引用本文： 田文晗, 何观平, 刘玉增, 管娟. 适配骨组织工程的蚕丝增强聚己内酯复合材料理化及生物特征研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(9): 1123-1129. doi: 10.7507/1002-1892.202404120 复制
骨肿瘤、骨修复、脊柱融合以及创伤性骨折等原因，每年导致数百万患者需进行骨移植和修复手术。在临床手术尤其是脊柱融合手术中，所使用的材料仍然存在一些问题，如高模量引起的应力屏蔽和骨质疏松，以及不可降解引发的长期慢性炎症和异物反应等[1]。理想的骨移植替代材料应具备以下基本特性：① 与骨主体或松质骨相近的模量，以避免应力屏蔽；② 与皮质骨相近的压缩强度，以实现结构承载功能；③ 降解速率与组织生长速率相匹配[2-3]。尽管已有大量研究结合多种物理化学手段构建了不同的可降解人工骨材料[4-5]，但因为材料特性如模量和强度与降解速率之间存在制约关系，同时具备上述特性的理想材料仍然稀缺。
自然界利用多材料复合和多层级结构设计策略，将胶原蛋白、壳聚糖与磷酸钙、碳酸钙等单相本体力学性能较弱的材料，构筑成坚韧耐用的骨骼和贝壳等高性能天然复合材料[6-7]。然而，人们通过结构仿生来重现天然模型体中近乎完美的多层级结构（特别是在微纳尺度上），进而获得具有相似性能和功能的人造材料仍面临挑战。
仅由蛋白质组成的蚕丝是唯一一种具有宏观连续性和高度有序性的多尺度结构天然动物纤维。蚕丝作为重要的生物医用材料具备良好的生物相容性、可降解性和出色的综合力学性能[8-9]。在化学纤维发明之前，天然蚕丝享有“纺织皇后”的美誉；近几百年，蚕丝也被用作临床缝合线等医学领域[10-11]。近三十年，研究人员开发了大量新型蚕丝基生物材料，主要集中在再生丝蛋白及其衍生材料[12-13]。但是，再生丝蛋白的提取过程破坏了天然蚕丝的多级有序结构，只保留了其蛋白质的氨基酸序列结构[14]，未能继承天然蚕丝的优异力学性能。最新研究表明[15]，天然蚕丝与再生丝蛋白复合，可以形成力学性能优越的可降解骨科植入材料，体现了蚕丝对复合材料基体的强韧化效果。但是，再生丝蛋白的加工性能不佳，导致复合界面性能不足，在体内应用时出现了界面破坏、分层的现象。因此，在设计蚕丝增强复合材料时，应当在满足骨组织工程力学和生物学需求的同时，选择具有优异加工性能的高分子基体材料。
本研究选取具有优异加工性能的聚己内酯（polycaprolactone，PCL）作为基体，与天然蚕丝纤维织物复合，模仿天然骨组织中微米尺度上骨小梁增强骨基质的结构，设计了一种骨组织工程用蚕丝增强PCL复合材料（silk reinforced PCL composite，SPC），通过层层组装和热压技术，制备了不同蚕丝含量的SPC。本研究在材料表征的基础上，通过体外和体内生物学实验评价SPC的生物相容性和降解特性，为其进一步动物实验及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10周龄SPF级雄性SD大鼠6只，体质量250～300 g，由成都药康生物科技有限公司提供。
PCL（上海麦克林生化科技股份有限公司）；脱胶平纹丝绸织物 ［瑞蚨祥（北京）投资管理有限公司］；小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）［赛百慷（上海）生物技术股份有限公司］；DMEM 培养基（Corning公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）。JSM-
1.2 SPC的制备
1.2.1 蚕丝-PCL预浸料制备
先将脱胶平纹丝绸织物在去离子水中进行超声波清洗30 min，再于高温灭菌室中灭菌处理2 h；然后将PCL颗粒制成薄膜，与已灭菌的单层脱胶平纹丝绸织物在500 kPa和120℃条件下热压10 min，并自然冷却至室温，得到单层蚕丝-PCL复合材料，称为蚕丝-PCL预浸料。
1.2.2 不同蚕丝含量的SPC制备
