平。取A、D、E组细胞进行后续检测。
1.3.4 ALP染色
培养7 d后吸去培养液，PBS清洗2次后加入4%多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗2次后加入ALP染液，室温下避光染色约60 min；吸去染色液后用PBS洗涤并拍照，之后使用Image J软件分析阳性面积百分比。
1.3.5 茜素红染色
培养14 d后吸去培养液，PBS清洗2次后使用4%多聚甲醛固定30 min；用双蒸水冲洗后加入茜素红染色液染色，室温下染色约30 min后，再次用双蒸水冲洗2次后拍照，之后使用Image J软件分析阳性面积百分比。
1.3.6 RT-qPCR检测
培养7 d后吸去培养液，使用TRIzol法提取细胞中的总RNA，再按照说明书将RNA逆转录为cDNA。之后按照以下条件进行RT-qPCR：95℃、3 min；95℃、5 s，60℃、32 s，42个循环。以GAPDH为内参，采用2–ΔΔCt法计算目的基因Ⅰ型胶原α1链（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，Col1a1）、RUNX家族转录因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）mRNA相对表达量。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MT对OVX大鼠骨量及血清炎症因子的影响
2.1.1 MT对OVX大鼠骨量的影响
Micro-CT检测示，OVX组大鼠骨量较假手术组减少，骨小梁明显稀疏，排列紊乱；而OVX+MT组大鼠骨量较OVX组有所增加，骨小梁稀疏程度得到改善，排列更加规则有序。见图1a～c。定量检测示，假手术组和OVX+MT组BV/TV、Tb.N均显著高于OVX组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组和OVX+MT组间差异亦有统计学意义（P<0.05）。3组间Tb.Th比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1d～f。
图1
大鼠股骨远端Micro-CT检测
a～c. 分别为大鼠股骨远端重建图、水平面图、冠状面图 从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+MT组；d～f. 各组骨相关参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N比较 *
a-c. Reconstruction figures, transverse position figures, and coronal position figures of distal femurs in rats From left to right for Sham group, OVX group, and OVX+MT group, respectively; d-f. Comparison of BV/TV, Tb.Th, and Tb.N in each group *
2.1.2 MT对OVX大鼠体内炎症的影响
ELISA检测示，OVX组大鼠体内炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著高于假手术组和OVX+MT组，差异有统计学意义（P<0.05）；OVX+MT组IL-6、TNF-α表达水平高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05），两组间IL-1β表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2
ELISA检测各组大鼠血清炎症因子表达水平
*
*
2.2 MT对脂多糖刺激引起BMSCs炎症及成骨能力改变的影响
2.2.1 BMSCs形态学观察、鉴定及MT对BMSCs活力的影响
倒置显微镜观察示原代细胞呈长梭形。流式分析结果示，细胞CD90和CD105为阳性表达，CD34和CD45为阴性表达，符合MSCs的表达特性。CCK-8法检测示，随时间延长各组A值均逐渐增加，0、24、48 h时各组间A值比较差异均无统计学意义（P>0.05）； 72 h时1 000 µmol/L MT干预组细胞活力明显低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，为了不影响细胞活力，选择100 µmol/L MT进行后续实验。见图3。
图3
BMSCs形态学观察、流式鉴定及CCK-8检测
a. 原代BMSCs形态学观察（倒置显微镜×40）；b～e. BMSCs的流式分析鉴定；f. CCK-8法检测各组细胞活力 *
a. The morphology of primary BMSCs (Inverted microscope×40); b-e. Flow cytometry detection of BMSCs; f. Cell viability detected by CCK-8 assay *
2.2.2 MT对脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影响
ELISA检测示，加入脂多糖刺激后，B～D组细胞培养液中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平明显升高，与A组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；并且呈浓度依赖性，D组各炎症因子表达水平明显高于B、C组，差异有统计学意义（P<0.05）；因此选择10 μg/mL作为脂多糖刺激炎症最显著浓度进行后续检测。E组加入MT干预后，各炎症因子表达水平较D组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4 a。
图4
MT对脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影响
