正畸源性牙根吸收（orthodontically induced root resorption，OIRR）是正畸牙移动（orthodontic tooth movement，OTM）产生的常见并发症，发生率高达80%[1]。OIRR分为轻度（根尖吸收长度<2 mm）、中度（根尖吸收长度>2 mm但小于原根长的1/3）和重度牙根吸收（根尖吸收长度>4 mm或大于原根长的1/3）[2]。重度牙根吸收发生概率高达14.5%，会引起牙髓炎、根尖周炎甚至牙齿松动脱落[3]，给患者带来额外的治疗费用和痛苦。因此，如何减少或修复OIRR对正畸治疗效果和延长患者牙齿保留时间至关重要。当前，OIRR的防治方法主要包括药物治疗和物理治疗。药物治疗是全身或局部应用药物如青藤碱和淫羊藿苷等[4-5]，但其安全性不确切；物理治疗包括机械振动[6]、激光[7]、超声[8]和光生物调节治疗[9]等，但其临床有效性存在争议[10]。因此，现有方法很难有效预防或修复OIRR，亟需寻找新的防治方法。
干细胞是一类具有自我更新和多系分化的原始细胞，已被广泛应用于组织修复与再生领域。干细胞不仅可分化为成骨细胞再生牙骨质，还可减少炎症因子环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，抑制破骨活动以减少牙根吸收[11]。当前，用于防治OIRR的干细胞类型包括BMSCs[11]、内脏脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）[12]和人尿源性干细胞（human urine-derived stem cells，hUSCs）[13]。然而，获取BMSCs创伤较大，且来源并不丰富；获取内脏ADSCs过程较为繁琐，接受度不高；hUSCs含量较少，培养难度较高。迄今为止，尚未检索到皮下脂肪来源ADSCs修复OIRR的文献报道。人皮下脂肪来源ADSCs（human subcutaneous ADSCs，hADSCs）临床来源于丢弃的抽吸脂肪，含量丰富、容易获取，且具有低免疫原性。因此，本研究拟建立大鼠上颌第1磨牙OTM模型，并在牙周局部注射hADSCs，探究hADSCs对OIRR的影响及可能机制，为临床应用hADSCs抑制OIRR提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
hADSCs由遵义医科大学附属医院烧伤整形外科提供，来源于临床抽脂塑形的求美者，患者均知情同意并通过伦理批准。8周龄雄性SD大鼠40只，体质量260～300 g，由遵义医科大学动物中心提供。DMEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；成脂诱导分化培养基、成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基 ［赛业（广州）生物科技有限公司］；37%磷酸酸蚀剂（3M公司，美国）；美佳印弹性体印模材料（0型/3；（山东沪鸽口腔材料股份有限公司）；正畸结扎丝（0.2 mm/0.25 mm；Heraeus Kulzer公司，德国）；镍钛拉簧（0.010 in×6 mm；上海埃蒙迪材料科技有限公司）。全自动染色机（LEICA公司，德国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（Hitachi公司，日本）；正畸测力计（长沙天天齿科器材有限公司）；体式显微镜（Leica公司，德国）。
1.2 hADSCs 的分离、培养及鉴定
参照文献 ［14］ 方法分离培养hADSCs。将临床获取的脂肪组织加入PBS中，洗涤离心去除PBS后加入等体积0.1% Ⅰ型胶原蛋白酶，37 ℃震荡消化1 h；150目网筛过滤后以800×g离心5 min；弃上清，加入含10%FBS、1%双抗的DMEM培养液，重悬细胞，以5×105个/mL浓度接种至培养皿，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。72 h后首次换液，之后每3天换液1次，待细胞生长融合至70%～80%，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代、冻存。培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并行表型鉴定和诱导分化。① 表型鉴定：取第3代细胞，采用流式细胞仪检测CD90、CD105、CD73、CD44、CD29及CD45表达。②诱导分化鉴定：取第3代细胞，分别采用成脂诱导分化培养基培养3周，行油红O染色观察成脂效果；成骨诱导培养基培养3周，行茜素红染色观察成骨效果；成软骨诱导培养基诱导培养4周，行阿利新蓝染色观察成软骨效果。
1.3 动物分组及模型制备
将适应性饲养1周后健康无异常的40只SD大鼠按照随机数字表法分为实验组和对照组，每组20只，对每只大鼠做好标记和记录初始体质量。参照文献［15］方法建立大鼠右侧上颌第1磨牙近中牙OTM模型。待大鼠麻醉（4%异氟烷诱导麻醉，固定四肢后经鼻吸入2%异氟烷维持麻醉）生效后，将大鼠以仰卧式体位固定于自制固定板上。用提前制作的大鼠上颌个别托盘通过二次印模法制取大鼠上颌印模，超硬石膏灌制模型用于测量牙移动距离。然后在大鼠上颌2颗中切牙颈部用牙科打磨机磨出2条深约0.2 mm的固位沟，37%磷酸酸蚀剂酸蚀上颌切牙，棉球擦拭，隔湿吹干，小棉棒涂布黏接剂，光固化，3M固体树脂于上颌切牙堆塑倒梯形树脂结构（颈部宽、切缘窄），堆树脂时注意勿使树脂进入固位沟，倒梯形树脂结构用于加强固位沟的固位作用。使用0.20 mm正畸结扎丝从右上颌第1磨牙和第2磨牙相邻间隙穿过后结扎于第1磨牙近中，接着在右侧上颌第1磨牙和双侧切牙之间安置正畸镍钛拉簧，正畸测力计测得力值为50 g并用0.25 mm正畸结扎丝结扎于固位沟中，将大鼠舌体牵出口外等待麻醉苏醒后放回饲养笼，至此大鼠OTM模型建立完成。
于建模前1周复苏hADSCs并进行传代培养，取第3～4代细胞采用0.25%胰酶-0.04%EDTA消化后，用PBS重悬为浓度1×107个/mL的细胞悬液。建模后1、4、8、12 d，于右侧上颌第1磨牙颊腭侧黏膜转折处，实验组单次注射25 μL细胞悬液，对照组单次注射25 μL PBS。每天详细检查大鼠的加力装置是否脱落，若有脱落立即重新安装，直至处死大鼠。为降低大鼠因啃食较硬饲料时破坏正畸加力装置导致脱落的风险，在整个建模期间对大鼠进行软食喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 OTM距离测量
