引用本文： 郑希, 袁勇, 胡杨, 赵雍凡. 淋巴化疗对食管癌患者术后免疫功能的影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(2): 233-237. doi: 10.7507/1007-4848.20140067 复制
淋巴管转移是食管癌的主要转移途径，也是影响食管癌远期疗效的主要原因[1]。目前对食管癌淋巴转移的处理方法主要分为术前放化疗、手术淋巴结清扫和术后放化疗。淋巴化疗是利用淋巴系统具有吞噬大分子物质和微粒的特性，将化疗药与载体共价结合、物理包裹或吸附，改变药物的药代动力学，保持化疗药物活性，构成淋巴靶向给药系统的新型化疗方案。该方法具有以下优点：①靶向给药，局部高药物浓度，化疗相关不良反应少；②淋巴靶向给药系统缓释化疗药，使区域淋巴结内较长时间维持抗癌药物高浓度，从而有效杀伤淋巴系统内的肿瘤细胞；③调整局部淋巴结内的免疫活性，恢复淋巴细胞功能[1-3]。由于传统化疗方案中淋巴系统药物浓度较低，近年来淋巴化疗在乳腺癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤围手术期运用广泛，其中以纳米炭吸附化疗药的形式最为常见[4-9]。
人体的特异性免疫系统由体液免疫、细胞免疫两部分组成，前者功能可由免疫球蛋白浓度体现，后者功能由T细胞亚群绝对计数体现。既往较多研究指出食管癌患者存在体液免疫、细胞免疫功能紊乱，多表现为免疫球蛋白、CD3+/CD4+T细胞下降，而CD8+T细胞增多[10-12]。孟强等[13]通过术前术后自身对照研究指出淋巴化疗对直肠癌患者细胞免疫短期内有一定促进作用，但未与非淋巴化疗患者资料对比，研究缺乏说服力。此外，目前文献资料未见淋巴化疗对体液免疫影响的报道。本研究将探索食管癌术中淋巴化疗对患者细胞免疫是否存在类似促进作用及对体液免疫的影响。
1 资料与方法
1.1 试验设计和病例收集
本研究采用前瞻性非随机对照研究设计，纳入2013年3～10月于华西医院胸外科同一医疗组接受食管癌术中淋巴化疗的病例及同期未接受淋巴化疗的食管癌手术病例。排除标准：①术前曾行放化疗患者；②对纳米活性炭（卡纳琳）不耐受患者（如过敏等）；③拒绝参加本临床试验者；④曾发生食管淋巴回流系统破坏者，如曾做过食管手术，曾发生过严重纵隔感染等；⑤肿瘤巨大，侵犯腹腔脏器或探查患者（即术中发现肿瘤侵犯关键器官，无法切除而结束手术者）；⑥术前或术后免疫学指标缺失者；⑦术前合并自身免疫性疾病者。所有纳入试验病例分为3组：紫杉醇淋巴化疗（lymphatic chemotherapy by pacitaxel，LCP）组、氟尿嘧啶淋巴化疗（lymphatic chemotherapy by fluorouracil，LCF）组及未接受淋巴化疗组（对照组）。患者基线数据（性别、年龄、身高、体重、术前合并症、病理诊断、手术时间、麻醉时间、术后病理分期）亦进行收集。
1.2 试验干预方法
所有纳入病例均接受全身麻醉下经左胸后外侧单切口食管癌根治术。淋巴化疗组（即LCP组和LCF组）于术中胸腔内食管肿瘤下缘用1 ml皮试针分次多点黏膜下注射纳米炭-紫杉醇/氟尿嘧啶混悬液。注射过程注意事项：①回抽后再推，禁止注入血管；②缓慢推注，约2～3 min推完；③为防止渗漏，针头应在组织中潜行一段距离后再缓慢推注，抽出针头时用纱布轻压注射点。混悬液配制方法：纳米炭-紫杉醇混悬液：1 ml（50 mg）纳米炭混悬液（50 mg/支，重庆莱美药业股份有限公司）+ 1 ml （6 mg）紫杉醇注射液（30 mg/支，太极集团四川太极制药有限公司）；纳米炭-氟尿嘧啶混悬液：1 ml纳米炭混悬液+0.25 ml （6.25 mg）氟尿嘧啶注射液（250 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司）。上述两种配置好的混悬液使用前均在37 ℃、120 r/min水浴[江苏金坛市城东新瑞仪器厂，水浴恒温振荡器（摇床）SHA-C]中往复振荡60 min，使纳米炭达到平衡吸附状态。淋巴化疗组与对照组患者术后均常规给予禁食、抗炎、静脉/肠内营养、补液及对症等治疗。
1.3 免疫指标测量
