引用本文： 丁士骜, 梅举, 鲍春荣, 张俊文, 杨阳, 袁源, 尹航. 草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(3): 274-279. doi: 10.7507/1007-4848.20160064 复制
缺血性心脏病是一个公共健康问题，发病率呈逐年上升趋势，在世界范围内有着很高的患病率死亡率[1]。针对心肌缺血后恢复血流灌注的治疗策略在临床实践中经常使用的，包括溶栓、血管成形术[2]。然而，在灌注过程中，恢复血流量往往达不到预期的的恢复效果，甚至加重细胞坏死[3]。体外循环下心脏手术典型的治疗过程中有心脏缺血停跳及复灌复跳的过程，从而造成的心肌缺血再灌注损伤是影响手术治疗效果及术后远期恢复的重要因素。不同的病理因素，如炎症、氧化应激、细胞凋亡，都参与了心肌缺血再灌注损伤的病理机制[4]。因此，缺血再灌注损伤多靶点的治疗策略是我们迫切需要解决的问题。
多年来，一些药物已被证明在动物实验中具有心脏保护作用，然而只有极少数成功应用于临床实践[5]。这是由于，不仅药物疗效存在物种差异，更重要的还有很多全身性的副作用和有限的疗效[6]。最近的一项研究表明，延胡索酸作为人体内三羧酸循环的小分子中间代谢产物具有很好的心肌保护作用，且安全性高[7]，据此我们推测其结构类似物是否也有相似的心肌保护作用。草酰乙酸作为延胡索酸的分子结构类似物，是生物体代谢过程中产生的重要有机酸。研究表明，草酰乙酸对脑的缺血再灌注损伤具有保护作用[8]。在本研究中，我们研究草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、实验材料及分组
1.1.1 试验动物
SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠60只，体重200～250 g，雄性、清洁级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物许可证号码：SCXK（沪） 2012-0002]。饲养环境：在温度22～25℃、相对湿度40%～70%，光照时间随自然变化，供给常规颗粒饲料和灭菌蒸馏水，自由饮食。
1.1.2 实验药品及试剂
实验药品及试剂包括草酰乙酸（上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：D1417062）,大鼠肌钙蛋白I（cTn-I）ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号：20150126），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（上海蓝怡科技有限公司，批号：R403ACA），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150126），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150124），抗体：Actin（Santa，批号：sc-1616r），NF-E2相关因子2（Nrf2）（Santa，批号：sc-722），Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1 （Keap1）（Bio World，批号：bs6783），血红素氧合酶1（HO-1）（Santa，批号：sc-1797）。
1.1.3 分组
大鼠随机分为6组，每组10只，分别是：阴性对照组、假手术组、模型组、草酰乙酸组5 mg/kg、草酰乙酸组60 mg/kg、草酰乙酸组240 mg/kg。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型建立
术前连续给药5 d，每天 2次，阴性对照组，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液鼻饲。末次给药30 min后，阴性对照组不开胸，假手术组予以开胸，但不结扎冠状动脉前降支，模型组和药物组大鼠结扎冠状动脉前降支制备大鼠心肌缺血模型。以2%的戊巴比妥钠 （2 ml/kg）腹内注射麻醉大鼠，将麻醉的大鼠腹面朝上缚于鼠台上。行气管切开，接于小动物呼吸机行正压辅助通气（小动物呼吸机）。分离右侧颈总动脉，连接RM6240生物信号处理系统，记录左心室内压（LVSP），左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒张期末压力（LVEDP），并同时记录肢体导联心电图。沿大鼠胸骨左缘1 cm处做纵向切口，逐层分离。于左心耳下方2 mm处用6-0无损伤带线缝合针结扎前降支。结扎前在结扎处放置一根直径为4 mm、长5 mm的乳胶管，以便剪开结扎的丝线行再灌注。以Ⅱ导联心电图出现ST段抬高和出现左心缺血性颜色改变为标准判定急性心肌缺血。持续呼吸机正压通气，维持心肌缺血30 min，剪开结扎丝线，关闭胸腔，再灌注180 min。