两组于加力7、14 d时分别取10只大鼠，同上法麻醉后，去除其口内加力装置，并按照建模时方法制取大鼠上颌骨加力后的上颌印模，然后灌制超硬石膏模型用于测量OTM距离。具体方法：将大鼠建模前和建模后所获得的上颌石膏模型置于体式显微镜下，保持平面与观测台平行，通过Leica Application Suite V4测量软件（精度设置为0.000 1 mm）测量右上颌第1磨牙与第2磨牙腭沟之间的距离。每个样本由同一研究人员重复测量3次，取均值。
1.4.2 扫描电镜观察牙根形态及测量牙根吸收面积比
大鼠上颌取模完成后经腹腔注射过量水合氯醛处死，解剖分离上颌标本并收集其包含第1磨牙的上颌骨标本。取5只大鼠上颌骨标本剔除多余软组织，修整组织块，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，5.25%次氯酸钠溶液浸泡，去除牙根表面牙槽骨；剥离上颌第1磨牙，磨除其近中根、近中颊根和近中腭根，留下远中颊根和远中腭根；去除表面残留的牙周膜，PBS清洗，40 ℃烘箱干燥。在牙根表面喷金镀膜后扫描电镜观察，以未加力的左侧上颌第1磨牙为参照，在45倍下以相同角度采集两组右侧上颌第1磨牙远中根近中面图像并观察牙根表面形态。利用Image J软件计算右上颌第1磨牙远中根近中面吸收面积比，以根分叉为牙根上界水平，牙根吸收面积比=牙根吸收面积/牙根总面积。
1.4.3 HE染色观察牙根吸收及牙周组织改建
取剩余5只大鼠上颌骨标本，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，10%EDTA脱钙后常规脱水浸蜡包埋，5 μm厚切片，脱蜡后行HE染色。以未加力的左侧上颌第1磨牙为参照，观察分析两组大鼠右侧上颌第1磨牙远中颊根近中面（压力侧和张力侧）牙根吸收情况和牙周组织改建，并通过测定远中颊根的牙根吸收指数定量评估牙根吸收的严重程度。100倍显微镜下采集图片，采用Image J软件的面积测量工具分别在右上颌第1磨牙远中颊根的牙根边界及吸收边界描点，测量并计算牙根吸收面积和牙根总面积，按以下公式计算牙根吸收指数：远中颊根吸收面积/远中颊根总面积。每个样本选取3张切片，取3张切片计算的牙根吸收指数均值作为最终结果。
1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色计数破牙骨质细胞和破骨细胞
取未加力的左侧上颌第1磨牙以及两组大鼠右侧上颌第1磨牙组织切片，于65 ℃恒温箱中烘烤60 min，脱蜡水化，纯水孵育，行TRAP染色观察。200倍显微镜下在每张组织切片上选择压力侧牙根和牙槽骨的4个视野采集图像。由同一研究人员计数每个视野内的TRAP阳性细胞，位于吸收陷窝内或接近牙根表面的为破牙骨质细胞，位于牙根吸收侧牙槽骨表面的为破骨细胞。取4个视野细胞数的均值作为此张切片最终计数；每个样本选取3张切片进行计数，取3张切片均值作为该样本的最终计数。
1.5 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据均数±标准差表示，组间和组内比较均采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs 的分离、培养及鉴定
细胞复苏24 h后可见少量细胞贴壁，呈短梭形；3 d后倒置相差显微镜下见细胞数量增多，大多数呈梭形和多角形且以集落或散在方式存在；6～7 d后镜下见细胞融合至80%～90%左右，细胞形态为长梭形，成纤维细胞样生长，呈“旋涡状”，符合MSCs形态鉴定。
流式细胞仪检测显示细胞CD90、CD105、CD73、CD44表达呈阳性，CD29、CD45表达呈阴性。成骨诱导培养3周，茜素红染色可见红色钙盐结节；成脂诱导培养3周，油红O染色示红色串珠样圆形脂滴；成软骨诱导培养4周，阿利新蓝染色见淡蓝色酸性黏多糖。提示分离培养的细胞为hADSCs。见图1。
图1
hADSCs 的分离、培养及鉴定
a. 细胞复苏培养3 d（倒置相差显微镜×40）；b～g. 流式细胞检测（分别为CD90、CD105、CD73、CD44、CD29、CD45）；h. 成骨诱导培养3周茜素红染色（倒置相差显微镜×200）；i. 成脂诱导培养3周油红O染色（倒置相差显微镜×200）；j. 成软骨诱导培养4周阿利新蓝染色（正置相差显微镜×200）
Figure1. Isolation, culture, and identification of hADSCsa. Cell resuscitation and culture for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40); b-g. Flow cytometry detection (CD90, CD105, CD73, CD44, CD29, CD45, respectively); h. Alizarin red staining at 3 weeks after osteogenic induction(Inverted phase contrast microscope×200); i. Oil red O staining at 3 weeks after adipogenic induction (Inverted phase contrast microscope×200); j. Alcian blue staining at 4 weeks after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscope×200)
2.2 OTM距离测量
加力7、14 d两组间OTM距离比较差无统计学意义（P>0.05）；但两组加力14 d时OTM距离均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），说明OTM距离随加力时间延长而增大，造模成功。见表1。
表1
加力7、14 d实验组和对照组各指标比较（n=10，
±s）
Table1.
