引用本文： 许士俊, 穆军升, 张健群, 伯平. 小分子化合物XAV939诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(7): 714-718. doi: 10.7507/1007-4848.20160171 复制
心肌梗死是心血管疾病中发病率高、凶险程度高、近远期死亡率高、预后不良的疾病。成熟哺乳动物的心脏细胞为永久细胞，一旦发生损伤便无法再生修复。心脏移植仍是目前治疗心肌梗死后心力衰竭惟一有效的手段，其供体短缺是一个目前尚需解决的难题，因此，在临床上需要更好的治疗手段。针对这个问题，科学家们提出用新生的心肌细胞替代已经损伤坏死的细胞来治疗梗死后心力衰竭。胚胎干细胞（ESC）具有自主复制、全能分化能力，在体外可分化为三胚层各类型细胞，是最有前景、最具发育潜能性的的种子细胞之一。目前，体外分离和培养胚胎干细胞的实验方法已经非常成熟，并可以被大量的培养和分裂增殖以及定向分化为心肌细胞[1-2]。大量的实验证明，将体外由胚胎干细胞诱导分化而来的心肌细胞植入大鼠和猪的心肌梗死模型中，能够形成有功能的心肌组织，提高局部和整体的心功能[3-4]。但是，胚胎干细胞在体外自然分化为心肌细胞的效率很低，因此，寻找一种高效、低廉、安全的诱导方法具有重要意义。目前，运用较多的化学诱导剂如二甲基亚砜、5-氮胞苷等，虽能明显提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率，但因有一定的毒性，从而限制了这些诱导剂在临床上的应用。本文中，我们采用一种小分子化合物XAV939作为诱导剂，探讨XAV939对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的影响，以期建立一种新的、高效的体外诱导ES细胞分化为心肌细胞的实验方法，为将来细胞移植治疗缺血性心脏病打下基础。
1 材料与方法
1.1 细胞来源、主要试剂和仪器
本研究中所用小鼠胚胎干细胞（mESC）来自于中国科学院动物研究所。本研究中使用的主要试剂包括高糖DMEM（Gibco）、1%的非必需氨基酸（Gibco）、L-谷氨酰胺（Gibco）、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇（Gibco）、青链霉素（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）、5%血清替代品（SR，Gibco）、磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco）、0.05%胰酶（Gibco）、明胶、干细胞胎牛血清（FBS，Gibco）。本研究中使用的主要仪器包括高速控温离心机（Thermo）、液氮罐（Thermofisher）、电动移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1）、CO2培养箱（Thermo，HERA cell 150i）、冻存管（NUNC）、50 ml/15 ml 离心管（NUNC）、6 cm/10 cm 细胞培养皿（NUNC）、6孔板/24孔板/96孔板细胞培养皿（NUNC）、超净台、显微镜、水浴锅。
1.2 实验方法
1.2.1 制备小鼠胚胎干细胞饲养层
将孕期13.5 d的昆明白鼠拉颈处死，浸泡酒精，无菌条件下去除子宫，用PBS充分洗涤，尽量将血迹洗干净。然后剪开子宫和胎膜，取出胚胎后将其头部和内脏去除，PBS清洗一遍，用细剪刀将其剪成1 mm3以下的碎块，滤过滤网，将滤过液吸于离心管中静置5～10 min，吸去上清，加入1 ml含0.25%胰酶+0.04% EDTA溶液，轻轻吹吸，消化2 min，加入等体积的MEF培养液（含10%胎牛血清的高糖DMEM）终止消化，吹吸后放入高速温控离心机中，800 r，离心5 min，吸弃上清，放在血球计数板上计数，调整浓度后以5×105/ml 重悬于MEF生长培养基上，37℃、5%的细胞培养箱中培养至90%的融合度后传代，当传至第三代时，用10 μg/ml的丝裂霉素C处理2.5 h，吸去培养基，PBS将残余培基及死细胞洗净，适量胰酶消化，800 r离心4 min，收集细胞后重悬于培养基中，计数后以5×104/ml 接种于0.1%明胶包被的100 mm培养皿中。多余的细胞冻存备用。