1.2.2 血清生化指标测定
大鼠心肌缺血再灌注180 min后，给予10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r离心10 min，分离取血清。测定各项指标：乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶按照试剂盒说明书操作，用生化分析仪进行测定；肌钙蛋白Ⅰ采用酶联免疫吸附法（ELISA）用酶标仪进行测定。
1.2.3 NBT染色测定心肌梗死面积
放血处死大鼠后，迅速取出心脏，置冰冷生理盐水中冲洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌组织，置于-20℃冰箱放置30 min。在心脏结扎线下，平行冠状沟将心脏自心尖至心底部切成6片（厚1.5～2 mm），后置于0.5% NBT磷酸盐缓冲液中（pH 7.4）于37℃恒温水浴中孵育10 min。NBT将大鼠心肌正常部分染色成均匀的蓝色，而梗塞区不染色或者呈现灰黄色。待梗塞心肌界线清楚时立即取出，小心分离梗死区，称取梗塞心肌（不染色者）重量（g）、左心室重量。以梗塞心肌与左室重量的百分比作为心肌梗死范围的评定指标。
1.2.4 蛋白免疫印迹技术（Western Blot）测定
取灌注3 h的受损心肌组织利用蛋白免疫印迹技术检测受损心肌组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的含量，利用蛋白分离试剂盒（pierce，USA）分离核蛋白及细胞质蛋白，而另一组织样本中进行心肌总蛋白的提取。取出液氮冻存的心肌组织，于冰上使用无菌手术刀切取约200 mg组织，转移组织到干净的1.5 ml离心管；每管加入1 ml的T-PER试剂，使用电动匀浆器进行组织匀浆，使组织充分裂解，直至液体变得黏稠；4℃、12 000离心加速度条件下离心5 min；收集上清液，进行总蛋白浓度检测。利用改良Bradford法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）测定蛋白浓度后，在SDS-PAGE上蛋白的电泳分离，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，封闭后的PVDF膜封入稀释好的一抗抗体[HO-1 （1:500），Keap1 （1:1 000）， Nrf2 （1:100 0）]，4 ℃孵育过夜，清洗后加入相应二抗[HO-1 （1:5 000），Keap1 （1:3 000），Nrf2 （1:3 000）]，室温孵育1 h，取出膜缓冲液冲洗后，利用化学发光试剂检测（Pierce® ECL Western Blotting Substrate，32106），凝胶定量分析软件Quantity One处理系统分析目标带的光密度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。所有试验数据均以均数±标准差（
2 结果
2.1 对大鼠心肌缺血再灌注后心功能的影响
2.1.1 缺血再灌注前各组大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP情况
大鼠缺血再灌注前，各组大鼠左心室内压（LVSP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒张期末压力（LVEDP）水平相近（表 1）。
表1
缺血再灌注前各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax参数（2.1.2 缺血再灌注后各组大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP变化情况
缺血再灌注后，模型组较假手术组大鼠左心室内压（LVSP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）水平显著降低，大鼠左心室舒张末期压力（LVEDP）显著升高。与模型组比较，60 mg/kg、120 mg/kg的草酰乙酸组，大鼠左心室内压（LVSP）和左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）显著升高，左心室舒张期末压力（LVEDP）明显降低，并且效果与苹果酸浓度成正相关，效果差异有统计学意义（表 2）。
表2