纳入病例均在术前（入院后至手术之间，范围：3～13 d，6.43±2.32 d）、术后第3 d、术后第7 d测量外周血免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）浓度、T细胞亚群（CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞）绝对计数以及CD4+/CD8+比值。免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）浓度的检测采用速率散射比浊法（美国Beckman-counlter公司，IMMAGE全自动免疫浊度分析仪）。CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞绝对计数采用流式细胞术（美国BD公司，FACSCanto流式细胞仪）检测，CD4+/CD8+由上述数据计算得出。
1.4 统计学分析
符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（
2 结 果
2.1 病例纳入情况
根据纳入排除标准，本研究纳入病例48例，其中LCP组、LCF组和对照组分别有5例、5例和1例缺失术后第7 d免疫指标，未纳入结果分析。此外，纳入分析的病例中，LCP组、LCF组和对照组亦分别有5例、6例和2例缺失术后第7 d T细胞亚群绝对计数指标。故对免疫球蛋白进行分析时3组纳入分析例数分别为15例、15例和7例，而T细胞亚群分析时3组实际纳入分析例数分别为10例、9例和5例（图 1）。
图1
受试者纳入流程图
2.2 组间患者基线数据比较
表 1中列出了LCP组、LCF组和对照组研究病例基线数据的比较，可见3组病例在性别、年龄、身高、体重、术前合并症、病理诊断、手术时间、麻醉时间、术后病理分期等情况的差异均无统计学意义（P>0.05）。
表1
LCP组、LCF组和对照组患者基线情况比较（2.3 3 组患者术前、后免疫球蛋白浓度的变化
除IgM在术后第7 d有较术前增长趋势外，其余免疫球蛋白外周血浓度在术后短期内均有不同程度的下降趋势。两组淋巴化疗病例与对照组相比，3种免疫球蛋白浓度的变化差异均无统计学意义（P>0.05），见表 2。
表2
LCP组、LCF组和对照组患者术前、术后免疫球蛋白浓度的变化（g/L，2.4 3 组患者术前、术后T细胞亚群的变化
如表 3所示，与免疫球蛋白术前、术后的变化趋势类似，CD3+、CD4+、CD8+T细胞计数在术后短期内也均有不同程度的下降。接受过淋巴化疗的患者CD8+T细胞降低程度小于未行淋巴化疗者。同时，在LCP组，CD3+T细胞的术后下降的程度也优于未行淋巴化疗的对照组（P=0.030）。其余CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+ /CD8+术前、术后计数变化差异无统计学意义（P>0.05）。
表3
LCP组、LCF组和对照组患者术前、术后T细胞亚群的变化
3 讨 论
纳米炭作为淋巴结系统示踪剂在普外科运用已经较为广泛，在食管癌手术中使用也有报道[15]。由于纳米活性炭具有较强的吸附能力，利用纳米炭吸附化疗药物进行恶性肿瘤的靶向淋巴系统化疗成为了近年来的研究热点之一。一些研究者已经探索了在食管癌患者中用活性炭等载体吸附化疗药物进行淋巴化疗，并取得了较好的临床疗效[16-19]。纳米炭是目前最常用的淋巴化疗载体，其与化疗药组成的淋巴化疗混悬液似乎具有局部免疫调节作用，而相应的研究资料较少[1, 3, 13]。本研究对食管癌患者术中用纳米炭吸附化疗药进行淋巴化疗短期内对免疫功能的影响进行了初步探索。
由于手术、麻醉、输血、镇痛甚至营养支持治疗等措施可能都与患者围手术期免疫指标相关[20-24]，故本研究将与上述方面可能相关的客观指标均纳入组间基线对比分析。所有纳入患者围手术期未输血，且镇痛措施、术后用药都类似，故未纳入相应指标。基线对比结果显示LCP组、LCF组及对照组3组间基线具有可比性。既往研究显示胸导管结扎不会影响食管癌患者术后细胞免疫，也不会对淋巴回流产生严重后果，故本研究基线未将术中胸导管结扎与否纳入基线数据分析[25]。