Comparison of each index between the experimental group and the control group after 7 and 14 days of force application (n=10, 
±s)
2.3 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）远中根近中表面牙骨质完整，未见明显陷窝。加力7 d，实验组和对照组第1磨牙远中根近中面出现不同程度吸收，两组均可见小范围、独立散在的吸收陷窝，主要位于根颈1/3，实验组吸收陷窝数较对照组少，陷窝范围较对照组小；加力14 d，实验组和对照组牙根吸收（表现为范围较广的片状吸收区域）程度均较7 d时加重，实验组吸收区域范围较对照组小，吸收部位主要集中在牙根的颈1/3和中1/3，而对照组则扩展至根尖1/3。见图2。
图2
上颌第1磨牙远中根近中面扫描电镜观察（×45）
a. 左侧未加力侧；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（箭头示吸收陷窝）；c. 对照组（左）和实验组（右）加力14 d（箭头示吸收陷窝）
Figure2. Scanning electron microscope observation of the mesial surface of the distal root of the maxillary first molar (×45)a. The left side without force application; b. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 7 days (arrow showed the absorption lacuna); c. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 14 days (arrow showed the absorption lacuna)
加力7 d实验组牙根吸收面积比较对照组小，但差异无统计学意义（P>0.05）；加力14 d实验组牙根吸收面积比显著小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。加力14 d两组牙根吸收面积比均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.4 HE染色观察
HE染色示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）牙根表面光滑，未见吸收陷窝，牙槽骨表面骨吸收陷窝少见，未见明显破骨细胞，牙周膜纤维排列规则，无透明样变区域。加力7 d，实验组和对照组压力侧牙根均出现吸收陷窝，实验组陷窝呈单个存在、吸收深度基本局限于牙骨质层，对照组呈吸收至牙本质浅层的小片状吸收陷窝，实验组牙根吸收范围和深度较对照组小。加力14 d，两组牙根吸收陷窝面积和深度较7 d时增加，融合成片状，实验组牙根吸收刚到达牙本质表层，牙周纤维排列变规则、牙周膜中的透明样变区域基本消失；对照组牙根吸收超过牙本质表层，压力侧纤维排列仍比较紊乱，还可见透明样变区域，牙槽骨吸收较实验组明显。见图3a、b。
图3
HE染色观察（×200）
AB：牙槽骨 PDL：牙周膜 TR：牙根 a. 左侧上颌第1磨牙牙周组织；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）压力侧牙根和牙周组织；c. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）张力侧牙根和牙周组织
Figure3. HE staining observation (×200)AB: Alveolar bone PDL: Periodontal ligament TR: Tooth root a. Periodontal tissue of the left maxillary first molar; b. Root and periodontal tissue of the pressure side of the control group (left) and the experimental group (right) after 7 days (upper) and 14 days (lower) of force application; c. Root and periodontal tissue of the tension side of the control group (left) and the experimental group (right) for 7 days (upper) and 14 days (lower) of force application
加力7 d实验组和对照组张力侧牙周膜均被拉伸变宽，纤维排列变疏松和轻度不规则，牙槽骨未见新生骨组织。加力14 d，实验组牙周膜较7 d时拉伸不明显、宽度减小，纤维排列变紧密和规则；对照组牙周纤维排列较实验组不规则，纤维细胞疏松排列；两组牙槽骨表面未见明显新骨形成。见图3c。
加力7 d实验组牙根吸收指数较对照组小，但差异无统计学意义（P>0.05）；加力14 d实验组牙根吸收指数显著小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。加力14 d两组牙根吸收指数均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4，表1。
图4
两组压力侧牙根吸收指数计算示意图（HE×100）
TR：牙根 黑色示牙根吸收区域，灰色示牙根未吸收区域 a. 对照组加力7 d；b. 实验组加力7 d；c. 对照组加力14 d；d. 实验组加力14 d
Figure4. Schematic diagram of calculation of root resorption index on the pressure side of the two groups (HE×100)TR: Tooth root Black area indicated the root resorption area, and gray area indicated the root non-resorption area a. The control group applied force for 7 days; b. The experimental group applied force for 7 days; c. The control group applied force for 14 days; d. The experimental group applied force for 14 days