缺血再灌注后各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax变化情况（2.2 大鼠血清酶指标的变化情况
2.2.1 肌钙蛋白Ⅰ和乳酸脱氢酶的变化情况
与假手术组比较，模型组大鼠的肌钙蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脱氢酶（LDH）含量明显增高，差异显著（P<0.01）；与模型组比较，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组能显著降低大鼠肌钙蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脱氢酶（LDH）含量（P<0.05），差异有统计学意义（表 3）。
表3
各组大鼠CTn-I、LDH变化情况（2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的变化情况
与假手术组相比，模型组大鼠在心肌缺血再灌注后SOD和GSH-PX活性显著降低；与模型组比较，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组大鼠的SOD和GSH-PX活性明显升高（P<0.05），并且随着浓度的增加，抑制下降的作用越明显，差异有统计学意义（表 4）。
表4
各组大鼠SOD、GSH-PX活性变化情况（2.3 大鼠心肌梗死面积的变化情况
与模型组比较，各给药组均能减小心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌缺血梗死范围，减小心肌梗塞面积，而且随着浓度的进一步增加，效果继续增强，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组对大鼠心肌梗塞面积的减少的差异有统计学意义（P<0.05），结果见表 5。
表5
对大鼠心肌梗死面积的影响（2.4 Western Blot检测结果
缺血再灌注3 h后，取240 mg/kg心肌缺血-再灌注（OAA）预处理后心肌组织，进行western blot检测。结果显示：与模型组相比，OAA组心肌细胞中总Nrf2表达和细胞核蛋白中Nrf2表达明显升高（P<0.001）；OAA组心肌组织中的HO-1蛋白水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.001）；而Keap1作为Nrf2的特异性的抑制蛋白，在OAA预处理模型心肌中，表达下调，差异有统计学意义（P<0.001），结果见图 1。
图1
Western Blot检测心肌组织蛋白的表达
注：与模型组比较，***
3 讨论
当心肌发生缺血时，心脏组织中的氧和营养的需求下降，血液供应也受到严重的削弱[1]，长时间的心肌缺血后，重新恢复心肌组织的血流供应不但不能缓解原发性损伤，反而加重心肌损伤，最终导致患者心肌结构和功能发生变化[6]。然而，无论缺血再灌注损伤结果如何，提前使用合理药物干预有助于减少缺血再灌注后心肌的损伤程度，促进术后恢复。
在本实验中，我们通过建立大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型，揭示草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护性作用以及可能的作用机制。我们的研究结果提示，心肌缺血再灌注损伤可导致心肌细胞损伤、坏死，最终导致心肌梗死以及心脏功能障碍甚至丧失。而给予草酰乙酸预处理后可明显提高缺血再灌注损伤后心脏的收缩功能（+dp/dtmax）、舒张功能（-dp/dtmax）、左室收缩压（LVSP），降低左室舒张压（LVEDP），能减少心肌梗死面积，促进心脏功能恢复，并降低血清中肌钙蛋白及乳酸脱氢酶的含量。同时，实验结果显示，草酰乙酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用具有高度的药物浓度依赖性。
现在普遍认为，心肌缺血再灌注损伤过程的特征是炎性病变、氧化损伤和细胞凋亡等。更重要的是这些因素之间的相互协同作用，比较公认的是心肌缺血再灌注时产生的活性氧（ROS）所导致的氧化应激，在缺血的发展起着决定性作用[9-10]。通常机体内抗氧化能力与自由基的产生保持动态均衡，然而当自由基的产生超过机体自身的抗氧化能力负荷时，则会发生氧化应激及相关的损伤[11]。体内有一系列抗氧化酶是负责清除体内过量的ROS。这些抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等协同作用在各种应激条件下（包括心肌缺血再灌注损伤）为机体提供了一道对抗氧化应激的坚固防线[12]。因此，那些能够增强抗氧化酶的活性或者能够上调那些抗氧化酶表达的药物是抑制缺血再灌注引起的组织损伤的一个潜在的治疗靶点，具有非常广阔的临床应用前景。本实验中，草酰乙酸能够显著增加SOD、GSH-Px的含量，提示草酰乙酸的应用能够在抗氧化应激层面起到心肌保护作用。
