引用本文： 吴炳群, 柳明亮, 段新春, 崔永. 非小细胞肺癌中TS、ERCC1、TUBB3、RRM1的表达及临床意义. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(6): 813-816. doi: 10.7507/1007-4848.20140233 复制
肺癌是全世界发病率和病死率最高的肿瘤，其中约有80%为非小细胞肺癌(NSCLC) [1-2]。化疗在NSCLC的临床治疗中占有重要的地位，但化疗的有效率低[3]加上毒副作用[4]使得总体疗效并不乐观，5年生存率仍很低[5-6]。近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，与化疗疗效相关的基因发现，结合病理分型，使得化疗个体化逐步成为可能。如何制定个体化化疗方案，通过辅助化疗使更多患者从中获益，以及如何降低医疗成本，成为近年来肺癌领域关注的热点之一。2010年2月至2012年10月我院收治94例NSCLC完全切除的患者，对其肿瘤标本进行免疫组织化学法检测，包括胸苷酸合成酶(TS)、切除修复交叉互补基因1 (ERCC1)、β微管蛋白3 (TUBB3)、核苷酸还原酶亚基1 (RRM1)基因信使核糖核酸(mRNA)表达水平，并对检测结果进行分析，探讨NSCLC个体化化疗中对上述基因表达水平的检测策略。
1 材料与方法
1.1 病例选择
纳入确诊并施行肿瘤完全切除术的94例NSCLC患者，年龄42~78岁，男54例、女40例。鳞癌26例，腺癌67例，肺癌肉瘤部分鳞癌小部分腺癌1例。
1.2 方法
1.2.1 样本采集及检测
术中取肿瘤中心区标本，用10%甲醛固定16~24 h后，送至空军航空医学研究所附属医院分子病理中心。用免疫组织化学法检测ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达。
1.2.2 样本检测的主要试剂和仪器
主要试剂：乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(pH 8.0)、RRM1一抗、tubulin β一抗、ERCC1一抗、PV6000免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)底物显色剂、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司)，苏木素染液、磷酸盐缓冲液(PBS)/三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)。
主要仪器：3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)防脱玻片(北京中杉金桥生物技术有限公司)、AS-325型石蜡切片机(华骏医疗器械有限公司)、LK-3组织切片捞烤机(航天航空部三十五所)、电热恒温干燥箱(天津时泰斯特仪器公司)、1820不锈钢六保险直型高压锅(浙江爱仕达电器股份有限公司)、普通电冰箱(青岛海尔集团)、U-b130光学显微镜(日本奥林巴斯)、小型培养皿(orange公司)。
1.2.3 检测方法
检测方法：(1)组织切片脱蜡和水化；(2)PBS液冲洗标本；(3)抗原热修复；(4)H2O2去离子水孵育；(5)滴加单克隆抗体；(6)PBS再次冲洗；(7)滴加试剂1 (Polymer Helper，来自中杉金桥PV6000：辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体)、PBS或TBS冲洗；(8)滴加试剂2 (poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG，来自中杉金桥PV6000：辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体)、PBS或TBS冲洗；(9)DAB染色；(10)PBS或自来水冲洗；(11)苏木精复染，自来水冲洗返蓝；(12)脱水；(13)用中性树胶封片；(14)镜检。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件进行统计处理，ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达数据的比较采用相关分析和卡方检验。
2 结果
TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达结果分析：TS基因mRNA低表达91例(96.81%)，ERCC1基因mRNA低表达90例(95.74%)；而TUBB3基因mRNA低表达59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表达48例(51.06%)。腺癌组织TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达与非腺癌组织的差异无统计学意义(P > 0.05)，但腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表达的比率明显低于非腺癌患者(58.21% vs.74.07%)；见表 1。
表1
TS、ERCC1、TUBB3和RRM1基因mRNA的表达结果(例)
相同病理类型的NSCLC患者TS、ERCC1、TUBB3基因mRNA表达与RRM1基因mRNA表达均呈正相关(相关系数均大于0.80)；见表 2。