2.5 TRAP染色观察
TRAP染色示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）远中根近中面牙根表面未见破牙骨质细胞，牙槽骨表面未见破骨细胞。实验组和对照组大鼠右侧上颌第1磨牙远中根近中面（压力侧）牙根和牙槽骨表面均出现TRAP阳性细胞。见图5。
图5
上颌第1磨牙牙根近中侧TRAP染色观察
AB：牙槽骨 PDL：牙周膜 TR：牙根 a. 左侧未加力侧（×400）；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）（×200） 蓝箭头示破牙骨质细胞，绿箭头示破骨细胞
Figure5. TRAP staining observation of the mesial side of the root of the maxillary first molarAB: Alveolar bone PDL: Periodontal ligament TR: Tooth root a. Left unforced side (×400); b. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 7 days (upper) and 14 days (lower) (×200) Blue arrow showed the cementoclasts, green arrow showed the osteoclasts
加力7 d，实验组和对照组牙根表面及吸收陷窝内均出现较多破牙骨质细胞和破骨细胞，实验组破牙骨质细胞数量显著少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；破骨细胞数量少于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。加力14 d，实验组破牙骨质细胞和破骨细胞数量均显著少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。组内比较示，加力14 d实验组破牙骨质细胞数量较7 d时显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）；破骨细胞较7 d时减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。对照组破牙骨质细胞和破骨细胞数量均较7 d时减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 讨论
近年有研究报道干细胞局部移植对OIRR有抑制或修复作用[16]。Amuk等[11]建立大鼠OTM模型，于加力期间在其牙周局部注射同种异体BMSCs，有效减少了大鼠牙根吸收陷窝数目和吸收面积比，增加了牙骨质的形成，减少了OIRR发生。随后，该团队继续在大鼠上颌扩弓模型中注射同种异体内脏脂肪来源ADSCs，结果显示大鼠磨牙牙根的吸收陷窝数目和体积同样减少，牙骨质形成增加[12]。国内周建萍[13]在建立大鼠正畸牙根吸收模型后再注射hUSCs，发现注射细胞的大鼠牙根吸收体积较未注射细胞的大鼠显著减小，认为hUSCs可促进移动性牙根吸收的修复。然而，迄今未检索到皮下脂肪来源ADSCs局部移植对OIRR吸收的研究。皮下脂肪来源ADSCs含量更丰富且取材简便，具有较强和较稳定的成骨分化潜能，是牙周改建最理想的种子细胞，更适用于OIRR的研究[17]。因此本研究选用hADSCs进行实验，这是首次应用hADSCs局部移植抑制或修复OIRR的研究。
牙根吸收面积比主要是从颊舌向分析牙根整个近中面牙根吸收面积的大小，牙根吸收指数则是从近远中向观察牙根吸收面积大小，其测定由牙根的吸收长度和深度构成。牙根吸收面积比和牙根吸收指数可反映牙根吸收的严重程度[18]。本研究建立大鼠右侧上颌第1磨牙近中OTM模型，通过扫描电镜和HE染色观察示加力14 d时，实验组牙根吸收面积比及牙根吸收指数较对照组有统计学差异。而加力7 d时，实验组大鼠牙根吸收面积比和牙根吸收指数虽然均较对照组小，但差异无统计学意义，这意味着早期hADSCs对OIRR的抑制作用并不明显。目前在干细胞与OIRR的研究[11-13]中，观察周期多为加力14 d或更多，加力7 d属于牙根吸收早期阶段，移植的hADSCs可能需要一定时间迁移或激活牙根吸收修复相关细胞，这可能是7 d时hADSCs抑制牙根吸收不明显的原因。通常认为OIRR由破牙细胞和破骨细胞共同引起的[19]。破骨细胞激活可转化为破牙细胞，破牙细胞包括破牙骨质细胞和破牙本细胞，但以破牙骨质细胞吸收牙根为主。因此破骨细胞和破牙骨质细胞的含量可用来评估牙根吸收严重程度[20]。本研究通过TRAP染色定量评估这两种细胞在牙周组织中的数量，结果显示加力14 d后实验组两种细胞数量较对照组显著减少，与牙根吸收减少情况一致。加力7 d时，破牙骨质细胞数量较对照组显著降低，但是牙根吸收却无显著减轻，这一结果可能与实验组破骨细胞数量与对照组差异无统计学意义相关，因为破骨细胞数量也会影响牙根吸收的严重程度。同时，移植的hADSCs可能需要一定时间迁移到牙根吸收处，发挥自身作用及引发内源性细胞产生修复效应，因此在加力早期未显示明显治疗作用。此外，本研究设计的加力7 d周期可能过短，下一步需要更长周期以获得较为可靠的研究结果。
OTM的速率主要取决于破骨细胞的数量、活性及骨吸收过程[21]。本研究中，加力7、14 d的OTM距离显示，与对照组相比，实验组轻度减少了OTM距离，尽管这种差异不显著，但不能排除hADSCs有减缓OTM的趋势，因为移植的hADSCs减少了大鼠磨牙压力侧破骨细胞数量。该结果与Amuk等[11]的研究结论一致，他们发现移植到大鼠牙周组织的BMSCs在减少OIRR的同时，增加了牙周组织中骨吸收抑制因子骨保护素的表达，减少了破骨细胞生成，因此猜测移植的BMSCs可能会减慢牙移动[11]。然而，Amuk等的另一项研究[12]发现，移植到大鼠牙周组织的同种异体内脏脂肪来源ADSCs在减少牙根吸收的同时增加了磨牙在扩弓期间向颊侧移动的距离，与本研究向大鼠移植异种异体hADSCs并未加速牙移动的结果不尽相同，可能与ADSCs来源、模型构建方式及OTM距离测量方式不同有关。因本研究主要是探讨hADSCs对OIRR的影响，并未检测骨吸收相关因子的表达，有必要进一步探究hADSCs对OTM速率的影响及机制。