Nrf2是一种转录因子，能调节抗氧化应激相关的很多种基因的表达，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等[13]。研究显示，敲除Nrf2基因的小鼠受到外界的氧化刺激后，ROS较野生小鼠明显增多[14]。莱菔硫烷、硫化氢、黄岑素、延胡索酸[15-18]等物质通过激活Nrf2并促进其转入细胞核内，促进下游抗氧化酶的表达而保护心肌细胞。本实验中，测定心肌组织中总的Nrf2和细胞核内Nrf2含量以及Nrf2下游HO-1的表达。在经过草酰乙酸预处理的缺血再灌注的心肌组织中我们发现细胞总的Nrf2的表达和细胞核内Nrf2含量显着增强，下游的HO-1表达明显上调。因此，草酰乙酸通过上调Nrf2的表达以及增强Nrf2的细胞核转移，增强下游抗氧化基因的表达，减少氧化应激导致的心肌损伤。
Keap1是一种胞浆蛋白，富含半胱氨酸残基，常态下Keap1在胞质中与Nrf2组成复合物，使得胞质内的Nrf2持续通过泛素化途径被蛋白降解，抑制Nrf2从胞质转移到核内[19]。当机体或细胞受到外界氧化刺激时，Keap1从Kaep1-Nrf2复合物中解离，解离后的Nrf2的活性增加，有转录活性的Nrf2累积后易位到细胞核内，启动Nrf2下游抗氧化基因如血红素加氧酶（HO-1）等的表达，抑制氧化应激损伤[20]。到目前为止，药物通过增加Nrf2的核转移途径保护心肌的研究很多，但是心肌保护药物是否通过抑制Keap1的表达，减少Nrf2降解，促进其转移进入细胞核，启动抗氧化基因的表达的研究报道目前为止还很少。因此，草酰乙酸预处理是否抑制Keap1的表达很值得探索，与对照组相比，在经过草酰乙酸预处理的缺血再灌注的心肌组织中Keap1的表达是显著减弱的。
综上所述，本实验揭示草酰乙酸预处理可减少缺血再灌注损伤后大鼠心肌梗死面积，减少心肌细胞的损伤，抗氧化损伤机制发挥重要作用，它能下调Keap1的表达，增强Nrf2的表达和核转移，增加下游抗氧化蛋白的表达。然而，草酰乙酸是通过抑制Keap1,减少Nrf2的降解，还是除此之外具有直接上调Nrf2的表达的作用，还需要进一步通过实验去探索。本实验不仅证实草酰乙酸具有可靠的心肌保护作用，更重要的是提示人体的内源性小分子本身也具有很好的保护心肌的作用，且内源性的小分子的安全性高，具有很广阔的研究及临床应用前景。
缺血性心脏病是一个公共健康问题，发病率呈逐年上升趋势，在世界范围内有着很高的患病率死亡率[1]。针对心肌缺血后恢复血流灌注的治疗策略在临床实践中经常使用的，包括溶栓、血管成形术[2]。然而，在灌注过程中，恢复血流量往往达不到预期的的恢复效果，甚至加重细胞坏死[3]。体外循环下心脏手术典型的治疗过程中有心脏缺血停跳及复灌复跳的过程，从而造成的心肌缺血再灌注损伤是影响手术治疗效果及术后远期恢复的重要因素。不同的病理因素，如炎症、氧化应激、细胞凋亡，都参与了心肌缺血再灌注损伤的病理机制[4]。因此，缺血再灌注损伤多靶点的治疗策略是我们迫切需要解决的问题。
多年来，一些药物已被证明在动物实验中具有心脏保护作用，然而只有极少数成功应用于临床实践[5]。这是由于，不仅药物疗效存在物种差异，更重要的还有很多全身性的副作用和有限的疗效[6]。最近的一项研究表明，延胡索酸作为人体内三羧酸循环的小分子中间代谢产物具有很好的心肌保护作用，且安全性高[7]，据此我们推测其结构类似物是否也有相似的心肌保护作用。草酰乙酸作为延胡索酸的分子结构类似物，是生物体代谢过程中产生的重要有机酸。研究表明，草酰乙酸对脑的缺血再灌注损伤具有保护作用[8]。在本研究中，我们研究草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、实验材料及分组
1.1.1 试验动物
SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠60只，体重200～250 g，雄性、清洁级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物许可证号码：SCXK（沪） 2012-0002]。饲养环境：在温度22～25℃、相对湿度40%～70%，光照时间随自然变化，供给常规颗粒饲料和灭菌蒸馏水，自由饮食。
1.1.2 实验药品及试剂