表2
ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达结果的相关性分析(相关系数值)
3 讨论
目前NSCLC患者推荐采用辅助化疗的标准为使用以铂类为基础和第三代抗肿瘤药物(吉西他滨、多西他赛、长春瑞滨、紫杉醇)的两药联合用药方案[7-8]。化疗在NSCLC的综合治疗中占据重要的地位。但化疗有效率低，毒副作用和治疗成本限制了其应用。主要由于肿瘤的异质性，同一种病理类型和分期的肺癌患者，对标准化疗敏感性差异较大，因此，近年来提出针对不同患者进行个体化治疗的概念，与CT引导下的射频消融相比，后者远期效果尚需观察[9]。随着对化疗分子机制的认识不断进展，目前已发现一些肿瘤分子标记物的改变与化疗敏感性有关。针对不同的分子标记物制定不同的个体化化疗方案对于改善NSCLC患者的生存期具有重要的意义。通过检测TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达，来指导个体化化疗方案的制定，为临床提供了一种选择，同时也增加了相关的成本。
TS是多靶点抗叶酸药培美曲塞的靶酶之一[10]，培美曲赛的耐药与其高表达相关[11]，多项研究表明，在疗效和无进展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表达者明显优于高水平表达者[12-13]，但有少数研究表明培美曲赛的耐药与其表达无关[14]。ERCC1是核苷酸切除修复系统家族中的标志基因，是细胞存活必须的脱氧核糖核酸(DNA)修复基因，高表达的ERCC1蛋白能使停滞在细胞周期G2/M期的肺癌细胞得以迅速修复。ERCC1表达蛋白的下调可减少肿瘤细胞双脱氧核糖核苷酸(DDP-DNA)加合物的修复[15]。多项权威研究[16-18]证实，在以顺铂为基础的辅助化疗中，低水平表达的ERCC1蛋白与患者长期生存有关。微管蛋白不仅是细胞骨架和纺锤体的主要成分，而且是紫杉醇作用的位点，与紫杉醇的获得性耐药密切相关[19]。Zhang等[20]对10个临床研究的荟萃分析和Vilmar等[21]一项前瞻性临床随机对照研究均证实TUBB3低表达者有效率高于高表达者，低表达可以作为选择长春瑞滨和紫杉醇化疗药物的指标。核苷酸还原酶(RR)作为一种限速酶在DNA的合成和损伤修复中必不可少，其酶的活性是细胞存活的关键。RRM1是核苷酸结合位点，是控制RR活性最关键的部分，同时也是核苷类药物的结合位点，RRM1的表达水平与肿瘤细胞对吉西他滨耐药密切相关[22]，已发布的数据[23-25]表明低RRM1表达水平的肺癌患者对吉西他滨治疗获益较大。
本研究通过对NSCLC患者手术切除标本ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达水平的检测，结合病理分型，经过一系列统计学分析，发现ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达的一些规律，为临床基因检测策略及化疗药物选择提供一定的帮助。TS基因mRNA低表达者91例，占96.81% (91/94)，表达水平低，在疗效和无进展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表达者明显优于高水平表达者，且在不同病理类型患者中TS基因mRNA低表达率均非常高，可在未进行TS mRNA表达水平检测的情况下，常规选用培美曲塞作为化疗药物(即常规不检测TS mRNA表达水平，认为其为低表达)。ERCC1基因mRNA低表达90例，占95.74% (90/94)，在以顺铂为基础的辅助化疗中，低水平表达的ERCC1蛋白与患者长期生存有关，即也可在未进行ERCC1 mRNA表达水平检测的情况下，常规选用铂类药物作为化疗药物。基于上述两基因mRNA的表达水平，对于晚期及病理获得困难的NSCLC患者，应考虑选择对TS、ERCC1 mRNA低水平表达敏感的药物，即铂类药物和培美曲塞。TUBB3、RRM1基因mRNA低表达的患者较少，TUBB3基因mRNA低表达59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表达48例(51.06%)，低TUBB3表达可以选择长春瑞滨和紫杉醇化疗药物，低RRM1表达的肺癌患者对吉西他滨治疗获益较大，在选择长春瑞滨和紫杉醇及吉西他滨化疗药物前，应常规检测TUBB3、RRM1基因mRNA表达水平。
考虑到相同病理类型NSCLC患者各个基因表达水平之间存在相关性，如TUBB3、RRM1基因mRNA为低表达，即可认为TS、ERCC1基因mRNA为低表达，但是如前两者表达水平较高，建议检测TS或ERCC1基因mRNA水平，为准确选择化疗药物提供保障。在肺腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表达的比率明显低于非腺癌患者(58.21% vs. 74.07%)，即对于非腺癌患者，无法检测其表达水平时，推荐使用长春瑞滨和紫杉醇化疗。
本研究为较初步的研究，但对指导临床用药，选择合理的基因表达水平检测，在减少和避免不必要的医疗负担的情况下，尽量不影响个体化化疗疗效，有较大的临床应用价值。但本研究结果仅是一种趋势，且入组病例数较少，要想明确TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA在不同病理类型NSCLC患者中的表达规律，还需大样本、多中心的研究。以此为基础的NSCLC个体化化疗是否可以真正提高患者的5年生存率则需要前瞻性、随机临床对照研究进一步证实。