1.2.2 小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代
从液氮罐中取出一支冻存的小鼠胚胎干细胞，浸入37℃的水浴锅中快速解冻，加入到50 ml离心管中800 r离心4饲养层，吸弃冻存液，2 ml干细胞培养基（高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇、10%的干细胞胎牛血清、1000 U/ml LIF）重悬细胞后接种于预先处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，37℃、5%的细胞培养箱中培养，隔天更换培养基。当细胞团过大或者较密时胰酶消化传代，差速贴壁法去除MEF，接种于新准备的MEF饲养层上，继续培养。
1.2.3 EBs的制备
取生长良好还未分化的mES细胞，胰酶消化后，离心后重悬细胞，计数后用干细胞分化培养基（5%的血清替代物、5%的干细胞胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇）重悬细胞，稀释至2.5×104个/ml，以20 μl为1滴，每滴含有500个细胞，悬滴于100 mm培养皿盖上，每个皿50个，皿中加10 ml盐酸盐缓冲液（PBS）保持细胞培养皿湿润（d0），培养3 d后形成球形拟胚体（d3），将形成的拟胚体吸出，种植于预先用0.1%明胶处理过的附有盖玻片的24孔板中，每个孔2个EBs，分为两组，一组加入小分子化合物XAV939（1 μM），在第五天换为不加任何诱导剂的分化培养基培养。另一组不加任何诱导剂进行分化培养。两组在第五天后隔天更换培养基，每天观察细胞的生长分化情况。
1.2.4 使用光学显微镜进行观察
自拟胚体贴壁诱导分化后，每天在光学显微镜下观察拟胚体的分化状态及形态变化，记录拟胚体出现自主跳动时的最初时间和数量，对出现跳动的区域进行显微录像，记录跳动的频率和节律并根据出现跳动心肌细胞的拟胚体数量与总的拟胚体数的比率计算诱导效率。
1.2.5 激光共聚焦显微镜
拟胚体贴壁诱导分化21 d后，对小鼠胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞进行免疫荧光染色鉴定。将培养基吸出，用PBS洗涤3遍，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，吸弃，PBS洗3遍，每次洗5 min（用摇床）。用0.1% tritonX-100（PBS配置）处理细胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。吸弃后，用5%的牛血清蛋白（BSA）封闭处理30 min，PBS洗2遍。加入兔抗小鼠一抗心肌肌钙蛋白T （cTnT，1: 200，PBS稀释），4℃过夜，PBS洗3遍，每次5 min。加入山羊抗兔荧光二抗，室温避光放置1 h，PBS洗3遍，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室温染45 min，PBS洗4遍，每次5 min。加入封片剂封片，指甲油固定，在激光共聚焦显微镜下观察读片。
2 结果
2.1 光学显微镜观察结果
小鼠胚胎干细胞呈克隆状生长，形似圆形或椭圆、立体感强、未分化时边缘整齐、细胞排列紧密、界限与形态难以分清、克隆结构均匀、边缘光滑且有折光性，呈未分化状态，见图 1。mESC生长非常迅速，3 d即可传代，传代后生长更快。待克隆长大后，胰酶消化，计数后重悬细胞，悬滴3 d形成拟胚体，拟胚体是由分化细胞和未分化细胞组成的复合体，包含了3个胚层在内的所有组织细胞，拟胚体呈球形，将拟胚体种植于24孔板中进行诱导分化。
图1
光学显微镜下mESC 来源的心肌细胞示意图
注：A：mESC 经悬滴法形成的拟胚体；B：拟胚体出现搏动（搏动部位如黑色箭头所示）
2.2 小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞观察
