引用本文： 马义祥, 穆军升, 张健群, 伯平. 维生素C促进胚胎干细胞与P(3HB-co-4HB)共培养分化生成心肌补片的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(5): 496-500. doi: 10.7507/1007-4848.20160116 复制
心血管疾病发病率逐年提高，已成为目前全球发病率最高的疾病。心肌梗塞可以通过内科介入或者外科搭桥手术进行姑息性的治疗，临床上多数能达到令人满意的效果，但心肌梗死后心肌细胞受到严重损伤，无法恢复。干细胞移植是利用干细胞的定向诱导分化的潜能去取代或弥补受到损害的组织，这被认为是一个很有前景的治疗方法。到目前为止，研究人员已经可以在体外顺利的提取并培养胚胎干细胞。通过悬滴法制备拟胚体（EBs），在定向诱导剂的诱导下可将EBs诱导为心肌细胞[1-3]。在细胞移植过程中缺乏有效的运输载体会导致部分干细胞丢失，同时也会影响干细胞的成活和增殖，因此寻找一种合适的生物材料在减少干细胞的流失的同时不影响干细胞繁殖就显得十分重要[4-6]。三维细胞培养技术（three dimensional cell culture，TDCC）是指将具有三维结构的支架载体与干细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物，三维支架载体是三维细胞培养技术的关键。聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）[P（3HB-co-4HB ）]是一种新型的第3代聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）材料，具有一定的机械强度、良好生物相容性并且是在体内可完全降解的三维高分子材料，因其具有良好的物理性能引起了广泛的关注。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
实验于2014年7月至2015年8月在北京市心肺血管疾病研究所、省部共建心血管重塑重点实验室完成。实验选取了3只清洁级雌性昆明小白鼠，平均体重为37.5 g，购自首都医科大学附属北京安贞医院动物房。小鼠胚胎干细胞购于上海生命科学院R1干细胞株。用到的主要试剂有高糖DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、L谷氨酰胺、白血病抑制因子（LIF，Gibco公司）、明胶（BD Pharmingen）、磷酸盐缓冲液（PBS）、青链霉素（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）等。
1.2 方法
提取和培养小鼠胚胎纤维状细胞（mouse embr-yonic fibrous cell，MEF）：取怀孕12.5～14 d的昆明小白鼠，颈椎脱颈法处死，无菌条件下取出胎鼠，只保留胎鼠的躯干部分，其余部分去除。用眼科剪将其剪成1 mm3以下的碎片，消化离心过滤后搜集滤液，离心去上清液，重悬后铺板培养。当传至第三代时，用丝裂霉素C处理。多余细胞冻存。
小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代：从液氮罐中取出1管ES细胞，水浴锅中1 min内迅速解冻，然后加入到含有ES培养基的离心管中，离心5 min，除去上清液，重悬细胞转移至已经铺好MEF细胞的培养瓶中。第二天换液，以后隔天换液。
悬滴法制备EBs：胰酶消化处于对数成长期的ESCs，离心后重悬，用不含LIF的培养基稀释，悬滴于培养皿的盖子上面，每滴含400个细胞，培养皿中加入PBS，2天后EBs形成。
制作细胞补片及维生素C诱导：消毒处理P（3HB-co-4HB）生物膜，按24孔板的圆孔大小剪出圆形片，培养基浸润后备用。将EBs种植到生物膜表面，每个孔里种植5个拟胚体。实验组用含有维生素C（浓度1×10-4 mol/L）的培养基培养，对照组使用不含维生素C的培养基，两组培养基都不添加LIF因子，每天换液，诱导心肌补片。