免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgE与IgD五类，后两者中IgE主要与Ⅰ型超敏反应相关，而IgD主要参与B细胞分化及免疫耐受，本研究不做探讨。IgG是血清含量最高的免疫球蛋白，是主要的抗感染抗体，还可发挥免疫调理作用、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。IgA分为血清型及分泌型，血清型免疫作用较弱，分泌型IgA在皮肤、黏膜局部抗感染中发挥重要作用。IgM主要分布于血液中，其结合抗原、激活补体和免疫调理作用较IgG强，具有重要的抗感染作用[26]。既往研究已指出，因为手术、麻醉、术后治疗等因素影响，食管癌患者术后体液免疫指标低下，本研究结果与之相符，同时进一步说明了淋巴化疗短期内对食管癌患者外周血IgG、IgA及IgM无明显促进作用[24]。故淋巴化疗的食管癌术后患者仍需接受必要的抗感染治疗以度过术后免疫球蛋白低下时期。
CD3分子是T细胞受体复合体（TCR）在细胞膜上的表达及T细胞活化信号传导的必要结构，故CD3+T细胞一定程度上代表了T细胞总水平，为CD4+T细胞与CD8+T细胞之和。CD4+T细胞和CD8+T细胞在接触抗原后分别分化为T辅助细胞、细胞毒性T细胞，前者可促进巨噬细胞、B细胞的免疫应答，后者可直接杀伤靶细胞[26]。3种T细胞计数的测定可大致反映患者细胞免疫的状态。与前人研究结果类似，食管癌患者术后T细胞亚群亦较术前低下[27]。但本研究淋巴化疗组术后CD8+T细胞下降程度明显小于对照组，说明淋巴化疗可能有利于CD8+T细胞术后恢复，即对细胞毒作用有促进作用。淋巴化疗对CD3+T细胞也可能存在短期的促进作用，但需更大样本及更多吸附药物的证实。对CD4+T细胞以及CD4+ /CD8+而言，淋巴化疗未见促进作用。
本试验主要存在三点局限：①由于条件限制，未使用随机分组进行研究；②试验前未计算样本含量，研究病例数偏少；③术后免疫指标的随访时间较短，可能无法完整和准确地反映这些指标的变化趋势。
综上所述，食管癌患者存在体液免疫及细胞免疫紊乱，术后患者免疫功能均较术前低下。淋巴化疗有利于食管癌患者术后T细胞的细胞毒作用的恢复，对体液免疫可能无促进作用。
淋巴管转移是食管癌的主要转移途径，也是影响食管癌远期疗效的主要原因[1]。目前对食管癌淋巴转移的处理方法主要分为术前放化疗、手术淋巴结清扫和术后放化疗。淋巴化疗是利用淋巴系统具有吞噬大分子物质和微粒的特性，将化疗药与载体共价结合、物理包裹或吸附，改变药物的药代动力学，保持化疗药物活性，构成淋巴靶向给药系统的新型化疗方案。该方法具有以下优点：①靶向给药，局部高药物浓度，化疗相关不良反应少；②淋巴靶向给药系统缓释化疗药，使区域淋巴结内较长时间维持抗癌药物高浓度，从而有效杀伤淋巴系统内的肿瘤细胞；③调整局部淋巴结内的免疫活性，恢复淋巴细胞功能[1-3]。由于传统化疗方案中淋巴系统药物浓度较低，近年来淋巴化疗在乳腺癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤围手术期运用广泛，其中以纳米炭吸附化疗药的形式最为常见[4-9]。
人体的特异性免疫系统由体液免疫、细胞免疫两部分组成，前者功能可由免疫球蛋白浓度体现，后者功能由T细胞亚群绝对计数体现。既往较多研究指出食管癌患者存在体液免疫、细胞免疫功能紊乱，多表现为免疫球蛋白、CD3+/CD4+T细胞下降，而CD8+T细胞增多[10-12]。孟强等[13]通过术前术后自身对照研究指出淋巴化疗对直肠癌患者细胞免疫短期内有一定促进作用，但未与非淋巴化疗患者资料对比，研究缺乏说服力。此外，目前文献资料未见淋巴化疗对体液免疫影响的报道。本研究将探索食管癌术中淋巴化疗对患者细胞免疫是否存在类似促进作用及对体液免疫的影响。
1 资料与方法
1.1 试验设计和病例收集