EBs未贴壁时呈球形或椭圆形，见图 2A，种植后2～3 h后开始贴壁生长，24 h后基本贴壁完成。EBs继续分化，细胞从克隆中央向周围部位爬出，经XAV939诱导，分化8 d后出现自发性搏动，搏动部位见图 2B箭头所示，搏动的频率、节律均不同。这可能和分化的心肌细胞数量存在差异有关。随着分化时间的延长，自发跳动的细胞明显增多，约在分化10～14 d后，大量的EBs出现跳动，随着EBs的进一步分化，心肌细胞逐渐成熟，跳动的细胞及频率也随之降低，跳动频率大部分集中在70～90次/分之间。
图2
光学显微镜下mESC 来源的心肌细胞示意图
注：A：mESC 经悬滴法形成的拟胚体；B：拟胚体出现搏动（搏动部位如黑色箭头所示）
2.3 心肌细胞的鉴定
在小鼠胚胎干细胞诱导分化21 d后，对其形成的搏动部位进行心肌特异性标志物cTnT免疫荧光染色。蛋白发出红色荧光，位于细胞质中，细胞核被DAPI标记呈蓝色荧光，见图 3。
图3
激光共聚焦显微镜下心肌细胞染色示意图
注：A：心肌细胞特异性标志物cTnT 表达阳性，呈红色荧光；B：细胞核被DAPI 染为蓝色；C：A 和B 图的融合，可见蛋白存在与细胞之中，包绕细胞核
2.4 加诱导剂与未加诱导剂的拟胚体分化效率和频率分布
从拟胚体贴壁分化开始，每天显微镜下观察和记录克隆跳动的情况以及跳动的频率，根据统计数据进行绘图。加诱导剂的拟胚体在诱导分化第8 d就出现自发性搏动，而未加任何诱导剂的在拟胚体诱导分化第10 d才有部分拟胚体出现搏动。在第3～5 d加入小分子化合物XAV939对小鼠胚胎干细胞定向向心肌细胞诱导分化时，约有72.9%(效率最高的一组)的拟胚体出现自发搏动，而未添加任何诱导剂组仅有8.3%的EBs出现搏动的心肌合胞体。使用诱导剂的拟胚体分化跳动频率、分化效率以及不同诱导时间点对应跳动拟胚体数分布见图 4、图 5。分化第10～15 d是出现跳动拟胚体数最多的阶段，跳动克隆的频率分布集中在70～90（81.5±3.5）次/分，诱导效率平均为71.85%±1.05%。
图4
使用诱导剂拟胚体跳动频率分布图
图5
使用诱导剂拟胚体不同诱导时间点对应跳动拟胚体数的分布图
3 讨论
心肌梗死是心血管系统疾病中发病率最高、最为凶险的一种，严重威胁着人类的健康。心肌细胞作为永久细胞，一旦缺血坏死便不可再生，只能由成纤维细胞修复、替代。尽管在药物、介入和外科治疗心力衰竭方面取得了很大的进步，但是仍然无法从根本上解决问题。心脏移植作为终末期心力衰竭最为有效地治疗手段，但因为供体短缺并不能满足临床上的需要。鉴于此，科学家一直致力于研究用心肌再生的手段来治疗终末期心力衰竭[5]。目前，干细胞治疗心肌梗死成为研究的热点和焦点[6]。近年来，随着生物技术的发展，细胞治疗在基础研究领域取得了飞速发展，干细胞治疗心脏病获得了令人震惊的效果，展示了广阔的临床前景。细胞治疗是利用活组织重建和更新病变及老化的组织，其具体机制仍然未知，临床应用的安全性和有效性是目前研究者关注和争论的焦点[7]。
胚胎干细胞来自早期胚胎囊的内细胞团，具有自主复制、全能分化的特点，并能在保持未分化状态下无限增值，可以分化为三个胚层所有类型细胞，包扩心房肌、心室肌、房室结、浦肯野细胞和窦房结样细胞等多种心肌细胞[8]。体外培养条件下，干细胞可以自然分化为心肌细胞，但是效率不高，研究人员一直在寻找一种高效、低价和安全的诱导方法，包括各种蛋白、RNA和小分子化合物，由于化学诱导剂耗费低，浓度易于控制，分子量小，容易突破细胞膜而成为了最为常用的方法，研究比较多的有二甲基亚砜、5-氮胞苷等[9-10]，但是由于其本身存在毒性，因此临床上限制了它们的应用。
在本研究中，我们利用干细胞中最具有潜力和研究价值的小鼠胚胎干细胞，利用悬滴法形成拟胚体，并在第3天和第5天加入小分子化合物XAV939，成功的将诱导效率提高到70.8%，并且经过免疫荧光鉴定了心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。在mESC的培养过程中，需要用特殊的干细胞培养基，此外，还需要一种特殊的细胞，将mES细胞铺在上面，这层细胞叫作饲养层细胞，一方面可以模拟体内的生长环境，另一方面可以提供mESC增殖生长需要的细胞因子并且维持其全能性。本实验中我们使用了小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞。