免疫荧光染色：在铺有心肌补片的24孔板中，正常换液培养至第13天。多聚甲醛固定细胞后使用PBS冲洗。加入Triton X-100（由PBS配制） 对细胞进行10 min打孔。5%牛血清蛋白（BSA） 封闭30 min后使用PBS冲洗。加入l抗cTnT、α-actin，4℃孵育20 h，PBS冲洗后加入二抗，常温孵育30 min后，PBS冲洗。同时，滴加DAPI染料观察心肌细胞核的形态。加入20 μl封片剂封片后，共聚焦显微镜下读片。
扫描电镜观察心肌补片：心肌补片标本用去离子水进行洗涤后经戊二醛固定，4 ℃下保存。补片经冷冻、干燥脱水后，使用金属镀膜法制成扫描电镜标本，上机观察拍照记录。
诱导分化效率曲线绘制：从EB与补片共培养第7天开始，隔天观察并统计添加诱导剂组和不添加诱导组各15个心肌补片上的心肌细胞，用心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白标记心肌细胞，DAPI荧光染色标记存活细胞，每3个心肌补片为一组，一组15个拟胚体，计算诱导分化效率，绘制分化效率随诱导时间的分布图。
1.3 统计学分析
使用SPSS20.0软件进行统计分析，正态分布的计量使用均数±标准差（
2 结果
2.1 光学显微镜下的MEF和ESCs
在光学显微镜下观察，MEF细胞贴壁生长，以长梭形为主，也有少部分为多边形或呈现不规则形状。细胞大小不均，中间有卵圆形核。MEF细胞生长迅速，细胞生长每隔3～4 d就接近汇合（图 1a）。ESCs排列紧密呈集落状生长，细胞和周围存在明显界限，细胞核较大，表面有折光较强的脂状小滴。ESCs每隔5天传代一次（图 1b）。
图1
MEF、ESCs在光学显微镜镜下的形态
注：a为MEF；b为ESCs
2.2 免疫荧光学显微镜观察心肌补片
维生素C诱导EB 13 d后，对EB进行心肌特异性标志物cTnT、α-actin的免疫荧光染色，可以看到EB的cTnT和α-actin染色都呈阳性。经共聚焦显微镜观察cTnT的免疫荧光染色为红色，α-actin的免疫荧光染色为绿色（图 2）。
图2
光学显微镜镜下心肌补片的荧光染色 ×100
注：a为cTnT染色；b为α-actin染色
2.3 扫描电镜观察心肌补片
电镜下观察空白P（3HB-co-4HB）的材料形态（图 3a）。高倍数下观察可见心肌补片形态，膜的纤维细丝环绕在心肌样细胞的周围，拟胚体与P（3HB-co-4HB）共培养形成心肌补片（图 3b）。
图3
心肌补片的扫描电镜下形态 ×1000
注：a为电镜下空白生物膜的观察图；b为高倍数下观察图
2.4 分化效率随诱导时间的分布图
两组之间进行比较，显示添加维生素C组的诱导分化效率明显高于不添加维生素C组，差异有统计学意义（P < 0.05，图 4）。
图4
两组分化效率随诱导时间的分布图
3 讨论
随着细胞学和组织工程学研究的深入，干细胞移植技术逐渐成为治疗心血管疾病的热点[7-9]。ESCs具有很高的向心肌细胞分化的倾向[10]，人和小鼠的基因水平高度同源[11]，干细胞诱导分化为心肌细胞应用于临床之前，小鼠是最常用的实验移植宿主。将ESCs移植到梗死的心肌表面需要有合适的补片材料作为载体。
三维补片材料需要有以下特点：首先，孔内部是连通的且间隙合适，这样才能使得细胞与细胞之间信号传输、养料和氧气的输送更为便捷，使细胞更易生长增殖；材料可在体内降解且细胞相容性好[12]；材料可承受一定压力，有助于组织的修复等[13]。P（3HB-co-4HB）的生物相容性及降解吸收等物理特性比聚-β-羟丁酸（polyhydroxybutyrate,PHB）更优越[14-15]。有报道表明P（3HB-co-4HB）可作为医学生物材料应用于临床治疗疾病[16]。