本研究采用前瞻性非随机对照研究设计，纳入2013年3～10月于华西医院胸外科同一医疗组接受食管癌术中淋巴化疗的病例及同期未接受淋巴化疗的食管癌手术病例。排除标准：①术前曾行放化疗患者；②对纳米活性炭（卡纳琳）不耐受患者（如过敏等）；③拒绝参加本临床试验者；④曾发生食管淋巴回流系统破坏者，如曾做过食管手术，曾发生过严重纵隔感染等；⑤肿瘤巨大，侵犯腹腔脏器或探查患者（即术中发现肿瘤侵犯关键器官，无法切除而结束手术者）；⑥术前或术后免疫学指标缺失者；⑦术前合并自身免疫性疾病者。所有纳入试验病例分为3组：紫杉醇淋巴化疗（lymphatic chemotherapy by pacitaxel，LCP）组、氟尿嘧啶淋巴化疗（lymphatic chemotherapy by fluorouracil，LCF）组及未接受淋巴化疗组（对照组）。患者基线数据（性别、年龄、身高、体重、术前合并症、病理诊断、手术时间、麻醉时间、术后病理分期）亦进行收集。
1.2 试验干预方法
所有纳入病例均接受全身麻醉下经左胸后外侧单切口食管癌根治术。淋巴化疗组（即LCP组和LCF组）于术中胸腔内食管肿瘤下缘用1 ml皮试针分次多点黏膜下注射纳米炭-紫杉醇/氟尿嘧啶混悬液。注射过程注意事项：①回抽后再推，禁止注入血管；②缓慢推注，约2～3 min推完；③为防止渗漏，针头应在组织中潜行一段距离后再缓慢推注，抽出针头时用纱布轻压注射点。混悬液配制方法：纳米炭-紫杉醇混悬液：1 ml（50 mg）纳米炭混悬液（50 mg/支，重庆莱美药业股份有限公司）+ 1 ml （6 mg）紫杉醇注射液（30 mg/支，太极集团四川太极制药有限公司）；纳米炭-氟尿嘧啶混悬液：1 ml纳米炭混悬液+0.25 ml （6.25 mg）氟尿嘧啶注射液（250 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司）。上述两种配置好的混悬液使用前均在37 ℃、120 r/min水浴[江苏金坛市城东新瑞仪器厂，水浴恒温振荡器（摇床）SHA-C]中往复振荡60 min，使纳米炭达到平衡吸附状态。淋巴化疗组与对照组患者术后均常规给予禁食、抗炎、静脉/肠内营养、补液及对症等治疗。
1.3 免疫指标测量
纳入病例均在术前（入院后至手术之间，范围：3～13 d，6.43±2.32 d）、术后第3 d、术后第7 d测量外周血免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）浓度、T细胞亚群（CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞）绝对计数以及CD4+/CD8+比值。免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）浓度的检测采用速率散射比浊法（美国Beckman-counlter公司，IMMAGE全自动免疫浊度分析仪）。CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞绝对计数采用流式细胞术（美国BD公司，FACSCanto流式细胞仪）检测，CD4+/CD8+由上述数据计算得出。
1.4 统计学分析
符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（
2 结 果
2.1 病例纳入情况
根据纳入排除标准，本研究纳入病例48例，其中LCP组、LCF组和对照组分别有5例、5例和1例缺失术后第7 d免疫指标，未纳入结果分析。此外，纳入分析的病例中，LCP组、LCF组和对照组亦分别有5例、6例和2例缺失术后第7 d T细胞亚群绝对计数指标。故对免疫球蛋白进行分析时3组纳入分析例数分别为15例、15例和7例，而T细胞亚群分析时3组实际纳入分析例数分别为10例、9例和5例（图 1）。
图1
受试者纳入流程图
2.2 组间患者基线数据比较
表 1中列出了LCP组、LCF组和对照组研究病例基线数据的比较，可见3组病例在性别、年龄、身高、体重、术前合并症、病理诊断、手术时间、麻醉时间、术后病理分期等情况的差异均无统计学意义（P>0.05）。
表1
LCP组、LCF组和对照组患者基线情况比较（2.3 3 组患者术前、后免疫球蛋白浓度的变化
除IgM在术后第7 d有较术前增长趋势外，其余免疫球蛋白外周血浓度在术后短期内均有不同程度的下降趋势。两组淋巴化疗病例与对照组相比，3种免疫球蛋白浓度的变化差异均无统计学意义（P>0.05），见表 2。