XAV939是Wnt/β-catenin通路的选择性抑制剂。Wnt信号传导通路与基因的表达、细胞的粘附、胚胎的发育等息息相关，分为经典的Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路[11]。经典的Wnt信号通路即Wnt/β-catenin通路，是Wnt信号中研究得最清楚的一条通路，其参与了调控细胞命运、细胞增殖、分化及凋亡等过程。研究证实，Wnt信号通路与胚胎心脏的生长发育关系密切[12]。对于经典Wnt信号转导通路在胚胎心肌细胞分化过程中的作用，目前存在着两种相反的观点。一种观点认为经典Wnt信号通路在胚胎心肌发育中具有抑制作用[13-15]，另一种观点认为经典Wnt信号转到通路在胚胎心肌细胞发育中具有促进作用。对于这样的分歧，目前研究人员有两种解释，一种解释认为在当前的科技水平下，还不能确定某一信号分子在胚胎发育中的作用，在胚胎发育过程中，存在着经典Wnt信号蛋白、非经典Wnt信号蛋白和Wnt信号抑制物，而且它们的表达非常复杂，而现在缺乏一个能够完全模拟所有分子信息的数字模型，因此无法确定某种分子调控心肌分化的功能[16]；另一种解释认为经典Wnt信号转导通路对于胚胎心肌细胞的分化，既有抑制作用，也有促进作用；其依赖于分化时期，分化早期有促进作用，分化晚期有抑制作用[17-18]。目前有很多学者倾向于这种观点，不过还需要更多实验支持[19]。本实验里，我们在小鼠胚胎干细胞分化的过程中，加入XAV939，成功的将小鼠胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞的效率提高到72.9%，显著高于不加诱导剂组（8.3%）。提示在干细胞诱导分化的第3天到第5天，抑制经典的Wnt信号通路，有利于mESC为心肌细胞，为干细胞定向诱导分化为心肌细胞提供了另一高效、安全的方法。小分子化合物XAV939相对其他诱导剂，分子量小易于通过细胞膜进入细胞内部且浓度易于控制，价格低廉、安全有效，因此是一种非常理想的化学诱导剂。
尽管从干细胞到临床的治疗应用还有一段很长的路要走，但是我们有理由相信，通过我们深入的研究，在不久的将来，干细胞治疗心力衰竭将会变为现实。
心肌梗死是心血管疾病中发病率高、凶险程度高、近远期死亡率高、预后不良的疾病。成熟哺乳动物的心脏细胞为永久细胞，一旦发生损伤便无法再生修复。心脏移植仍是目前治疗心肌梗死后心力衰竭惟一有效的手段，其供体短缺是一个目前尚需解决的难题，因此，在临床上需要更好的治疗手段。针对这个问题，科学家们提出用新生的心肌细胞替代已经损伤坏死的细胞来治疗梗死后心力衰竭。胚胎干细胞（ESC）具有自主复制、全能分化能力，在体外可分化为三胚层各类型细胞，是最有前景、最具发育潜能性的的种子细胞之一。目前，体外分离和培养胚胎干细胞的实验方法已经非常成熟，并可以被大量的培养和分裂增殖以及定向分化为心肌细胞[1-2]。大量的实验证明，将体外由胚胎干细胞诱导分化而来的心肌细胞植入大鼠和猪的心肌梗死模型中，能够形成有功能的心肌组织，提高局部和整体的心功能[3-4]。但是，胚胎干细胞在体外自然分化为心肌细胞的效率很低，因此，寻找一种高效、低廉、安全的诱导方法具有重要意义。目前，运用较多的化学诱导剂如二甲基亚砜、5-氮胞苷等，虽能明显提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率，但因有一定的毒性，从而限制了这些诱导剂在临床上的应用。本文中，我们采用一种小分子化合物XAV939作为诱导剂，探讨XAV939对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的影响，以期建立一种新的、高效的体外诱导ES细胞分化为心肌细胞的实验方法，为将来细胞移植治疗缺血性心脏病打下基础。
1 材料与方法
1.1 细胞来源、主要试剂和仪器