首先，在模具表面均匀喷洒脱模剂，等待30 min后继续喷洒，重复3次。接着，将蚕丝-PCL预浸料按预设层数层层组装于模具中，蚕丝的纤维体积分数分别为20%、40%和60%。在500 kPa和120℃条件下热压20 min，再自然冷却至环境温度并进行脱模，得到的材料分别标记为20%-SPC、40%-SPC和60%-SPC，通过机械切割制成不同尺寸的待测试样。
1.3 SPC的表征
1.3.1 大体形态及微观结构
观察蚕丝-PCL预浸料及SPC的大体形态。取3种SPC样本，真空干燥48 h后，表面喷金，扫描电镜观察材料内部微观结构。
1.3.2 力学性能检测
在Instron 8801力学试验机上测试3种SPC样本的压缩性能，包括压缩模量和压缩强度（最大压缩应力）。压缩试样长12 mm、宽5 mm、厚5 mm，应变速率为2 mm/s，使用横梁位移，压缩弹性模量取0.5%和3.0%应变之间的线性拟合斜率。每个样本重复3～5个试样。
1.3.3 体外降解测试
取3种SPC样本置于37℃模拟体液（PBS缓冲液）中，于3、30、90、180 d分别取出试样（n=4），同1.3.2方法测试压缩强度（离开模拟体液5 min内完成测试）。180 d后取出样本，用去离子水充分冲洗后干燥，称重并记录降解后质量。
1.3.4 表面润湿性检测
在OCA-20接触角测量仪上，使用去离子水在25℃条件下对3种SPC样本表面进行静态水接触角测量，以单纯PCL材料作为对照，记录5次取均值。
1.3.5 细胞增殖实验
取PCL、20%-SPC、40%-SPC样本经紫外线灭菌处理后，在材料表面按1×104个/孔浓度添加20 μL MC3T3-E1细胞悬浮液，转移至96孔板；温育2 h后，细胞稳定并黏附于材料；随后按1×104个/100 μL浓度加入MC3T3-E1细胞悬浮液继续培养，每隔1 d更换1次培养基。于培养1、3、5 d后，取浸提液10 μL加入CCK-8试剂盒，孵育2 h后使用酶标仪测定各组在450 nm波长下的吸光度（A）值。
1.3.6 大鼠皮下植入实验
将SPC切割成2 mm3大小立方体，PCL为直径2 mm的球形颗粒，均经60Co辐照灭菌备用。取6只SD大鼠背部消毒后，用手术刀切开表皮，将PCL和20%-SPC两种试样左右对称植入每只大鼠背部皮下，缝合表皮。植入后30 d和180 d分别实施安乐死处死3只大鼠，于背部植入区域取材，行组织切片及Masson染色。基于染色图像中胶原纤维的分布确定材料与组织界面，定量分析30 d和180 d材料体内降解率；以单位面积内皮细胞成环数量作为新生组织中血管数量。
1.4 统计学方法
采用SPSS27.0统计软件进行分析。计量资料经Sharpiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SPC的大体形态和微观结构
单层蚕丝-PCL预浸料厚度约0.2 mm。预浸料叠层组装热压后制得的SPC块体为硬质坚韧材料，厚度可达几厘米；通过机械切削加工，这些块体材料可以制成形状不规则、尺寸较大的植入材料。见图1。
图1
SPC材料大体观察
a. 蚕丝-PCL预浸料；b. SPC块体
Figure1. Macroscopic images of SPC materialsa. Silk-PCL prepreg; b. SPC bulk specimen
扫描电镜观察示，3种SPC断面的孔隙缺陷均较少。随着蚕丝含量从20%增至60%，PCL含量越来越少，蚕丝织物层间距变小，纱线排布越来越密集，纤维几乎布满整个断面；60%-SPC中出现了纱线中心浸渍不良的现象。见图2。
图2
SPC扫描电镜观察
a. 20%-SPC；b. 40%-SPC；c. 60%-SPC
Figure2. Scanning electron microscope observation of SPCa. 20%-SPC; b. 40%-SPC; c. 60%-SPC
2.2 SPC的力学性能
随着蚕丝含量从20%增至60%，SPC的压缩强度显著增加，但压缩模量增加较少，60%-SPC的压缩模量较40%-SPC下降。各材料压缩强度和压缩模量两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