综上述，hADSCs 局部移植可能通过减少大鼠OTM过程中破牙骨质细胞和破骨细胞的数量来减小牙根吸收面积和深度，从而抑制OIRR。本研究存在一些局限：首先，hADSCs移植前并未对其进行荧光标记，未追踪其转归情况；其次，本研究仍停留在形态学层面，未从分子生物学角度进一步阐明hADSCs的作用机制；最后，hADSCs通过具体哪些细胞因子发挥作用并不清楚。越来越多研究显示干细胞局部移植后通过旁分泌细胞因子、外囊泡或外泌体等发挥治疗作用[22]，近年也有文献报道USCs的外泌体局部移植可促进移动性牙根吸收修复，上调BMP-2、骨涎蛋白，诱导牙周细胞的增殖分化[23]。因此，我们猜测hADSCs局部移植后可能通过旁分泌各种细胞因子刺激宿主局部的修复细胞，启动修复，从而发挥抑制OIRR的作用，具体作用机制还需要进一步探究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案（获取hADSCs）经遵义医科大学附属口腔医院伦理委员会批准（YJSKTLS-2020-2023-004H），患者均知情同意。所有动物实验符合《实验动物管理条例》和《实验动物许可管理办法》的规定，且获遵义医科大学实验动物福利伦理委员会批准（ZMU21-2304-004）；实验动物使用许可证号：SYXK（黔）2021-0004
作者贡献声明 张疆弢：研究设计；张丹、杨春先：研究实施；胥鹏、唐娜娜、肖顺娥：数据收集整理及统计分析；张丹：文章撰写、经费支持；张疆弢：行政支持
正畸源性牙根吸收（orthodontically induced root resorption，OIRR）是正畸牙移动（orthodontic tooth movement，OTM）产生的常见并发症，发生率高达80%[1]。OIRR分为轻度（根尖吸收长度<2 mm）、中度（根尖吸收长度>2 mm但小于原根长的1/3）和重度牙根吸收（根尖吸收长度>4 mm或大于原根长的1/3）[2]。重度牙根吸收发生概率高达14.5%，会引起牙髓炎、根尖周炎甚至牙齿松动脱落[3]，给患者带来额外的治疗费用和痛苦。因此，如何减少或修复OIRR对正畸治疗效果和延长患者牙齿保留时间至关重要。当前，OIRR的防治方法主要包括药物治疗和物理治疗。药物治疗是全身或局部应用药物如青藤碱和淫羊藿苷等[4-5]，但其安全性不确切；物理治疗包括机械振动[6]、激光[7]、超声[8]和光生物调节治疗[9]等，但其临床有效性存在争议[10]。因此，现有方法很难有效预防或修复OIRR，亟需寻找新的防治方法。
干细胞是一类具有自我更新和多系分化的原始细胞，已被广泛应用于组织修复与再生领域。干细胞不仅可分化为成骨细胞再生牙骨质，还可减少炎症因子环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，抑制破骨活动以减少牙根吸收[11]。当前，用于防治OIRR的干细胞类型包括BMSCs[11]、内脏脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）[12]和人尿源性干细胞（human urine-derived stem cells，hUSCs）[13]。然而，获取BMSCs创伤较大，且来源并不丰富；获取内脏ADSCs过程较为繁琐，接受度不高；hUSCs含量较少，培养难度较高。迄今为止，尚未检索到皮下脂肪来源ADSCs修复OIRR的文献报道。人皮下脂肪来源ADSCs（human subcutaneous ADSCs，hADSCs）临床来源于丢弃的抽吸脂肪，含量丰富、容易获取，且具有低免疫原性。因此，本研究拟建立大鼠上颌第1磨牙OTM模型，并在牙周局部注射hADSCs，探究hADSCs对OIRR的影响及可能机制，为临床应用hADSCs抑制OIRR提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
hADSCs由遵义医科大学附属医院烧伤整形外科提供，来源于临床抽脂塑形的求美者，患者均知情同意并通过伦理批准。8周龄雄性SD大鼠40只，体质量260～300 g，由遵义医科大学动物中心提供。DMEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；成脂诱导分化培养基、成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基 ［赛业（广州）生物科技有限公司］；37%磷酸酸蚀剂（3M公司，美国）；美佳印弹性体印模材料（0型/3；（山东沪鸽口腔材料股份有限公司）；正畸结扎丝（0.2 mm/0.25 mm；Heraeus Kulzer公司，德国）；镍钛拉簧（0.010 in×6 mm；上海埃蒙迪材料科技有限公司）。全自动染色机（LEICA公司，德国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（Hitachi公司，日本）；正畸测力计（长沙天天齿科器材有限公司）；体式显微镜（Leica公司，德国）。
1.2 hADSCs 的分离、培养及鉴定
参照文献 ［14］ 方法分离培养hADSCs。将临床获取的脂肪组织加入PBS中，洗涤离心去除PBS后加入等体积0.1% Ⅰ型胶原蛋白酶，37 ℃震荡消化1 h；150目网筛过滤后以800×g离心5 min；弃上清，加入含10%FBS、1%双抗的DMEM培养液，重悬细胞，以5×105个/mL浓度接种至培养皿，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。72 h后首次换液，之后每3天换液1次，待细胞生长融合至70%～80%，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代、冻存。培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并行表型鉴定和诱导分化。① 表型鉴定：取第3代细胞，采用流式细胞仪检测CD90、CD105、CD73、CD44、CD29及CD45表达。②诱导分化鉴定：取第3代细胞，分别采用成脂诱导分化培养基培养3周，行油红O染色观察成脂效果；成骨诱导培养基培养3周，行茜素红染色观察成骨效果；成软骨诱导培养基诱导培养4周，行阿利新蓝染色观察成软骨效果。
1.3 动物分组及模型制备
将适应性饲养1周后健康无异常的40只SD大鼠按照随机数字表法分为实验组和对照组，每组20只，对每只大鼠做好标记和记录初始体质量。参照文献［15］方法建立大鼠右侧上颌第1磨牙近中牙OTM模型。待大鼠麻醉（4%异氟烷诱导麻醉，固定四肢后经鼻吸入2%异氟烷维持麻醉）生效后，将大鼠以仰卧式体位固定于自制固定板上。用提前制作的大鼠上颌个别托盘通过二次印模法制取大鼠上颌印模，超硬石膏灌制模型用于测量牙移动距离。然后在大鼠上颌2颗中切牙颈部用牙科打磨机磨出2条深约0.2 mm的固位沟，37%磷酸酸蚀剂酸蚀上颌切牙，棉球擦拭，隔湿吹干，小棉棒涂布黏接剂，光固化，3M固体树脂于上颌切牙堆塑倒梯形树脂结构（颈部宽、切缘窄），堆树脂时注意勿使树脂进入固位沟，倒梯形树脂结构用于加强固位沟的固位作用。使用0.20 mm正畸结扎丝从右上颌第1磨牙和第2磨牙相邻间隙穿过后结扎于第1磨牙近中，接着在右侧上颌第1磨牙和双侧切牙之间安置正畸镍钛拉簧，正畸测力计测得力值为50 g并用0.25 mm正畸结扎丝结扎于固位沟中，将大鼠舌体牵出口外等待麻醉苏醒后放回饲养笼，至此大鼠OTM模型建立完成。