但是P（3HB-co-4HB）作为ES细胞的补片材料应用于干细胞移植治疗尚缺乏研究，普通的二维培养模式下维生素C可显著提高ESCs诱导分化为心肌细胞的效率[17]，但是在胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养中维生素C是否还能促进胚胎干细胞诱导分化还没有得到证实。本研究通过对比添加和不添加维生素C作为诱导因子的条件下，将ESCs与P（3HB-co-4HB）三维生物补片材料共同培养，观察心肌细胞在三维生物膜上的生长、增殖及诱导分化。分析并计算两组的诱导分化效率曲线，得到维生素C是否在胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养时能促进分化为心肌补片。从而在寻找到一种干细胞治疗心肌梗死的心肌补片支架材料的同时证明了维生素C可以促进胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。
本文中，对比研究添加和不添加维生素C作为诱导因子，诱导小鼠ES细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。本组实验结果中cTnT、α-actin免疫荧光染色阳性，表明ES拟胚体细胞在支架上成功诱导为心肌细胞。利用扫描电镜观察心肌补片，可看到纤维细丝穿过或包绕心肌样细胞，诱导成功的心肌细胞在三维支架上生长形成心肌补片。对比观察两组试验结果可知两组分化效率都随着诱导时间在增高，添加维生素C组比不添加维生素C组明显增高了诱导分化率，两者差异有统计学意义（P < 0.05）。本实验表明P（3HB-co-4HB）对ESCs无明显的损害，ESCs能在三维膜上生长并诱导分化形成心肌补片。因此，P（3HB-co-4HB)有希望成为干细胞移植治疗心肌梗死的补片材料之一。添加维生素C作为诱导剂可以促进胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。
此外，本研究尚存在不足之处：（1）需进一步确定P（3HB-co-4HB）降解吸收后对机体的影响以及补片材料的植入对生物免疫系统是否有伤害。（2）并不是所有的拟胚体都能诱导分化为心肌细胞，分化的纯度不够高、杂细胞较多，诱导技术还有待改良。（3）心肌补片种植后的具体疗效还有待行动物实验来证明。
心血管疾病发病率逐年提高，已成为目前全球发病率最高的疾病。心肌梗塞可以通过内科介入或者外科搭桥手术进行姑息性的治疗，临床上多数能达到令人满意的效果，但心肌梗死后心肌细胞受到严重损伤，无法恢复。干细胞移植是利用干细胞的定向诱导分化的潜能去取代或弥补受到损害的组织，这被认为是一个很有前景的治疗方法。到目前为止，研究人员已经可以在体外顺利的提取并培养胚胎干细胞。通过悬滴法制备拟胚体（EBs），在定向诱导剂的诱导下可将EBs诱导为心肌细胞[1-3]。在细胞移植过程中缺乏有效的运输载体会导致部分干细胞丢失，同时也会影响干细胞的成活和增殖，因此寻找一种合适的生物材料在减少干细胞的流失的同时不影响干细胞繁殖就显得十分重要[4-6]。三维细胞培养技术（three dimensional cell culture，TDCC）是指将具有三维结构的支架载体与干细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物，三维支架载体是三维细胞培养技术的关键。聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）[P（3HB-co-4HB ）]是一种新型的第3代聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）材料，具有一定的机械强度、良好生物相容性并且是在体内可完全降解的三维高分子材料，因其具有良好的物理性能引起了广泛的关注。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