SPC的压缩力学性能
*
*
2.3 SPC的体外降解分析
3种SPC在模拟体液中降解180 d的质量损失均在5%以内，60%-SPC的质量损失最大，显著高于另外两组。各材料间质量损失比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4a。
图4
SPC的体外降解性能
a. 降解180 d的质量损失 *
a. The mass loss after 180 days of degradation *
降解力学测试示，3 d后3种SPC由干态转变为湿态，其压缩强度较干态时显著下降；但在随后180 d中，各时间点3种SPC的压缩强度下降均较少。除3 d时40%-SPC和60%-SPC压缩强度差异无统计学意义（P>0.05）外，其余时间点各材料间压缩强度差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b。
2.4 SPC的表面润湿性
单纯PCL表面呈现疏水性，静态水接触角较大；随着蚕丝含量增加至60%，静态水接触角显著减小，水滴在SPC表面几乎完全铺展。除40%-SPC和60%-SPC间静态水接触角差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
SPC的表面润湿性检测
a. 平衡水滴形态；b. 静态水接触角 *
a. Equilibrium water droplet morphology; b. Static water contact angles *
2.5 SPC的成骨细胞相容性
随培养时间延长，各材料组A值均逐渐增加。1 d时20%-SPC组A值低于PCL组和40%-SPC组，差异有统计学意义（P<0.05）；3、5 d时，20%-SPC组和40%-SPC组A值均高于PCL组，40%-SPC组高于20%-SPC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图6。
图6
CCK-8检测各材料细胞增殖
Figure6.
Cell proliferation of materials detected by CCK-8 assay
2.6 SPC的体内降解特征
大鼠皮下植入30 d，两组均无明显血管生成，PCL组材料无降解迹象，而在材料周围形成了薄层纤维囊；20%-SPC组材料与周围组织界面开始变得模糊，初步出现材料降解、组织向内生长迹象。180 d，PCL组材料仍未见明显降解，纤维囊增厚，且周围缺乏血管组织；20%-SPC组材料降解十分显著，原位新生组织逐渐替代了最初的PCL，剩余未降解的大量蚕丝被新生组织包裹，与组织融合良好，并促进生成了大量血管，部分血管已进入材料内部。定量分析示，20%-SPC组植入30 d和180 d后体内降解率分别为5.33%±3.33%和61.11%±20.12%。20%-SPC组180 d的血管数量显著高于PCL组，差异有统计学意义（t=10.300，P<0.001）。见图7。
图7
大鼠皮下植入材料Masson染色观察
a. PCL植入后30 d；b. PCL植入后180 d；c. 20%-SPC植入后30 d；d. 20%-SPC植入后180 d；e. 20%-SPC植入后180 d观察血管生成情况，白框示内皮细胞构成的环形血管；f. 为图e白框局部放大；g. 基于图像分析的20%-SPC植入后180 d体内降解情况，金色区域为新生组织/被替代的材料；h. PCL和20%-SPC植入后不同时间点血管数量比较
Figure7. Masson staining observation of subcutaneous implanted materials in ratsa. PCL at 30 days after implantation; b. PCL at 180 days after implantation; c. 20%-SPC at 30 days after implantation; d. 20%-SPC at 180 days after implantation; e. Vascularization in 20%-SPC at 180 days after implantation, white boxes denoted circular blood vessels constituted by endothelial cells; f. Enlarged view of fig.e; g. The degradation