于建模前1周复苏hADSCs并进行传代培养，取第3～4代细胞采用0.25%胰酶-0.04%EDTA消化后，用PBS重悬为浓度1×107个/mL的细胞悬液。建模后1、4、8、12 d，于右侧上颌第1磨牙颊腭侧黏膜转折处，实验组单次注射25 μL细胞悬液，对照组单次注射25 μL PBS。每天详细检查大鼠的加力装置是否脱落，若有脱落立即重新安装，直至处死大鼠。为降低大鼠因啃食较硬饲料时破坏正畸加力装置导致脱落的风险，在整个建模期间对大鼠进行软食喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 OTM距离测量
两组于加力7、14 d时分别取10只大鼠，同上法麻醉后，去除其口内加力装置，并按照建模时方法制取大鼠上颌骨加力后的上颌印模，然后灌制超硬石膏模型用于测量OTM距离。具体方法：将大鼠建模前和建模后所获得的上颌石膏模型置于体式显微镜下，保持平面与观测台平行，通过Leica Application Suite V4测量软件（精度设置为0.000 1 mm）测量右上颌第1磨牙与第2磨牙腭沟之间的距离。每个样本由同一研究人员重复测量3次，取均值。
1.4.2 扫描电镜观察牙根形态及测量牙根吸收面积比
大鼠上颌取模完成后经腹腔注射过量水合氯醛处死，解剖分离上颌标本并收集其包含第1磨牙的上颌骨标本。取5只大鼠上颌骨标本剔除多余软组织，修整组织块，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，5.25%次氯酸钠溶液浸泡，去除牙根表面牙槽骨；剥离上颌第1磨牙，磨除其近中根、近中颊根和近中腭根，留下远中颊根和远中腭根；去除表面残留的牙周膜，PBS清洗，40 ℃烘箱干燥。在牙根表面喷金镀膜后扫描电镜观察，以未加力的左侧上颌第1磨牙为参照，在45倍下以相同角度采集两组右侧上颌第1磨牙远中根近中面图像并观察牙根表面形态。利用Image J软件计算右上颌第1磨牙远中根近中面吸收面积比，以根分叉为牙根上界水平，牙根吸收面积比=牙根吸收面积/牙根总面积。
1.4.3 HE染色观察牙根吸收及牙周组织改建
取剩余5只大鼠上颌骨标本，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，10%EDTA脱钙后常规脱水浸蜡包埋，5 μm厚切片，脱蜡后行HE染色。以未加力的左侧上颌第1磨牙为参照，观察分析两组大鼠右侧上颌第1磨牙远中颊根近中面（压力侧和张力侧）牙根吸收情况和牙周组织改建，并通过测定远中颊根的牙根吸收指数定量评估牙根吸收的严重程度。100倍显微镜下采集图片，采用Image J软件的面积测量工具分别在右上颌第1磨牙远中颊根的牙根边界及吸收边界描点，测量并计算牙根吸收面积和牙根总面积，按以下公式计算牙根吸收指数：远中颊根吸收面积/远中颊根总面积。每个样本选取3张切片，取3张切片计算的牙根吸收指数均值作为最终结果。
1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色计数破牙骨质细胞和破骨细胞
取未加力的左侧上颌第1磨牙以及两组大鼠右侧上颌第1磨牙组织切片，于65 ℃恒温箱中烘烤60 min，脱蜡水化，纯水孵育，行TRAP染色观察。200倍显微镜下在每张组织切片上选择压力侧牙根和牙槽骨的4个视野采集图像。由同一研究人员计数每个视野内的TRAP阳性细胞，位于吸收陷窝内或接近牙根表面的为破牙骨质细胞，位于牙根吸收侧牙槽骨表面的为破骨细胞。取4个视野细胞数的均值作为此张切片最终计数；每个样本选取3张切片进行计数，取3张切片均值作为该样本的最终计数。
1.5 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据均数±标准差表示，组间和组内比较均采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs 的分离、培养及鉴定
细胞复苏24 h后可见少量细胞贴壁，呈短梭形；3 d后倒置相差显微镜下见细胞数量增多，大多数呈梭形和多角形且以集落或散在方式存在；6～7 d后镜下见细胞融合至80%～90%左右，细胞形态为长梭形，成纤维细胞样生长，呈“旋涡状”，符合MSCs形态鉴定。
流式细胞仪检测显示细胞CD90、CD105、CD73、CD44表达呈阳性，CD29、CD45表达呈阴性。成骨诱导培养3周，茜素红染色可见红色钙盐结节；成脂诱导培养3周，油红O染色示红色串珠样圆形脂滴；成软骨诱导培养4周，阿利新蓝染色见淡蓝色酸性黏多糖。提示分离培养的细胞为hADSCs。见图1。
图1
hADSCs 的分离、培养及鉴定
a. 细胞复苏培养3 d（倒置相差显微镜×40）；b～g. 流式细胞检测（分别为CD90、CD105、CD73、CD44、CD29、CD45）；h. 成骨诱导培养3周茜素红染色（倒置相差显微镜×200）；i. 成脂诱导培养3周油红O染色（倒置相差显微镜×200）；j. 成软骨诱导培养4周阿利新蓝染色（正置相差显微镜×200）
Figure1. Isolation, culture, and identification of hADSCsa. Cell resuscitation and culture for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40); b-g. Flow cytometry detection (CD90, CD105, CD73, CD44, CD29, CD45, respectively); h. Alizarin red staining at 3 weeks after osteogenic induction(Inverted phase contrast microscope×200); i. Oil red O staining at 3 weeks after adipogenic induction (Inverted phase contrast microscope×200); j. Alcian blue staining at 4 weeks after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscope×200)
2.2 OTM距离测量
加力7、14 d两组间OTM距离比较差无统计学意义（P>0.05）；但两组加力14 d时OTM距离均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），说明OTM距离随加力时间延长而增大，造模成功。见表1。
表1
加力7、14 d实验组和对照组各指标比较（n=10，±s）
Table1.