实验药品及试剂包括草酰乙酸（上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：D1417062）,大鼠肌钙蛋白I（cTn-I）ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号：20150126），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（上海蓝怡科技有限公司，批号：R403ACA），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150126），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150124），抗体：Actin（Santa，批号：sc-1616r），NF-E2相关因子2（Nrf2）（Santa，批号：sc-722），Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1 （Keap1）（Bio World，批号：bs6783），血红素氧合酶1（HO-1）（Santa，批号：sc-1797）。
1.1.3 分组
大鼠随机分为6组，每组10只，分别是：阴性对照组、假手术组、模型组、草酰乙酸组5 mg/kg、草酰乙酸组60 mg/kg、草酰乙酸组240 mg/kg。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型建立
术前连续给药5 d，每天 2次，阴性对照组，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液鼻饲。末次给药30 min后，阴性对照组不开胸，假手术组予以开胸，但不结扎冠状动脉前降支，模型组和药物组大鼠结扎冠状动脉前降支制备大鼠心肌缺血模型。以2%的戊巴比妥钠 （2 ml/kg）腹内注射麻醉大鼠，将麻醉的大鼠腹面朝上缚于鼠台上。行气管切开，接于小动物呼吸机行正压辅助通气（小动物呼吸机）。分离右侧颈总动脉，连接RM6240生物信号处理系统，记录左心室内压（LVSP），左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒张期末压力（LVEDP），并同时记录肢体导联心电图。沿大鼠胸骨左缘1 cm处做纵向切口，逐层分离。于左心耳下方2 mm处用6-0无损伤带线缝合针结扎前降支。结扎前在结扎处放置一根直径为4 mm、长5 mm的乳胶管，以便剪开结扎的丝线行再灌注。以Ⅱ导联心电图出现ST段抬高和出现左心缺血性颜色改变为标准判定急性心肌缺血。持续呼吸机正压通气，维持心肌缺血30 min，剪开结扎丝线，关闭胸腔，再灌注180 min。
1.2.2 血清生化指标测定
大鼠心肌缺血再灌注180 min后，给予10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r离心10 min，分离取血清。测定各项指标：乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶按照试剂盒说明书操作，用生化分析仪进行测定；肌钙蛋白Ⅰ采用酶联免疫吸附法（ELISA）用酶标仪进行测定。
1.2.3 NBT染色测定心肌梗死面积
放血处死大鼠后，迅速取出心脏，置冰冷生理盐水中冲洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌组织，置于-20℃冰箱放置30 min。在心脏结扎线下，平行冠状沟将心脏自心尖至心底部切成6片（厚1.5～2 mm），后置于0.5% NBT磷酸盐缓冲液中（pH 7.4）于37℃恒温水浴中孵育10 min。NBT将大鼠心肌正常部分染色成均匀的蓝色，而梗塞区不染色或者呈现灰黄色。待梗塞心肌界线清楚时立即取出，小心分离梗死区，称取梗塞心肌（不染色者）重量（g）、左心室重量。以梗塞心肌与左室重量的百分比作为心肌梗死范围的评定指标。
1.2.4 蛋白免疫印迹技术（Western Blot）测定
取灌注3 h的受损心肌组织利用蛋白免疫印迹技术检测受损心肌组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的含量，利用蛋白分离试剂盒（pierce，USA）分离核蛋白及细胞质蛋白，而另一组织样本中进行心肌总蛋白的提取。取出液氮冻存的心肌组织，于冰上使用无菌手术刀切取约200 mg组织，转移组织到干净的1.5 ml离心管；每管加入1 ml的T-PER试剂，使用电动匀浆器进行组织匀浆，使组织充分裂解，直至液体变得黏稠；4℃、12 000离心加速度条件下离心5 min；收集上清液，进行总蛋白浓度检测。