3 讨论
用于骨修复的可降解骨植入物不仅需具备良好的生物相容性和体内可降解性，还需具备高强度以提供力学稳定性，同时需要适配松质骨的较低模量以避免应力屏蔽[16-17]。然而，目前的可降解材料在强度达到或超过皮质骨（约150 MPa）水平时[18]，往往模量过高[17，19]；而当模量与皮质骨相近或更低时，强度则显著过低[20]。经过数亿年进化形成的强韧骨骼，由胶原蛋白和磷酸钙矿物两种物质复合而成，具有多层级有序结构[18，21]。本研究选择了可降解高分子PCL与蚕丝纤维复合，模仿天然骨骼的异质组成，同时通过复合材料制备工艺，获得了模量较低、强度较高的新型可降解复合材料，具有骨组织工程应用潜力。
SPC微观形貌显示蚕丝与PCL界面结合良好，孔隙等缺陷较少。一方面，PCL熔体在高温下黏度较低，容易流动；另一方面，热压工艺提供的压力使其能够向蚕丝织物内部和丝束中心充分渗透。蚕丝体积分数对复合材料的力学性能具有直接影响[22]。叠层组装和热压工艺能够将体积分数高达60%的蚕丝引入SPC。当蚕丝的体积分数从20%增加至40%时，压缩模量和压缩强度均显著提高。然而，当蚕丝的体积分数进一步增加至60%时，SPC的压缩模量开始下降。这可能是因为PCL含量过低，难以渗入蚕丝纱线内部，且无法形成有效的连续基体相，导致材料力学性能下降。
生物材料的亲水性增加更利于细胞黏附和增殖。由于蚕丝可吸收其质量20%～30%的水分[23]，因此蚕丝纤维的加入显著提高了SPC材料的亲水性，降低了材料表面静态水接触角。细胞增殖实验也表明，更加亲水的20%-SPC和40%-SPC的细胞增殖显著高于PCL，且蚕丝含量越高，细胞黏附和生长越容易。
综合体外实验结果，SPC具备骨组织力学适配性、亲水性、成骨前体细胞相容性等关键特性。在骨植入物应用方面，植入材料初始时需具有高强度，同时需要在组织完全愈合/承重前，即6个月内保持力学稳定性。本研究长达180 d的SPC体外降解实验表明，SPC中PCL的水解反应缓慢，质量损失微小。但SPC的压缩强度却能够维持在湿态90%以上的水平。
在大鼠皮下植入实验中，SPC表现出比体内更快的降解速率，180 d时外层PCL逐渐降解，新生组织逐渐替代材料并包裹剩余蚕丝纤维。这一现象再次印证了蚕丝纤维及其丝蛋白材料具有优异的体内相容性[24-25]。体内生物因素复杂，蚕丝作为亲水、与细胞亲和的材料，改变了SPC中PCL的降解模式，从被动水解转变为细胞主导的机体主动降解/吸收，呈现出完全不同的降解行为[5，26]。Masson染色分析进一步表明，SPC周围存在大量血管，体现明显的促血管化作用，加速了组织的生长和修复。
综上述，通过热压和层层组装制备的SPC成功继承了天然蚕丝纤维的力学特性，实现了适配骨组织的模量和强度的平衡，在模拟体液中的力学性能长期稳定，可用于骨组织工程，特别是承重骨植入物。SPC的体内降解模式受宿主免疫系统控制，表现出更快的降解速率。同时，SPC具有一定的促血管化效应，能够加速组织修复。但是，在体内降解过程中，机体如何调控巨噬细胞等免疫细胞对SPC进行降解，PCL降解如何影响组织再生微环境，仍然需要进一步探究。本研究将为研发新型骨修复材料提供启示，并为蚕丝复合材料的动物实验功能性验证和临床试验奠定基础。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经首都医科大学附属北京朝阳医院动物福利与伦理工作委员会批准（2021-动-42）；实验动物生产许可证批准号：SCXK（川）2020-034，使用许可证批准号：SYXK（渝）2019-0002