实验于2014年7月至2015年8月在北京市心肺血管疾病研究所、省部共建心血管重塑重点实验室完成。实验选取了3只清洁级雌性昆明小白鼠，平均体重为37.5 g，购自首都医科大学附属北京安贞医院动物房。小鼠胚胎干细胞购于上海生命科学院R1干细胞株。用到的主要试剂有高糖DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、L谷氨酰胺、白血病抑制因子（LIF，Gibco公司）、明胶（BD Pharmingen）、磷酸盐缓冲液（PBS）、青链霉素（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）等。
1.2 方法
提取和培养小鼠胚胎纤维状细胞（mouse embr-yonic fibrous cell，MEF）：取怀孕12.5～14 d的昆明小白鼠，颈椎脱颈法处死，无菌条件下取出胎鼠，只保留胎鼠的躯干部分，其余部分去除。用眼科剪将其剪成1 mm3以下的碎片，消化离心过滤后搜集滤液，离心去上清液，重悬后铺板培养。当传至第三代时，用丝裂霉素C处理。多余细胞冻存。
小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代：从液氮罐中取出1管ES细胞，水浴锅中1 min内迅速解冻，然后加入到含有ES培养基的离心管中，离心5 min，除去上清液，重悬细胞转移至已经铺好MEF细胞的培养瓶中。第二天换液，以后隔天换液。
悬滴法制备EBs：胰酶消化处于对数成长期的ESCs，离心后重悬，用不含LIF的培养基稀释，悬滴于培养皿的盖子上面，每滴含400个细胞，培养皿中加入PBS，2天后EBs形成。
制作细胞补片及维生素C诱导：消毒处理P（3HB-co-4HB）生物膜，按24孔板的圆孔大小剪出圆形片，培养基浸润后备用。将EBs种植到生物膜表面，每个孔里种植5个拟胚体。实验组用含有维生素C（浓度1×10-4 mol/L）的培养基培养，对照组使用不含维生素C的培养基，两组培养基都不添加LIF因子，每天换液，诱导心肌补片。
免疫荧光染色：在铺有心肌补片的24孔板中，正常换液培养至第13天。多聚甲醛固定细胞后使用PBS冲洗。加入Triton X-100（由PBS配制） 对细胞进行10 min打孔。5%牛血清蛋白（BSA） 封闭30 min后使用PBS冲洗。加入l抗cTnT、α-actin，4℃孵育20 h，PBS冲洗后加入二抗，常温孵育30 min后，PBS冲洗。同时，滴加DAPI染料观察心肌细胞核的形态。加入20 μl封片剂封片后，共聚焦显微镜下读片。
扫描电镜观察心肌补片：心肌补片标本用去离子水进行洗涤后经戊二醛固定，4 ℃下保存。补片经冷冻、干燥脱水后，使用金属镀膜法制成扫描电镜标本，上机观察拍照记录。
诱导分化效率曲线绘制：从EB与补片共培养第7天开始，隔天观察并统计添加诱导剂组和不添加诱导组各15个心肌补片上的心肌细胞，用心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白标记心肌细胞，DAPI荧光染色标记存活细胞，每3个心肌补片为一组，一组15个拟胚体，计算诱导分化效率，绘制分化效率随诱导时间的分布图。
1.3 统计学分析
使用SPSS20.0软件进行统计分析，正态分布的计量使用均数±标准差（
2 结果
2.1 光学显微镜下的MEF和ESCs
在光学显微镜下观察，MEF细胞贴壁生长，以长梭形为主，也有少部分为多边形或呈现不规则形状。细胞大小不均，中间有卵圆形核。MEF细胞生长迅速，细胞生长每隔3～4 d就接近汇合（图 1a）。ESCs排列紧密呈集落状生长，细胞和周围存在明显界限，细胞核较大，表面有折光较强的脂状小滴。ESCs每隔5天传代一次（图 1b）。
图1
MEF、ESCs在光学显微镜镜下的形态
注：a为MEF；b为ESCs
2.2 免疫荧光学显微镜观察心肌补片
维生素C诱导EB 13 d后，对EB进行心肌特异性标志物cTnT、α-actin的免疫荧光染色，可以看到EB的cTnT和α-actin染色都呈阳性。经共聚焦显微镜观察cTnT的免疫荧光染色为红色，α-actin的免疫荧光染色为绿色（图 2）。