*
*
ALP染色、茜素红染色及RT-qPCR检测示，与A组比较，D组ALP和茜素红阳性面积百分比以及Col1a1、Runx2 mRNA相对表达量均显著降低，经MT干预后E组上述指标均显著提升，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b～d。
3 讨论
绝经后骨质疏松症的特征是雌激素减少、骨量降低和骨微结构破坏，其发生与骨形成和骨吸收失衡密不可分。MT作为松果体产生的一种激素，可在多种疾病中发挥抗炎和抗氧化作用[18]。越来越多证据表明MT对骨骼健康起有益作用[18-19，25]。研究者发现血浆MT水平降低与骨量减少之间存在关联[26]。Cao等[27]发现绝经后骨质疏松症女性的血清MT水平有明显降低，OVX大鼠中也可观察到血清MT浓度降低，绝经后骨质疏松症发展的骨代谢标志物也与血清MT的变化显著相关[18]；此外，在松果体摘除的羊中可观察到骨量减少和骨微结构破坏[28]；这些结果均提示绝经后骨质疏松症与MT相关。MT可以通过调节PRMT1介导的信号传导来抑制OVX小鼠的破骨细胞生成和骨质流失[29]，也可以通过肝细胞生长因子/Wnt/β-连锁蛋白信号通路促进BMSCs的成骨分化[21]。此外，MT可以通过MT受体2/NF-κB信号通路抑制破骨细胞生成[22]。这些结果显示MT可能是一种新的绝经后骨质疏松症治疗手段。
绝经后骨质疏松症的发生可能与炎症有关。炎症在许多疾病中发挥重要作用，绝经后雌激素水平降低，炎症因子在体内积累，导致骨形成受损和骨量减少[30-31]。炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α刺激破骨细胞的分化、激活和存活，增强其活性，导致骨吸收增加[32]。研究表明，绝经后骨质疏松症女性血清中高表达IL-1β、IL-6和TNF-α[33-34]；去OVX大鼠血清中炎症因子水平也显著升高[35-36]；提示炎症反应可能参与了绝经后骨质疏松症的发生与发展，炎症标志物可能是绝经后骨质流失的重要介质。而MT具有抗炎特性及维持骨量的功能，其可能通过抑制体内的低度炎症状态来挽救绝经后骨质疏松症患者的骨量，但这需要进一步验证。本研究中，Micro-CT扫描显示OVX大鼠的骨量明显减少，提示骨质疏松症模型建立成功；ELISA检测示OVX大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著升高，提示其体内存在炎症。经MT治疗后OVX大鼠体内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著降低，提示MT可能通过降低体内炎症对绝经后骨质疏松症的骨量产生影响，与既往研究结果类似[21-22]。炎症因子可以通过激活NF-κB信号通路来介导骨生理学，增加骨质疏松症和骨脆性骨折风险[14]；TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和MAPK信号通路，增强RANKL和巨噬细胞集落刺激因子的产生并下调骨保护素的表达，导致骨重塑缺陷[6]。OVX后大鼠海马体中的TLR4和活性NF-κB水平显著增加，进而引起神经炎症[37]；而TLR4/NF-κB信号通路已被证明在其他疾病中可以介导MT发挥抗炎特性[38]，因此也可能介导MT抑制绝经后骨质疏松症引起的低度炎症，但仍需进一步研究明确。
BMSCs具有自我更新和多向分化的潜能，是维持骨稳态的重要造骨细胞[39]。在炎症环境下，BMSCs表现出促炎表型，产生促炎因子[40]。炎症可抑制BMSCs成骨分化，炎症相关NF-κB信号通路的持续表达可以减少BMSCs的迁移和成骨分化，而炎症因子则诱导BMSCs凋亡和抑制BMSCs成骨分化[40]。脂多糖已被证明可以在BMSCs[41]和MC3T3-E1细胞[42]中诱导炎症并引起成骨分化的抑制作用。本研究发现脂多糖浓度依赖性地诱导BMSCs培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，其中10 μg/mL脂多糖能显著增加培养液中炎症因子的产生，诱导炎症环境。而MT干预能显著降低细胞培养液中炎症因子水平，抑制脂多糖诱导的炎症。Col1a1和Runx2是常用的成骨分化标志物，其表达水平在一定程度上能反映成骨能力；而ALP和骨矿化水平则是直接反映成骨能力的指标[43]。在本研究中，脂多糖诱导的炎症环境下BMSCs的ALP水平和矿化能力明显下降，Col1a1和Runx2的水平也明显下降，表明脂多糖诱导的炎症环境明显抑制了BMSCs的成骨。MT通过Wnt/β-catenin通路促进BMSCs成骨分化，通过PPARγ通路抑制BMSCs成脂分化[44-45]；通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤并促进成骨[46]。TLR4是细菌内毒素的信号受体，脂多糖可以激活TLR4，进而导致NF-κB激活，从而调节各种炎症介质表达，最终引起组织破坏[47]。本研究发现，MT干预能增加脂多糖诱导下BMSCs的成骨能力，表明其可以减弱脂多糖对BMSCs的成骨抑制从而挽救其成骨能力，且这种作用可能通过TLR4/NF-κB信号通路实现。
综上述，本研究发现OVX大鼠体内存在炎症，MT治疗可能通过抑制OVX大鼠体内的炎症减少骨丢失，挽救骨量。脂多糖刺激能引起BMSCs细胞培养液中炎症因子增多，抑制成骨分化；MT干预能减少炎症因子产生，挽救BMSCs的成骨能力。但具体作用机制有待进一步研究明确。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
伦理声明 研究方案经西安交通大学医学部医学生物科研伦理委员会批准（2021-1566）；实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2020-005
作者贡献声明 关焕帅：论文撰写、数据采集及资料收集；曹若木、赵奕威、张杰闻：数据收集及论文修改；李恒、段续东、李沂阳：数据收集及分析；孔宁、田润：论文指导；王坤正、杨佩：课题设计及经费支持