作者贡献声明 田文晗：参与研究设计，材料实验，数据收集、整理、分析，撰写文章；何观平：参与研究设计，动物实验，收集实验原始数据、分析；刘玉增：指导研究设计，文章修改；管娟：指导研究设计、统筹实验进度及文章修改
骨肿瘤、骨修复、脊柱融合以及创伤性骨折等原因，每年导致数百万患者需进行骨移植和修复手术。在临床手术尤其是脊柱融合手术中，所使用的材料仍然存在一些问题，如高模量引起的应力屏蔽和骨质疏松，以及不可降解引发的长期慢性炎症和异物反应等[1]。理想的骨移植替代材料应具备以下基本特性：① 与骨主体或松质骨相近的模量，以避免应力屏蔽；② 与皮质骨相近的压缩强度，以实现结构承载功能；③ 降解速率与组织生长速率相匹配[2-3]。尽管已有大量研究结合多种物理化学手段构建了不同的可降解人工骨材料[4-5]，但因为材料特性如模量和强度与降解速率之间存在制约关系，同时具备上述特性的理想材料仍然稀缺。
自然界利用多材料复合和多层级结构设计策略，将胶原蛋白、壳聚糖与磷酸钙、碳酸钙等单相本体力学性能较弱的材料，构筑成坚韧耐用的骨骼和贝壳等高性能天然复合材料[6-7]。然而，人们通过结构仿生来重现天然模型体中近乎完美的多层级结构（特别是在微纳尺度上），进而获得具有相似性能和功能的人造材料仍面临挑战。
仅由蛋白质组成的蚕丝是唯一一种具有宏观连续性和高度有序性的多尺度结构天然动物纤维。蚕丝作为重要的生物医用材料具备良好的生物相容性、可降解性和出色的综合力学性能[8-9]。在化学纤维发明之前，天然蚕丝享有“纺织皇后”的美誉；近几百年，蚕丝也被用作临床缝合线等医学领域[10-11]。近三十年，研究人员开发了大量新型蚕丝基生物材料，主要集中在再生丝蛋白及其衍生材料[12-13]。但是，再生丝蛋白的提取过程破坏了天然蚕丝的多级有序结构，只保留了其蛋白质的氨基酸序列结构[14]，未能继承天然蚕丝的优异力学性能。最新研究表明[15]，天然蚕丝与再生丝蛋白复合，可以形成力学性能优越的可降解骨科植入材料，体现了蚕丝对复合材料基体的强韧化效果。但是，再生丝蛋白的加工性能不佳，导致复合界面性能不足，在体内应用时出现了界面破坏、分层的现象。因此，在设计蚕丝增强复合材料时，应当在满足骨组织工程力学和生物学需求的同时，选择具有优异加工性能的高分子基体材料。
本研究选取具有优异加工性能的聚己内酯（polycaprolactone，PCL）作为基体，与天然蚕丝纤维织物复合，模仿天然骨组织中微米尺度上骨小梁增强骨基质的结构，设计了一种骨组织工程用蚕丝增强PCL复合材料（silk reinforced PCL composite，SPC），通过层层组装和热压技术，制备了不同蚕丝含量的SPC。本研究在材料表征的基础上，通过体外和体内生物学实验评价SPC的生物相容性和降解特性，为其进一步动物实验及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10周龄SPF级雄性SD大鼠6只，体质量250～300 g，由成都药康生物科技有限公司提供。
PCL（上海麦克林生化科技股份有限公司）；脱胶平纹丝绸织物 ［瑞蚨祥（北京）投资管理有限公司］；小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）［赛百慷（上海）生物技术股份有限公司］；DMEM 培养基（Corning公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）。JSM-
1.2 SPC的制备
1.2.1 蚕丝-PCL预浸料制备
先将脱胶平纹丝绸织物在去离子水中进行超声波清洗30 min，再于高温灭菌室中灭菌处理2 h；然后将PCL颗粒制成薄膜，与已灭菌的单层脱胶平纹丝绸织物在500 kPa和120℃条件下热压10 min，并自然冷却至室温，得到单层蚕丝-PCL复合材料，称为蚕丝-PCL预浸料。
1.2.2 不同蚕丝含量的SPC制备
首先，在模具表面均匀喷洒脱模剂，等待30 min后继续喷洒，重复3次。接着，将蚕丝-PCL预浸料按预设层数层层组装于模具中，蚕丝的纤维体积分数分别为20%、40%和60%。在500 kPa和120℃条件下热压20 min，再自然冷却至环境温度并进行脱模，得到的材料分别标记为20%-SPC、40%-SPC和60%-SPC，通过机械切割制成不同尺寸的待测试样。