Comparison of each index between the experimental group and the control group after 7 and 14 days of force application (n=10, ±s)
2.3 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）远中根近中表面牙骨质完整，未见明显陷窝。加力7 d，实验组和对照组第1磨牙远中根近中面出现不同程度吸收，两组均可见小范围、独立散在的吸收陷窝，主要位于根颈1/3，实验组吸收陷窝数较对照组少，陷窝范围较对照组小；加力14 d，实验组和对照组牙根吸收（表现为范围较广的片状吸收区域）程度均较7 d时加重，实验组吸收区域范围较对照组小，吸收部位主要集中在牙根的颈1/3和中1/3，而对照组则扩展至根尖1/3。见图2。
图2
上颌第1磨牙远中根近中面扫描电镜观察（×45）
a. 左侧未加力侧；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（箭头示吸收陷窝）；c. 对照组（左）和实验组（右）加力14 d（箭头示吸收陷窝）
Figure2. Scanning electron microscope observation of the mesial surface of the distal root of the maxillary first molar (×45)a. The left side without force application; b. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 7 days (arrow showed the absorption lacuna); c. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 14 days (arrow showed the absorption lacuna)
加力7 d实验组牙根吸收面积比较对照组小，但差异无统计学意义（P>0.05）；加力14 d实验组牙根吸收面积比显著小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。加力14 d两组牙根吸收面积比均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.4 HE染色观察
HE染色示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）牙根表面光滑，未见吸收陷窝，牙槽骨表面骨吸收陷窝少见，未见明显破骨细胞，牙周膜纤维排列规则，无透明样变区域。加力7 d，实验组和对照组压力侧牙根均出现吸收陷窝，实验组陷窝呈单个存在、吸收深度基本局限于牙骨质层，对照组呈吸收至牙本质浅层的小片状吸收陷窝，实验组牙根吸收范围和深度较对照组小。加力14 d，两组牙根吸收陷窝面积和深度较7 d时增加，融合成片状，实验组牙根吸收刚到达牙本质表层，牙周纤维排列变规则、牙周膜中的透明样变区域基本消失；对照组牙根吸收超过牙本质表层，压力侧纤维排列仍比较紊乱，还可见透明样变区域，牙槽骨吸收较实验组明显。见图3a、b。
图3
HE染色观察（×200）
AB：牙槽骨 PDL：牙周膜 TR：牙根 a. 左侧上颌第1磨牙牙周组织；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）压力侧牙根和牙周组织；c. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）张力侧牙根和牙周组织
Figure3. HE staining observation (×200)AB: Alveolar bone PDL: Periodontal ligament TR: Tooth root a. Periodontal tissue of the left maxillary first molar; b. Root and periodontal tissue of the pressure side of the control group (left) and the experimental group (right) after 7 days (upper) and 14 days (lower) of force application; c. Root and periodontal tissue of the tension side of the control group (left) and the experimental group (right) for 7 days (upper) and 14 days (lower) of force application
加力7 d实验组和对照组张力侧牙周膜均被拉伸变宽，纤维排列变疏松和轻度不规则，牙槽骨未见新生骨组织。加力14 d，实验组牙周膜较7 d时拉伸不明显、宽度减小，纤维排列变紧密和规则；对照组牙周纤维排列较实验组不规则，纤维细胞疏松排列；两组牙槽骨表面未见明显新骨形成。见图3c。
加力7 d实验组牙根吸收指数较对照组小，但差异无统计学意义（P>0.05）；加力14 d实验组牙根吸收指数显著小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。加力14 d两组牙根吸收指数均较7 d时显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4，表1。
图4
两组压力侧牙根吸收指数计算示意图（HE×100）
TR：牙根 黑色示牙根吸收区域，灰色示牙根未吸收区域 a. 对照组加力7 d；b. 实验组加力7 d；c. 对照组加力14 d；d. 实验组加力14 d
Figure4. Schematic diagram of calculation of root resorption index on the pressure side of the two groups (HE×100)TR: Tooth root Black area indicated the root resorption area, and gray area indicated the root non-resorption area a. The control group applied force for 7 days; b. The experimental group applied force for 7 days; c. The control group applied force for 14 days; d. The experimental group applied force for 14 days
2.5 TRAP染色观察
TRAP染色示，大鼠左侧上颌第1磨牙（未加力侧）远中根近中面牙根表面未见破牙骨质细胞，牙槽骨表面未见破骨细胞。实验组和对照组大鼠右侧上颌第1磨牙远中根近中面（压力侧）牙根和牙槽骨表面均出现TRAP阳性细胞。见图5。
图5
上颌第1磨牙牙根近中侧TRAP染色观察
AB：牙槽骨 PDL：牙周膜 TR：牙根 a. 左侧未加力侧（×400）；b. 对照组（左）和实验组（右）加力7 d（上）和14 d（下）（×200） 蓝箭头示破牙骨质细胞，绿箭头示破骨细胞