肺癌是全世界发病率和病死率最高的肿瘤，其中约有80%为非小细胞肺癌(NSCLC) [1-2]。化疗在NSCLC的临床治疗中占有重要的地位，但化疗的有效率低[3]加上毒副作用[4]使得总体疗效并不乐观，5年生存率仍很低[5-6]。近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，与化疗疗效相关的基因发现，结合病理分型，使得化疗个体化逐步成为可能。如何制定个体化化疗方案，通过辅助化疗使更多患者从中获益，以及如何降低医疗成本，成为近年来肺癌领域关注的热点之一。2010年2月至2012年10月我院收治94例NSCLC完全切除的患者，对其肿瘤标本进行免疫组织化学法检测，包括胸苷酸合成酶(TS)、切除修复交叉互补基因1 (ERCC1)、β微管蛋白3 (TUBB3)、核苷酸还原酶亚基1 (RRM1)基因信使核糖核酸(mRNA)表达水平，并对检测结果进行分析，探讨NSCLC个体化化疗中对上述基因表达水平的检测策略。
1 材料与方法
1.1 病例选择
纳入确诊并施行肿瘤完全切除术的94例NSCLC患者，年龄42~78岁，男54例、女40例。鳞癌26例，腺癌67例，肺癌肉瘤部分鳞癌小部分腺癌1例。
1.2 方法
1.2.1 样本采集及检测
术中取肿瘤中心区标本，用10%甲醛固定16~24 h后，送至空军航空医学研究所附属医院分子病理中心。用免疫组织化学法检测ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达。
1.2.2 样本检测的主要试剂和仪器
主要试剂：乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(pH 8.0)、RRM1一抗、tubulin β一抗、ERCC1一抗、PV6000免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)底物显色剂、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司)，苏木素染液、磷酸盐缓冲液(PBS)/三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)。
主要仪器：3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)防脱玻片(北京中杉金桥生物技术有限公司)、AS-325型石蜡切片机(华骏医疗器械有限公司)、LK-3组织切片捞烤机(航天航空部三十五所)、电热恒温干燥箱(天津时泰斯特仪器公司)、1820不锈钢六保险直型高压锅(浙江爱仕达电器股份有限公司)、普通电冰箱(青岛海尔集团)、U-b130光学显微镜(日本奥林巴斯)、小型培养皿(orange公司)。
1.2.3 检测方法
检测方法：(1)组织切片脱蜡和水化；(2)PBS液冲洗标本；(3)抗原热修复；(4)H2O2去离子水孵育；(5)滴加单克隆抗体；(6)PBS再次冲洗；(7)滴加试剂1 (Polymer Helper，来自中杉金桥PV6000：辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体)、PBS或TBS冲洗；(8)滴加试剂2 (poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG，来自中杉金桥PV6000：辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体)、PBS或TBS冲洗；(9)DAB染色；(10)PBS或自来水冲洗；(11)苏木精复染，自来水冲洗返蓝；(12)脱水；(13)用中性树胶封片；(14)镜检。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件进行统计处理，ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达数据的比较采用相关分析和卡方检验。
2 结果
TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达结果分析：TS基因mRNA低表达91例(96.81%)，ERCC1基因mRNA低表达90例(95.74%)；而TUBB3基因mRNA低表达59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表达48例(51.06%)。腺癌组织TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达与非腺癌组织的差异无统计学意义(P > 0.05)，但腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表达的比率明显低于非腺癌患者(58.21% vs.74.07%)；见表 1。
表1
TS、ERCC1、TUBB3和RRM1基因mRNA的表达结果(例)
相同病理类型的NSCLC患者TS、ERCC1、TUBB3基因mRNA表达与RRM1基因mRNA表达均呈正相关(相关系数均大于0.80)；见表 2。
表2
ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达结果的相关性分析(相关系数值)