1.3 SPC的表征
1.3.1 大体形态及微观结构
观察蚕丝-PCL预浸料及SPC的大体形态。取3种SPC样本，真空干燥48 h后，表面喷金，扫描电镜观察材料内部微观结构。
1.3.2 力学性能检测
在Instron 8801力学试验机上测试3种SPC样本的压缩性能，包括压缩模量和压缩强度（最大压缩应力）。压缩试样长12 mm、宽5 mm、厚5 mm，应变速率为2 mm/s，使用横梁位移，压缩弹性模量取0.5%和3.0%应变之间的线性拟合斜率。每个样本重复3～5个试样。
1.3.3 体外降解测试
取3种SPC样本置于37℃模拟体液（PBS缓冲液）中，于3、30、90、180 d分别取出试样（n=4），同1.3.2方法测试压缩强度（离开模拟体液5 min内完成测试）。180 d后取出样本，用去离子水充分冲洗后干燥，称重并记录降解后质量。
1.3.4 表面润湿性检测
在OCA-20接触角测量仪上，使用去离子水在25℃条件下对3种SPC样本表面进行静态水接触角测量，以单纯PCL材料作为对照，记录5次取均值。
1.3.5 细胞增殖实验
取PCL、20%-SPC、40%-SPC样本经紫外线灭菌处理后，在材料表面按1×104个/孔浓度添加20 μL MC3T3-E1细胞悬浮液，转移至96孔板；温育2 h后，细胞稳定并黏附于材料；随后按1×104个/100 μL浓度加入MC3T3-E1细胞悬浮液继续培养，每隔1 d更换1次培养基。于培养1、3、5 d后，取浸提液10 μL加入CCK-8试剂盒，孵育2 h后使用酶标仪测定各组在450 nm波长下的吸光度（A）值。
1.3.6 大鼠皮下植入实验
将SPC切割成2 mm3大小立方体，PCL为直径2 mm的球形颗粒，均经60Co辐照灭菌备用。取6只SD大鼠背部消毒后，用手术刀切开表皮，将PCL和20%-SPC两种试样左右对称植入每只大鼠背部皮下，缝合表皮。植入后30 d和180 d分别实施安乐死处死3只大鼠，于背部植入区域取材，行组织切片及Masson染色。基于染色图像中胶原纤维的分布确定材料与组织界面，定量分析30 d和180 d材料体内降解率；以单位面积内皮细胞成环数量作为新生组织中血管数量。
1.4 统计学方法
采用SPSS27.0统计软件进行分析。计量资料经Sharpiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SPC的大体形态和微观结构
单层蚕丝-PCL预浸料厚度约0.2 mm。预浸料叠层组装热压后制得的SPC块体为硬质坚韧材料，厚度可达几厘米；通过机械切削加工，这些块体材料可以制成形状不规则、尺寸较大的植入材料。见图1。
图1
SPC材料大体观察
a. 蚕丝-PCL预浸料；b. SPC块体
Figure1. Macroscopic images of SPC materialsa. Silk-PCL prepreg; b. SPC bulk specimen
扫描电镜观察示，3种SPC断面的孔隙缺陷均较少。随着蚕丝含量从20%增至60%，PCL含量越来越少，蚕丝织物层间距变小，纱线排布越来越密集，纤维几乎布满整个断面；60%-SPC中出现了纱线中心浸渍不良的现象。见图2。
图2
SPC扫描电镜观察
a. 20%-SPC；b. 40%-SPC；c. 60%-SPC
Figure2. Scanning electron microscope observation of SPCa. 20%-SPC; b. 40%-SPC; c. 60%-SPC
2.2 SPC的力学性能
随着蚕丝含量从20%增至60%，SPC的压缩强度显著增加，但压缩模量增加较少，60%-SPC的压缩模量较40%-SPC下降。各材料压缩强度和压缩模量两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
SPC的压缩力学性能
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2.3 SPC的体外降解分析