Figure5. TRAP staining observation of the mesial side of the root of the maxillary first molarAB: Alveolar bone PDL: Periodontal ligament TR: Tooth root a. Left unforced side (×400); b. The control group (left) and the experimental group (right) applied force for 7 days (upper) and 14 days (lower) (×200) Blue arrow showed the cementoclasts, green arrow showed the osteoclasts
加力7 d，实验组和对照组牙根表面及吸收陷窝内均出现较多破牙骨质细胞和破骨细胞，实验组破牙骨质细胞数量显著少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；破骨细胞数量少于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。加力14 d，实验组破牙骨质细胞和破骨细胞数量均显著少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。组内比较示，加力14 d实验组破牙骨质细胞数量较7 d时显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）；破骨细胞较7 d时减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。对照组破牙骨质细胞和破骨细胞数量均较7 d时减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 讨论
近年有研究报道干细胞局部移植对OIRR有抑制或修复作用[16]。Amuk等[11]建立大鼠OTM模型，于加力期间在其牙周局部注射同种异体BMSCs，有效减少了大鼠牙根吸收陷窝数目和吸收面积比，增加了牙骨质的形成，减少了OIRR发生。随后，该团队继续在大鼠上颌扩弓模型中注射同种异体内脏脂肪来源ADSCs，结果显示大鼠磨牙牙根的吸收陷窝数目和体积同样减少，牙骨质形成增加[12]。国内周建萍[13]在建立大鼠正畸牙根吸收模型后再注射hUSCs，发现注射细胞的大鼠牙根吸收体积较未注射细胞的大鼠显著减小，认为hUSCs可促进移动性牙根吸收的修复。然而，迄今未检索到皮下脂肪来源ADSCs局部移植对OIRR吸收的研究。皮下脂肪来源ADSCs含量更丰富且取材简便，具有较强和较稳定的成骨分化潜能，是牙周改建最理想的种子细胞，更适用于OIRR的研究[17]。因此本研究选用hADSCs进行实验，这是首次应用hADSCs局部移植抑制或修复OIRR的研究。
牙根吸收面积比主要是从颊舌向分析牙根整个近中面牙根吸收面积的大小，牙根吸收指数则是从近远中向观察牙根吸收面积大小，其测定由牙根的吸收长度和深度构成。牙根吸收面积比和牙根吸收指数可反映牙根吸收的严重程度[18]。本研究建立大鼠右侧上颌第1磨牙近中OTM模型，通过扫描电镜和HE染色观察示加力14 d时，实验组牙根吸收面积比及牙根吸收指数较对照组有统计学差异。而加力7 d时，实验组大鼠牙根吸收面积比和牙根吸收指数虽然均较对照组小，但差异无统计学意义，这意味着早期hADSCs对OIRR的抑制作用并不明显。目前在干细胞与OIRR的研究[11-13]中，观察周期多为加力14 d或更多，加力7 d属于牙根吸收早期阶段，移植的hADSCs可能需要一定时间迁移或激活牙根吸收修复相关细胞，这可能是7 d时hADSCs抑制牙根吸收不明显的原因。通常认为OIRR由破牙细胞和破骨细胞共同引起的[19]。破骨细胞激活可转化为破牙细胞，破牙细胞包括破牙骨质细胞和破牙本细胞，但以破牙骨质细胞吸收牙根为主。因此破骨细胞和破牙骨质细胞的含量可用来评估牙根吸收严重程度[20]。本研究通过TRAP染色定量评估这两种细胞在牙周组织中的数量，结果显示加力14 d后实验组两种细胞数量较对照组显著减少，与牙根吸收减少情况一致。加力7 d时，破牙骨质细胞数量较对照组显著降低，但是牙根吸收却无显著减轻，这一结果可能与实验组破骨细胞数量与对照组差异无统计学意义相关，因为破骨细胞数量也会影响牙根吸收的严重程度。同时，移植的hADSCs可能需要一定时间迁移到牙根吸收处，发挥自身作用及引发内源性细胞产生修复效应，因此在加力早期未显示明显治疗作用。此外，本研究设计的加力7 d周期可能过短，下一步需要更长周期以获得较为可靠的研究结果。
OTM的速率主要取决于破骨细胞的数量、活性及骨吸收过程[21]。本研究中，加力7、14 d的OTM距离显示，与对照组相比，实验组轻度减少了OTM距离，尽管这种差异不显著，但不能排除hADSCs有减缓OTM的趋势，因为移植的hADSCs减少了大鼠磨牙压力侧破骨细胞数量。该结果与Amuk等[11]的研究结论一致，他们发现移植到大鼠牙周组织的BMSCs在减少OIRR的同时，增加了牙周组织中骨吸收抑制因子骨保护素的表达，减少了破骨细胞生成，因此猜测移植的BMSCs可能会减慢牙移动[11]。然而，Amuk等的另一项研究[12]发现，移植到大鼠牙周组织的同种异体内脏脂肪来源ADSCs在减少牙根吸收的同时增加了磨牙在扩弓期间向颊侧移动的距离，与本研究向大鼠移植异种异体hADSCs并未加速牙移动的结果不尽相同，可能与ADSCs来源、模型构建方式及OTM距离测量方式不同有关。因本研究主要是探讨hADSCs对OIRR的影响，并未检测骨吸收相关因子的表达，有必要进一步探究hADSCs对OTM速率的影响及机制。
综上述，hADSCs 局部移植可能通过减少大鼠OTM过程中破牙骨质细胞和破骨细胞的数量来减小牙根吸收面积和深度，从而抑制OIRR。本研究存在一些局限：首先，hADSCs移植前并未对其进行荧光标记，未追踪其转归情况；其次，本研究仍停留在形态学层面，未从分子生物学角度进一步阐明hADSCs的作用机制；最后，hADSCs通过具体哪些细胞因子发挥作用并不清楚。越来越多研究显示干细胞局部移植后通过旁分泌细胞因子、外囊泡或外泌体等发挥治疗作用[22]，近年也有文献报道USCs的外泌体局部移植可促进移动性牙根吸收修复，上调BMP-2、骨涎蛋白，诱导牙周细胞的增殖分化[23]。因此，我们猜测hADSCs局部移植后可能通过旁分泌各种细胞因子刺激宿主局部的修复细胞，启动修复，从而发挥抑制OIRR的作用，具体作用机制还需要进一步探究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案（获取hADSCs）经遵义医科大学附属口腔医院伦理委员会批准（YJSKTLS-2020-2023-004H），患者均知情同意。所有动物实验符合《实验动物管理条例》和《实验动物许可管理办法》的规定，且获遵义医科大学实验动物福利伦理委员会批准（ZMU21-2304-004）；实验动物使用许可证号：SYXK（黔）2021-0004
作者贡献声明 张疆弢：研究设计；张丹、杨春先：研究实施；胥鹏、唐娜娜、肖顺娥：数据收集整理及统计分析；张丹：文章撰写、经费支持；张疆弢：行政支持