本研究中所用小鼠胚胎干细胞（mESC）来自于中国科学院动物研究所。本研究中使用的主要试剂包括高糖DMEM（Gibco）、1%的非必需氨基酸（Gibco）、L-谷氨酰胺（Gibco）、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇（Gibco）、青链霉素（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）、5%血清替代品（SR，Gibco）、磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco）、0.05%胰酶（Gibco）、明胶、干细胞胎牛血清（FBS，Gibco）。本研究中使用的主要仪器包括高速控温离心机（Thermo）、液氮罐（Thermofisher）、电动移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1）、CO2培养箱（Thermo，HERA cell 150i）、冻存管（NUNC）、50 ml/15 ml 离心管（NUNC）、6 cm/10 cm 细胞培养皿（NUNC）、6孔板/24孔板/96孔板细胞培养皿（NUNC）、超净台、显微镜、水浴锅。
1.2 实验方法
1.2.1 制备小鼠胚胎干细胞饲养层
将孕期13.5 d的昆明白鼠拉颈处死，浸泡酒精，无菌条件下去除子宫，用PBS充分洗涤，尽量将血迹洗干净。然后剪开子宫和胎膜，取出胚胎后将其头部和内脏去除，PBS清洗一遍，用细剪刀将其剪成1 mm3以下的碎块，滤过滤网，将滤过液吸于离心管中静置5～10 min，吸去上清，加入1 ml含0.25%胰酶+0.04% EDTA溶液，轻轻吹吸，消化2 min，加入等体积的MEF培养液（含10%胎牛血清的高糖DMEM）终止消化，吹吸后放入高速温控离心机中，800 r，离心5 min，吸弃上清，放在血球计数板上计数，调整浓度后以5×105/ml 重悬于MEF生长培养基上，37℃、5%的细胞培养箱中培养至90%的融合度后传代，当传至第三代时，用10 μg/ml的丝裂霉素C处理2.5 h，吸去培养基，PBS将残余培基及死细胞洗净，适量胰酶消化，800 r离心4 min，收集细胞后重悬于培养基中，计数后以5×104/ml 接种于0.1%明胶包被的100 mm培养皿中。多余的细胞冻存备用。
1.2.2 小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代
从液氮罐中取出一支冻存的小鼠胚胎干细胞，浸入37℃的水浴锅中快速解冻，加入到50 ml离心管中800 r离心4饲养层，吸弃冻存液，2 ml干细胞培养基（高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇、10%的干细胞胎牛血清、1000 U/ml LIF）重悬细胞后接种于预先处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，37℃、5%的细胞培养箱中培养，隔天更换培养基。当细胞团过大或者较密时胰酶消化传代，差速贴壁法去除MEF，接种于新准备的MEF饲养层上，继续培养。
1.2.3 EBs的制备
取生长良好还未分化的mES细胞，胰酶消化后，离心后重悬细胞，计数后用干细胞分化培养基（5%的血清替代物、5%的干细胞胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇）重悬细胞，稀释至2.5×104个/ml，以20 μl为1滴，每滴含有500个细胞，悬滴于100 mm培养皿盖上，每个皿50个，皿中加10 ml盐酸盐缓冲液（PBS）保持细胞培养皿湿润（d0），培养3 d后形成球形拟胚体（d3），将形成的拟胚体吸出，种植于预先用0.1%明胶处理过的附有盖玻片的24孔板中，每个孔2个EBs，分为两组，一组加入小分子化合物XAV939（1 μM），在第五天换为不加任何诱导剂的分化培养基培养。另一组不加任何诱导剂进行分化培养。两组在第五天后隔天更换培养基，每天观察细胞的生长分化情况。
1.2.4 使用光学显微镜进行观察
自拟胚体贴壁诱导分化后，每天在光学显微镜下观察拟胚体的分化状态及形态变化，记录拟胚体出现自主跳动时的最初时间和数量，对出现跳动的区域进行显微录像，记录跳动的频率和节律并根据出现跳动心肌细胞的拟胚体数量与总的拟胚体数的比率计算诱导效率。
1.2.5 激光共聚焦显微镜