3种SPC在模拟体液中降解180 d的质量损失均在5%以内，60%-SPC的质量损失最大，显著高于另外两组。各材料间质量损失比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4a。
图4
SPC的体外降解性能
a. 降解180 d的质量损失 *
a. The mass loss after 180 days of degradation *
降解力学测试示，3 d后3种SPC由干态转变为湿态，其压缩强度较干态时显著下降；但在随后180 d中，各时间点3种SPC的压缩强度下降均较少。除3 d时40%-SPC和60%-SPC压缩强度差异无统计学意义（P>0.05）外，其余时间点各材料间压缩强度差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b。
2.4 SPC的表面润湿性
单纯PCL表面呈现疏水性，静态水接触角较大；随着蚕丝含量增加至60%，静态水接触角显著减小，水滴在SPC表面几乎完全铺展。除40%-SPC和60%-SPC间静态水接触角差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
SPC的表面润湿性检测
a. 平衡水滴形态；b. 静态水接触角 *
a. Equilibrium water droplet morphology; b. Static water contact angles *
2.5 SPC的成骨细胞相容性
随培养时间延长，各材料组A值均逐渐增加。1 d时20%-SPC组A值低于PCL组和40%-SPC组，差异有统计学意义（P<0.05）；3、5 d时，20%-SPC组和40%-SPC组A值均高于PCL组，40%-SPC组高于20%-SPC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图6。
图6
CCK-8检测各材料细胞增殖
Figure6.
Cell proliferation of materials detected by CCK-8 assay
2.6 SPC的体内降解特征
大鼠皮下植入30 d，两组均无明显血管生成，PCL组材料无降解迹象，而在材料周围形成了薄层纤维囊；20%-SPC组材料与周围组织界面开始变得模糊，初步出现材料降解、组织向内生长迹象。180 d，PCL组材料仍未见明显降解，纤维囊增厚，且周围缺乏血管组织；20%-SPC组材料降解十分显著，原位新生组织逐渐替代了最初的PCL，剩余未降解的大量蚕丝被新生组织包裹，与组织融合良好，并促进生成了大量血管，部分血管已进入材料内部。定量分析示，20%-SPC组植入30 d和180 d后体内降解率分别为5.33%±3.33%和61.11%±20.12%。20%-SPC组180 d的血管数量显著高于PCL组，差异有统计学意义（t=10.300，P<0.001）。见图7。
图7
大鼠皮下植入材料Masson染色观察
a. PCL植入后30 d；b. PCL植入后180 d；c. 20%-SPC植入后30 d；d. 20%-SPC植入后180 d；e. 20%-SPC植入后180 d观察血管生成情况，白框示内皮细胞构成的环形血管；f. 为图e白框局部放大；g. 基于图像分析的20%-SPC植入后180 d体内降解情况，金色区域为新生组织/被替代的材料；h. PCL和20%-SPC植入后不同时间点血管数量比较
Figure7. Masson staining observation of subcutaneous implanted materials in ratsa. PCL at 30 days after implantation; b. PCL at 180 days after implantation; c. 20%-SPC at 30 days after implantation; d. 20%-SPC at 180 days after implantation; e. Vascularization in 20%-SPC at 180 days after implantation, white boxes denoted circular blood vessels constituted by endothelial cells; f. Enlarged view of fig.e; g. The degradation