利用改良Bradford法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）测定蛋白浓度后，在SDS-PAGE上蛋白的电泳分离，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，封闭后的PVDF膜封入稀释好的一抗抗体[HO-1 （1:500），Keap1 （1:1 000）， Nrf2 （1:100 0）]，4 ℃孵育过夜，清洗后加入相应二抗[HO-1 （1:5 000），Keap1 （1:3 000），Nrf2 （1:3 000）]，室温孵育1 h，取出膜缓冲液冲洗后，利用化学发光试剂检测（Pierce® ECL Western Blotting Substrate，32106），凝胶定量分析软件Quantity One处理系统分析目标带的光密度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。所有试验数据均以均数±标准差（
2 结果
2.1 对大鼠心肌缺血再灌注后心功能的影响
2.1.1 缺血再灌注前各组大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP情况
大鼠缺血再灌注前，各组大鼠左心室内压（LVSP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒张期末压力（LVEDP）水平相近（表 1）。
表1
缺血再灌注前各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax参数（2.1.2 缺血再灌注后各组大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP变化情况
缺血再灌注后，模型组较假手术组大鼠左心室内压（LVSP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）水平显著降低，大鼠左心室舒张末期压力（LVEDP）显著升高。与模型组比较，60 mg/kg、120 mg/kg的草酰乙酸组，大鼠左心室内压（LVSP）和左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）显著升高，左心室舒张期末压力（LVEDP）明显降低，并且效果与苹果酸浓度成正相关，效果差异有统计学意义（表 2）。
表2
缺血再灌注后各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax变化情况（2.2 大鼠血清酶指标的变化情况
2.2.1 肌钙蛋白Ⅰ和乳酸脱氢酶的变化情况
与假手术组比较，模型组大鼠的肌钙蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脱氢酶（LDH）含量明显增高，差异显著（P<0.01）；与模型组比较，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组能显著降低大鼠肌钙蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脱氢酶（LDH）含量（P<0.05），差异有统计学意义（表 3）。
表3
各组大鼠CTn-I、LDH变化情况（2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的变化情况
与假手术组相比，模型组大鼠在心肌缺血再灌注后SOD和GSH-PX活性显著降低；与模型组比较，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组大鼠的SOD和GSH-PX活性明显升高（P<0.05），并且随着浓度的增加，抑制下降的作用越明显，差异有统计学意义（表 4）。
表4
各组大鼠SOD、GSH-PX活性变化情况（2.3 大鼠心肌梗死面积的变化情况
与模型组比较，各给药组均能减小心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌缺血梗死范围，减小心肌梗塞面积，而且随着浓度的进一步增加，效果继续增强，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸组对大鼠心肌梗塞面积的减少的差异有统计学意义（P<0.05），结果见表 5。
表5
对大鼠心肌梗死面积的影响（2.4 Western Blot检测结果
缺血再灌注3 h后，取240 mg/kg心肌缺血-再灌注（OAA）预处理后心肌组织，进行western blot检测。结果显示：与模型组相比，OAA组心肌细胞中总Nrf2表达和细胞核蛋白中Nrf2表达明显升高（P<0.001）；OAA组心肌组织中的HO-1蛋白水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.001）；而Keap1作为Nrf2的特异性的抑制蛋白，在OAA预处理模型心肌中，表达下调，差异有统计学意义（P<0.001），结果见图 1。