拟胚体贴壁诱导分化21 d后，对小鼠胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞进行免疫荧光染色鉴定。将培养基吸出，用PBS洗涤3遍，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，吸弃，PBS洗3遍，每次洗5 min（用摇床）。用0.1% tritonX-100（PBS配置）处理细胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。吸弃后，用5%的牛血清蛋白（BSA）封闭处理30 min，PBS洗2遍。加入兔抗小鼠一抗心肌肌钙蛋白T （cTnT，1: 200，PBS稀释），4℃过夜，PBS洗3遍，每次5 min。加入山羊抗兔荧光二抗，室温避光放置1 h，PBS洗3遍，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室温染45 min，PBS洗4遍，每次5 min。加入封片剂封片，指甲油固定，在激光共聚焦显微镜下观察读片。
2 结果
2.1 光学显微镜观察结果
小鼠胚胎干细胞呈克隆状生长，形似圆形或椭圆、立体感强、未分化时边缘整齐、细胞排列紧密、界限与形态难以分清、克隆结构均匀、边缘光滑且有折光性，呈未分化状态，见图 1。mESC生长非常迅速，3 d即可传代，传代后生长更快。待克隆长大后，胰酶消化，计数后重悬细胞，悬滴3 d形成拟胚体，拟胚体是由分化细胞和未分化细胞组成的复合体，包含了3个胚层在内的所有组织细胞，拟胚体呈球形，将拟胚体种植于24孔板中进行诱导分化。
图1
光学显微镜下mESC 来源的心肌细胞示意图
注：A：mESC 经悬滴法形成的拟胚体；B：拟胚体出现搏动（搏动部位如黑色箭头所示）
2.2 小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞观察
EBs未贴壁时呈球形或椭圆形，见图 2A，种植后2～3 h后开始贴壁生长，24 h后基本贴壁完成。EBs继续分化，细胞从克隆中央向周围部位爬出，经XAV939诱导，分化8 d后出现自发性搏动，搏动部位见图 2B箭头所示，搏动的频率、节律均不同。这可能和分化的心肌细胞数量存在差异有关。随着分化时间的延长，自发跳动的细胞明显增多，约在分化10～14 d后，大量的EBs出现跳动，随着EBs的进一步分化，心肌细胞逐渐成熟，跳动的细胞及频率也随之降低，跳动频率大部分集中在70～90次/分之间。
图2
光学显微镜下mESC 来源的心肌细胞示意图
注：A：mESC 经悬滴法形成的拟胚体；B：拟胚体出现搏动（搏动部位如黑色箭头所示）
2.3 心肌细胞的鉴定
在小鼠胚胎干细胞诱导分化21 d后，对其形成的搏动部位进行心肌特异性标志物cTnT免疫荧光染色。蛋白发出红色荧光，位于细胞质中，细胞核被DAPI标记呈蓝色荧光，见图 3。
图3
激光共聚焦显微镜下心肌细胞染色示意图
注：A：心肌细胞特异性标志物cTnT 表达阳性，呈红色荧光；B：细胞核被DAPI 染为蓝色；C：A 和B 图的融合，可见蛋白存在与细胞之中，包绕细胞核
2.4 加诱导剂与未加诱导剂的拟胚体分化效率和频率分布
从拟胚体贴壁分化开始，每天显微镜下观察和记录克隆跳动的情况以及跳动的频率，根据统计数据进行绘图。加诱导剂的拟胚体在诱导分化第8 d就出现自发性搏动，而未加任何诱导剂的在拟胚体诱导分化第10 d才有部分拟胚体出现搏动。在第3～5 d加入小分子化合物XAV939对小鼠胚胎干细胞定向向心肌细胞诱导分化时，约有72.9%(效率最高的一组)的拟胚体出现自发搏动，而未添加任何诱导剂组仅有8.3%的EBs出现搏动的心肌合胞体。使用诱导剂的拟胚体分化跳动频率、分化效率以及不同诱导时间点对应跳动拟胚体数分布见图 4、图 5。分化第10～15 d是出现跳动拟胚体数最多的阶段，跳动克隆的频率分布集中在70～90（81.5±3.5）次/分，诱导效率平均为71.85%±1.05%。
图4
使用诱导剂拟胚体跳动频率分布图
图5
使用诱导剂拟胚体不同诱导时间点对应跳动拟胚体数的分布图
3 讨论