3 讨论
用于骨修复的可降解骨植入物不仅需具备良好的生物相容性和体内可降解性，还需具备高强度以提供力学稳定性，同时需要适配松质骨的较低模量以避免应力屏蔽[16-17]。然而，目前的可降解材料在强度达到或超过皮质骨（约150 MPa）水平时[18]，往往模量过高[17，19]；而当模量与皮质骨相近或更低时，强度则显著过低[20]。经过数亿年进化形成的强韧骨骼，由胶原蛋白和磷酸钙矿物两种物质复合而成，具有多层级有序结构[18，21]。本研究选择了可降解高分子PCL与蚕丝纤维复合，模仿天然骨骼的异质组成，同时通过复合材料制备工艺，获得了模量较低、强度较高的新型可降解复合材料，具有骨组织工程应用潜力。
SPC微观形貌显示蚕丝与PCL界面结合良好，孔隙等缺陷较少。一方面，PCL熔体在高温下黏度较低，容易流动；另一方面，热压工艺提供的压力使其能够向蚕丝织物内部和丝束中心充分渗透。蚕丝体积分数对复合材料的力学性能具有直接影响[22]。叠层组装和热压工艺能够将体积分数高达60%的蚕丝引入SPC。当蚕丝的体积分数从20%增加至40%时，压缩模量和压缩强度均显著提高。然而，当蚕丝的体积分数进一步增加至60%时，SPC的压缩模量开始下降。这可能是因为PCL含量过低，难以渗入蚕丝纱线内部，且无法形成有效的连续基体相，导致材料力学性能下降。
生物材料的亲水性增加更利于细胞黏附和增殖。由于蚕丝可吸收其质量20%～30%的水分[23]，因此蚕丝纤维的加入显著提高了SPC材料的亲水性，降低了材料表面静态水接触角。细胞增殖实验也表明，更加亲水的20%-SPC和40%-SPC的细胞增殖显著高于PCL，且蚕丝含量越高，细胞黏附和生长越容易。
综合体外实验结果，SPC具备骨组织力学适配性、亲水性、成骨前体细胞相容性等关键特性。在骨植入物应用方面，植入材料初始时需具有高强度，同时需要在组织完全愈合/承重前，即6个月内保持力学稳定性。本研究长达180 d的SPC体外降解实验表明，SPC中PCL的水解反应缓慢，质量损失微小。但SPC的压缩强度却能够维持在湿态90%以上的水平。
在大鼠皮下植入实验中，SPC表现出比体内更快的降解速率，180 d时外层PCL逐渐降解，新生组织逐渐替代材料并包裹剩余蚕丝纤维。这一现象再次印证了蚕丝纤维及其丝蛋白材料具有优异的体内相容性[24-25]。体内生物因素复杂，蚕丝作为亲水、与细胞亲和的材料，改变了SPC中PCL的降解模式，从被动水解转变为细胞主导的机体主动降解/吸收，呈现出完全不同的降解行为[5，26]。Masson染色分析进一步表明，SPC周围存在大量血管，体现明显的促血管化作用，加速了组织的生长和修复。
综上述，通过热压和层层组装制备的SPC成功继承了天然蚕丝纤维的力学特性，实现了适配骨组织的模量和强度的平衡，在模拟体液中的力学性能长期稳定，可用于骨组织工程，特别是承重骨植入物。SPC的体内降解模式受宿主免疫系统控制，表现出更快的降解速率。同时，SPC具有一定的促血管化效应，能够加速组织修复。但是，在体内降解过程中，机体如何调控巨噬细胞等免疫细胞对SPC进行降解，PCL降解如何影响组织再生微环境，仍然需要进一步探究。本研究将为研发新型骨修复材料提供启示，并为蚕丝复合材料的动物实验功能性验证和临床试验奠定基础。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经首都医科大学附属北京朝阳医院动物福利与伦理工作委员会批准（2021-动-42）；实验动物生产许可证批准号：SCXK（川）2020-034，使用许可证批准号：SYXK（渝）2019-0002
作者贡献声明 田文晗：参与研究设计，材料实验，数据收集、整理、分析，撰写文章；何观平：参与研究设计，动物实验，收集实验原始数据、分析；刘玉增：指导研究设计，文章修改；管娟：指导研究设计、统筹实验进度及文章修改