表2
LCP组、LCF组和对照组患者术前、术后免疫球蛋白浓度的变化（g/L，2.4 3 组患者术前、术后T细胞亚群的变化
如表 3所示，与免疫球蛋白术前、术后的变化趋势类似，CD3+、CD4+、CD8+T细胞计数在术后短期内也均有不同程度的下降。接受过淋巴化疗的患者CD8+T细胞降低程度小于未行淋巴化疗者。同时，在LCP组，CD3+T细胞的术后下降的程度也优于未行淋巴化疗的对照组（P=0.030）。其余CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+ /CD8+术前、术后计数变化差异无统计学意义（P>0.05）。
表3
LCP组、LCF组和对照组患者术前、术后T细胞亚群的变化
3 讨 论
纳米炭作为淋巴结系统示踪剂在普外科运用已经较为广泛，在食管癌手术中使用也有报道[15]。由于纳米活性炭具有较强的吸附能力，利用纳米炭吸附化疗药物进行恶性肿瘤的靶向淋巴系统化疗成为了近年来的研究热点之一。一些研究者已经探索了在食管癌患者中用活性炭等载体吸附化疗药物进行淋巴化疗，并取得了较好的临床疗效[16-19]。纳米炭是目前最常用的淋巴化疗载体，其与化疗药组成的淋巴化疗混悬液似乎具有局部免疫调节作用，而相应的研究资料较少[1, 3, 13]。本研究对食管癌患者术中用纳米炭吸附化疗药进行淋巴化疗短期内对免疫功能的影响进行了初步探索。
由于手术、麻醉、输血、镇痛甚至营养支持治疗等措施可能都与患者围手术期免疫指标相关[20-24]，故本研究将与上述方面可能相关的客观指标均纳入组间基线对比分析。所有纳入患者围手术期未输血，且镇痛措施、术后用药都类似，故未纳入相应指标。基线对比结果显示LCP组、LCF组及对照组3组间基线具有可比性。既往研究显示胸导管结扎不会影响食管癌患者术后细胞免疫，也不会对淋巴回流产生严重后果，故本研究基线未将术中胸导管结扎与否纳入基线数据分析[25]。
免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgE与IgD五类，后两者中IgE主要与Ⅰ型超敏反应相关，而IgD主要参与B细胞分化及免疫耐受，本研究不做探讨。IgG是血清含量最高的免疫球蛋白，是主要的抗感染抗体，还可发挥免疫调理作用、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。IgA分为血清型及分泌型，血清型免疫作用较弱，分泌型IgA在皮肤、黏膜局部抗感染中发挥重要作用。IgM主要分布于血液中，其结合抗原、激活补体和免疫调理作用较IgG强，具有重要的抗感染作用[26]。既往研究已指出，因为手术、麻醉、术后治疗等因素影响，食管癌患者术后体液免疫指标低下，本研究结果与之相符，同时进一步说明了淋巴化疗短期内对食管癌患者外周血IgG、IgA及IgM无明显促进作用[24]。故淋巴化疗的食管癌术后患者仍需接受必要的抗感染治疗以度过术后免疫球蛋白低下时期。
CD3分子是T细胞受体复合体（TCR）在细胞膜上的表达及T细胞活化信号传导的必要结构，故CD3+T细胞一定程度上代表了T细胞总水平，为CD4+T细胞与CD8+T细胞之和。CD4+T细胞和CD8+T细胞在接触抗原后分别分化为T辅助细胞、细胞毒性T细胞，前者可促进巨噬细胞、B细胞的免疫应答，后者可直接杀伤靶细胞[26]。3种T细胞计数的测定可大致反映患者细胞免疫的状态。与前人研究结果类似，食管癌患者术后T细胞亚群亦较术前低下[27]。但本研究淋巴化疗组术后CD8+T细胞下降程度明显小于对照组，说明淋巴化疗可能有利于CD8+T细胞术后恢复，即对细胞毒作用有促进作用。淋巴化疗对CD3+T细胞也可能存在短期的促进作用，但需更大样本及更多吸附药物的证实。对CD4+T细胞以及CD4+ /CD8+而言，淋巴化疗未见促进作用。
本试验主要存在三点局限：①由于条件限制，未使用随机分组进行研究；②试验前未计算样本含量，研究病例数偏少；③术后免疫指标的随访时间较短，可能无法完整和准确地反映这些指标的变化趋势。
综上所述，食管癌患者存在体液免疫及细胞免疫紊乱，术后患者免疫功能均较术前低下。淋巴化疗有利于食管癌患者术后T细胞的细胞毒作用的恢复，对体液免疫可能无促进作用。