3 讨论
目前NSCLC患者推荐采用辅助化疗的标准为使用以铂类为基础和第三代抗肿瘤药物(吉西他滨、多西他赛、长春瑞滨、紫杉醇)的两药联合用药方案[7-8]。化疗在NSCLC的综合治疗中占据重要的地位。但化疗有效率低，毒副作用和治疗成本限制了其应用。主要由于肿瘤的异质性，同一种病理类型和分期的肺癌患者，对标准化疗敏感性差异较大，因此，近年来提出针对不同患者进行个体化治疗的概念，与CT引导下的射频消融相比，后者远期效果尚需观察[9]。随着对化疗分子机制的认识不断进展，目前已发现一些肿瘤分子标记物的改变与化疗敏感性有关。针对不同的分子标记物制定不同的个体化化疗方案对于改善NSCLC患者的生存期具有重要的意义。通过检测TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表达，来指导个体化化疗方案的制定，为临床提供了一种选择，同时也增加了相关的成本。
TS是多靶点抗叶酸药培美曲塞的靶酶之一[10]，培美曲赛的耐药与其高表达相关[11]，多项研究表明，在疗效和无进展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表达者明显优于高水平表达者[12-13]，但有少数研究表明培美曲赛的耐药与其表达无关[14]。ERCC1是核苷酸切除修复系统家族中的标志基因，是细胞存活必须的脱氧核糖核酸(DNA)修复基因，高表达的ERCC1蛋白能使停滞在细胞周期G2/M期的肺癌细胞得以迅速修复。ERCC1表达蛋白的下调可减少肿瘤细胞双脱氧核糖核苷酸(DDP-DNA)加合物的修复[15]。多项权威研究[16-18]证实，在以顺铂为基础的辅助化疗中，低水平表达的ERCC1蛋白与患者长期生存有关。微管蛋白不仅是细胞骨架和纺锤体的主要成分，而且是紫杉醇作用的位点，与紫杉醇的获得性耐药密切相关[19]。Zhang等[20]对10个临床研究的荟萃分析和Vilmar等[21]一项前瞻性临床随机对照研究均证实TUBB3低表达者有效率高于高表达者，低表达可以作为选择长春瑞滨和紫杉醇化疗药物的指标。核苷酸还原酶(RR)作为一种限速酶在DNA的合成和损伤修复中必不可少，其酶的活性是细胞存活的关键。RRM1是核苷酸结合位点，是控制RR活性最关键的部分，同时也是核苷类药物的结合位点，RRM1的表达水平与肿瘤细胞对吉西他滨耐药密切相关[22]，已发布的数据[23-25]表明低RRM1表达水平的肺癌患者对吉西他滨治疗获益较大。
本研究通过对NSCLC患者手术切除标本ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达水平的检测，结合病理分型，经过一系列统计学分析，发现ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表达的一些规律，为临床基因检测策略及化疗药物选择提供一定的帮助。TS基因mRNA低表达者91例，占96.81% (91/94)，表达水平低，在疗效和无进展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表达者明显优于高水平表达者，且在不同病理类型患者中TS基因mRNA低表达率均非常高，可在未进行TS mRNA表达水平检测的情况下，常规选用培美曲塞作为化疗药物(即常规不检测TS mRNA表达水平，认为其为低表达)。ERCC1基因mRNA低表达90例，占95.74% (90/94)，在以顺铂为基础的辅助化疗中，低水平表达的ERCC1蛋白与患者长期生存有关，即也可在未进行ERCC1 mRNA表达水平检测的情况下，常规选用铂类药物作为化疗药物。基于上述两基因mRNA的表达水平，对于晚期及病理获得困难的NSCLC患者，应考虑选择对TS、ERCC1 mRNA低水平表达敏感的药物，即铂类药物和培美曲塞。TUBB3、RRM1基因mRNA低表达的患者较少，TUBB3基因mRNA低表达59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表达48例(51.06%)，低TUBB3表达可以选择长春瑞滨和紫杉醇化疗药物，低RRM1表达的肺癌患者对吉西他滨治疗获益较大，在选择长春瑞滨和紫杉醇及吉西他滨化疗药物前，应常规检测TUBB3、RRM1基因mRNA表达水平。
考虑到相同病理类型NSCLC患者各个基因表达水平之间存在相关性，如TUBB3、RRM1基因mRNA为低表达，即可认为TS、ERCC1基因mRNA为低表达，但是如前两者表达水平较高，建议检测TS或ERCC1基因mRNA水平，为准确选择化疗药物提供保障。在肺腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表达的比率明显低于非腺癌患者(58.21% vs. 74.07%)，即对于非腺癌患者，无法检测其表达水平时，推荐使用长春瑞滨和紫杉醇化疗。
本研究为较初步的研究，但对指导临床用药，选择合理的基因表达水平检测，在减少和避免不必要的医疗负担的情况下，尽量不影响个体化化疗疗效，有较大的临床应用价值。但本研究结果仅是一种趋势，且入组病例数较少，要想明确TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA在不同病理类型NSCLC患者中的表达规律，还需大样本、多中心的研究。以此为基础的NSCLC个体化化疗是否可以真正提高患者的5年生存率则需要前瞻性、随机临床对照研究进一步证实。