图2
光学显微镜镜下心肌补片的荧光染色 ×100
注：a为cTnT染色；b为α-actin染色
2.3 扫描电镜观察心肌补片
电镜下观察空白P（3HB-co-4HB）的材料形态（图 3a）。高倍数下观察可见心肌补片形态，膜的纤维细丝环绕在心肌样细胞的周围，拟胚体与P（3HB-co-4HB）共培养形成心肌补片（图 3b）。
图3
心肌补片的扫描电镜下形态 ×1000
注：a为电镜下空白生物膜的观察图；b为高倍数下观察图
2.4 分化效率随诱导时间的分布图
两组之间进行比较，显示添加维生素C组的诱导分化效率明显高于不添加维生素C组，差异有统计学意义（P < 0.05，图 4）。
图4
两组分化效率随诱导时间的分布图
3 讨论
随着细胞学和组织工程学研究的深入，干细胞移植技术逐渐成为治疗心血管疾病的热点[7-9]。ESCs具有很高的向心肌细胞分化的倾向[10]，人和小鼠的基因水平高度同源[11]，干细胞诱导分化为心肌细胞应用于临床之前，小鼠是最常用的实验移植宿主。将ESCs移植到梗死的心肌表面需要有合适的补片材料作为载体。
三维补片材料需要有以下特点：首先，孔内部是连通的且间隙合适，这样才能使得细胞与细胞之间信号传输、养料和氧气的输送更为便捷，使细胞更易生长增殖；材料可在体内降解且细胞相容性好[12]；材料可承受一定压力，有助于组织的修复等[13]。P（3HB-co-4HB）的生物相容性及降解吸收等物理特性比聚-β-羟丁酸（polyhydroxybutyrate,PHB）更优越[14-15]。有报道表明P（3HB-co-4HB）可作为医学生物材料应用于临床治疗疾病[16]。但是P（3HB-co-4HB）作为ES细胞的补片材料应用于干细胞移植治疗尚缺乏研究，普通的二维培养模式下维生素C可显著提高ESCs诱导分化为心肌细胞的效率[17]，但是在胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养中维生素C是否还能促进胚胎干细胞诱导分化还没有得到证实。本研究通过对比添加和不添加维生素C作为诱导因子的条件下，将ESCs与P（3HB-co-4HB）三维生物补片材料共同培养，观察心肌细胞在三维生物膜上的生长、增殖及诱导分化。分析并计算两组的诱导分化效率曲线，得到维生素C是否在胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养时能促进分化为心肌补片。从而在寻找到一种干细胞治疗心肌梗死的心肌补片支架材料的同时证明了维生素C可以促进胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。
本文中，对比研究添加和不添加维生素C作为诱导因子，诱导小鼠ES细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。本组实验结果中cTnT、α-actin免疫荧光染色阳性，表明ES拟胚体细胞在支架上成功诱导为心肌细胞。利用扫描电镜观察心肌补片，可看到纤维细丝穿过或包绕心肌样细胞，诱导成功的心肌细胞在三维支架上生长形成心肌补片。对比观察两组试验结果可知两组分化效率都随着诱导时间在增高，添加维生素C组比不添加维生素C组明显增高了诱导分化率，两者差异有统计学意义（P < 0.05）。本实验表明P（3HB-co-4HB）对ESCs无明显的损害，ESCs能在三维膜上生长并诱导分化形成心肌补片。因此，P（3HB-co-4HB)有希望成为干细胞移植治疗心肌梗死的补片材料之一。添加维生素C作为诱导剂可以促进胚胎干细胞与P（3HB-co-4HB）共培养分化成心肌补片。
此外，本研究尚存在不足之处：（1）需进一步确定P（3HB-co-4HB）降解吸收后对机体的影响以及补片材料的植入对生物免疫系统是否有伤害。（2）并不是所有的拟胚体都能诱导分化为心肌细胞，分化的纯度不够高、杂细胞较多，诱导技术还有待改良。（3）心肌补片种植后的具体疗效还有待行动物实验来证明。