图1
Western Blot检测心肌组织蛋白的表达
注：与模型组比较，***
3 讨论
当心肌发生缺血时，心脏组织中的氧和营养的需求下降，血液供应也受到严重的削弱[1]，长时间的心肌缺血后，重新恢复心肌组织的血流供应不但不能缓解原发性损伤，反而加重心肌损伤，最终导致患者心肌结构和功能发生变化[6]。然而，无论缺血再灌注损伤结果如何，提前使用合理药物干预有助于减少缺血再灌注后心肌的损伤程度，促进术后恢复。
在本实验中，我们通过建立大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型，揭示草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护性作用以及可能的作用机制。我们的研究结果提示，心肌缺血再灌注损伤可导致心肌细胞损伤、坏死，最终导致心肌梗死以及心脏功能障碍甚至丧失。而给予草酰乙酸预处理后可明显提高缺血再灌注损伤后心脏的收缩功能（+dp/dtmax）、舒张功能（-dp/dtmax）、左室收缩压（LVSP），降低左室舒张压（LVEDP），能减少心肌梗死面积，促进心脏功能恢复，并降低血清中肌钙蛋白及乳酸脱氢酶的含量。同时，实验结果显示，草酰乙酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用具有高度的药物浓度依赖性。
现在普遍认为，心肌缺血再灌注损伤过程的特征是炎性病变、氧化损伤和细胞凋亡等。更重要的是这些因素之间的相互协同作用，比较公认的是心肌缺血再灌注时产生的活性氧（ROS）所导致的氧化应激，在缺血的发展起着决定性作用[9-10]。通常机体内抗氧化能力与自由基的产生保持动态均衡，然而当自由基的产生超过机体自身的抗氧化能力负荷时，则会发生氧化应激及相关的损伤[11]。体内有一系列抗氧化酶是负责清除体内过量的ROS。这些抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等协同作用在各种应激条件下（包括心肌缺血再灌注损伤）为机体提供了一道对抗氧化应激的坚固防线[12]。因此，那些能够增强抗氧化酶的活性或者能够上调那些抗氧化酶表达的药物是抑制缺血再灌注引起的组织损伤的一个潜在的治疗靶点，具有非常广阔的临床应用前景。本实验中，草酰乙酸能够显著增加SOD、GSH-Px的含量，提示草酰乙酸的应用能够在抗氧化应激层面起到心肌保护作用。
Nrf2是一种转录因子，能调节抗氧化应激相关的很多种基因的表达，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等[13]。研究显示，敲除Nrf2基因的小鼠受到外界的氧化刺激后，ROS较野生小鼠明显增多[14]。莱菔硫烷、硫化氢、黄岑素、延胡索酸[15-18]等物质通过激活Nrf2并促进其转入细胞核内，促进下游抗氧化酶的表达而保护心肌细胞。本实验中，测定心肌组织中总的Nrf2和细胞核内Nrf2含量以及Nrf2下游HO-1的表达。在经过草酰乙酸预处理的缺血再灌注的心肌组织中我们发现细胞总的Nrf2的表达和细胞核内Nrf2含量显着增强，下游的HO-1表达明显上调。因此，草酰乙酸通过上调Nrf2的表达以及增强Nrf2的细胞核转移，增强下游抗氧化基因的表达，减少氧化应激导致的心肌损伤。
Keap1是一种胞浆蛋白，富含半胱氨酸残基，常态下Keap1在胞质中与Nrf2组成复合物，使得胞质内的Nrf2持续通过泛素化途径被蛋白降解，抑制Nrf2从胞质转移到核内[19]。当机体或细胞受到外界氧化刺激时，Keap1从Kaep1-Nrf2复合物中解离，解离后的Nrf2的活性增加，有转录活性的Nrf2累积后易位到细胞核内，启动Nrf2下游抗氧化基因如血红素加氧酶（HO-1）等的表达，抑制氧化应激损伤[20]。到目前为止，药物通过增加Nrf2的核转移途径保护心肌的研究很多，但是心肌保护药物是否通过抑制Keap1的表达，减少Nrf2降解，促进其转移进入细胞核，启动抗氧化基因的表达的研究报道目前为止还很少。因此，草酰乙酸预处理是否抑制Keap1的表达很值得探索，与对照组相比，在经过草酰乙酸预处理的缺血再灌注的心肌组织中Keap1的表达是显著减弱的。
综上所述，本实验揭示草酰乙酸预处理可减少缺血再灌注损伤后大鼠心肌梗死面积，减少心肌细胞的损伤，抗氧化损伤机制发挥重要作用，它能下调Keap1的表达，增强Nrf2的表达和核转移，增加下游抗氧化蛋白的表达。然而，草酰乙酸是通过抑制Keap1,减少Nrf2的降解，还是除此之外具有直接上调Nrf2的表达的作用，还需要进一步通过实验去探索。本实验不仅证实草酰乙酸具有可靠的心肌保护作用，更重要的是提示人体的内源性小分子本身也具有很好的保护心肌的作用，且内源性的小分子的安全性高，具有很广阔的研究及临床应用前景。