心肌梗死是心血管系统疾病中发病率最高、最为凶险的一种，严重威胁着人类的健康。心肌细胞作为永久细胞，一旦缺血坏死便不可再生，只能由成纤维细胞修复、替代。尽管在药物、介入和外科治疗心力衰竭方面取得了很大的进步，但是仍然无法从根本上解决问题。心脏移植作为终末期心力衰竭最为有效地治疗手段，但因为供体短缺并不能满足临床上的需要。鉴于此，科学家一直致力于研究用心肌再生的手段来治疗终末期心力衰竭[5]。目前，干细胞治疗心肌梗死成为研究的热点和焦点[6]。近年来，随着生物技术的发展，细胞治疗在基础研究领域取得了飞速发展，干细胞治疗心脏病获得了令人震惊的效果，展示了广阔的临床前景。细胞治疗是利用活组织重建和更新病变及老化的组织，其具体机制仍然未知，临床应用的安全性和有效性是目前研究者关注和争论的焦点[7]。
胚胎干细胞来自早期胚胎囊的内细胞团，具有自主复制、全能分化的特点，并能在保持未分化状态下无限增值，可以分化为三个胚层所有类型细胞，包扩心房肌、心室肌、房室结、浦肯野细胞和窦房结样细胞等多种心肌细胞[8]。体外培养条件下，干细胞可以自然分化为心肌细胞，但是效率不高，研究人员一直在寻找一种高效、低价和安全的诱导方法，包括各种蛋白、RNA和小分子化合物，由于化学诱导剂耗费低，浓度易于控制，分子量小，容易突破细胞膜而成为了最为常用的方法，研究比较多的有二甲基亚砜、5-氮胞苷等[9-10]，但是由于其本身存在毒性，因此临床上限制了它们的应用。
在本研究中，我们利用干细胞中最具有潜力和研究价值的小鼠胚胎干细胞，利用悬滴法形成拟胚体，并在第3天和第5天加入小分子化合物XAV939，成功的将诱导效率提高到70.8%，并且经过免疫荧光鉴定了心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。在mESC的培养过程中，需要用特殊的干细胞培养基，此外，还需要一种特殊的细胞，将mES细胞铺在上面，这层细胞叫作饲养层细胞，一方面可以模拟体内的生长环境，另一方面可以提供mESC增殖生长需要的细胞因子并且维持其全能性。本实验中我们使用了小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞。
XAV939是Wnt/β-catenin通路的选择性抑制剂。Wnt信号传导通路与基因的表达、细胞的粘附、胚胎的发育等息息相关，分为经典的Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路[11]。经典的Wnt信号通路即Wnt/β-catenin通路，是Wnt信号中研究得最清楚的一条通路，其参与了调控细胞命运、细胞增殖、分化及凋亡等过程。研究证实，Wnt信号通路与胚胎心脏的生长发育关系密切[12]。对于经典Wnt信号转导通路在胚胎心肌细胞分化过程中的作用，目前存在着两种相反的观点。一种观点认为经典Wnt信号通路在胚胎心肌发育中具有抑制作用[13-15]，另一种观点认为经典Wnt信号转到通路在胚胎心肌细胞发育中具有促进作用。对于这样的分歧，目前研究人员有两种解释，一种解释认为在当前的科技水平下，还不能确定某一信号分子在胚胎发育中的作用，在胚胎发育过程中，存在着经典Wnt信号蛋白、非经典Wnt信号蛋白和Wnt信号抑制物，而且它们的表达非常复杂，而现在缺乏一个能够完全模拟所有分子信息的数字模型，因此无法确定某种分子调控心肌分化的功能[16]；另一种解释认为经典Wnt信号转导通路对于胚胎心肌细胞的分化，既有抑制作用，也有促进作用；其依赖于分化时期，分化早期有促进作用，分化晚期有抑制作用[17-18]。目前有很多学者倾向于这种观点，不过还需要更多实验支持[19]。本实验里，我们在小鼠胚胎干细胞分化的过程中，加入XAV939，成功的将小鼠胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞的效率提高到72.9%，显著高于不加诱导剂组（8.3%）。提示在干细胞诱导分化的第3天到第5天，抑制经典的Wnt信号通路，有利于mESC为心肌细胞，为干细胞定向诱导分化为心肌细胞提供了另一高效、安全的方法。小分子化合物XAV939相对其他诱导剂，分子量小易于通过细胞膜进入细胞内部且浓度易于控制，价格低廉、安全有效，因此是一种非常理想的化学诱导剂。
尽管从干细胞到临床的治疗应用还有一段很长的路要走，但是我们有理由相信，通过我们深入的研究，在不久的将来，干细胞治疗心力衰竭将会变为现实。
