心传导系统（cardiac conduction system，CCS）是一套能自发产生并传导冲动的特化心肌通路，冲动经CCS传导至整个心脏，引发心脏各部分的协调收缩。充分认识CCS在心脏中的解剖特点是研究心脏电生理及治疗传导相关疾病的基础，同时也是心脏外科手术避免损伤CCS的关键。如何识别和定位CCS历来都是研究热点。本文回顾了CCS组织学显像方法及其特异性分子靶点和历来对于CCS定位及可视化的探索，并着重探讨近年来出现的CCS非破坏性成像技术及手术实时定位方法的临床应用前景及未来发展方向。
引用本文： 于锴, 干昌平. 心传导系统可视化方法及定位技术的研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2024, 31(1): 173-180. doi: 10.7507/1007-4848.202211029 复制
心脏冲动的产生及传导由特化的心肌组织—心传导系统（cardiac conduction system，CCS）参与。心脏传导细胞具有自律性，能自发且有节律地产生冲动，其中以窦房结（sinoatrial node，SAN）自律性最强，在传导系统中起主导作用。冲动首先在SAN自发产生，在向下传导的过程中，出现任何扰动都有可能诱发严重的心律失常。尽管心律失常的发生率及死亡率占人群心血管病事件中的比重并不低，但一些心律失常的病理生理学机制却尚存争议。研究CCS在心脏中的解剖结构是研究心脏电生理及传导相关疾病的基础。外科手术过程中的缝合、夹持或牵拉等对CCS的直接损伤是术后发生暂时或永久传导阻滞的重要原因[1]，正确识别判断CCS，避免其损伤可有效降低术后传导阻滞发生率。
人们对CCS结构的认识经历了一个漫长的过程，相较于同样起着传导电冲动功能的外周神经，CCS体积细小，且包裹在周围的纤维结缔组织鞘不丰富，仅凭肉眼难以识别辨认。依靠一些重要的解剖学标志定位CCS是目前心脏外科医生避免CCS损伤的基本手段。但CCS往往存在一定的变异性，尤其在先天性心脏病（先心病）患者人群中，越为复杂的畸形其变异度越大。这些变异增大了传统定位方法的不确定性，CCS定位困难使得术中损伤的可能性大大增加，这体现在更加复杂的先心病矫治手术，术后传导阻滞的发生率越高，从简单畸形的3%～6%，到复杂畸形的>20%[2-4]。严重的传导阻滞需植入埋藏式起搏器以维持正常心律，为患者带来额外的医疗负担、降低生活质量甚至影响预后。
本文回顾了CCS组织学显像方法及其特异性分子靶点和历来对于CCS定位及可视化的探索，并着重探讨近年来出现的CCS非破坏性成像技术及手术实时定位方法的临床应用前景及未来发展方向。
1 心脏传导系统的解剖定位及变异
大多数脊椎动物中，在心房及心室入口处都可以分别观察到一个产生冲动的起搏组织和另一个类-起搏组织，在哺乳动物中能更清楚地从形态学上被划分为SAN和房室结（atrioventricular node，AVN）；而除鳄鱼外的变温动物则不具有房室束、束支及浦肯野纤维这类特殊的房室传导系统[5]。对于人类心脏，目前的普遍共识是CCS由SAN、AVN、房室束、左右束支及终末的浦肯野纤维构成。随着对CCS结构了解的深入，研究者们还发现了与AVN相连且有别于工作心肌细胞的其他组成部分—房室环及主动脉后结[6]等，因其有与传导细胞高度相似的表达特点，被认为可能是CCS传导的一部分，且可能与某些心律失常形成机制有关[6-7]。
SAN是心脏的正常起搏点，位于上腔静脉与右房界嵴的交界处，SAN的自动去极化是心脏能自发收缩的基础。SAN主体位于上腔静脉与右房交界的终沟处[8-9]，并由宽变窄向下腔静脉方向延伸，同时向四周投射组织至界嵴、终沟、梳状肌及房间隔[10]。房室传导轴由AVN、房室束、左右束支构成，是正常情况下连接心房与心室电传导的唯一通道。AVN位于Koch三角内。房室束起源自AVN前端，分为穿透部和分支部，穿透部在中心纤维体中穿行，向前向下延伸到主动脉无冠窦水平时穿出中心纤维体，然后从无冠窦和右冠窦之间的房室束段（即分支部）上发出细小纤维形成扁平带状的左束支，未参与分散的纤维继续向下延续形成右束支[11]。左束支发出后，在室间隔左侧心内膜下走行并再次分支，大致分为两簇：前簇主要扫过左室流出道区域并深入前乳头肌；后簇转向左室后部并深入后乳头肌[11-12]。右束支在右侧室间隔心肌层内穿行一段距离后浅出至右侧心内膜深面，并向前下方走行，经隔缘肉柱至前乳头肌根部，分支分布于右室壁[12]左右束支各级分支最终形成心肌内的浦肯野纤维网。房室环及主动脉后结是近年来发现的CCS的另一成分，在人类和一些动物中均能观察到[13-15]。房室环由AVN向右下及左下分别发出延伸支并包绕在三尖瓣及二尖瓣周围形成，即右房室环和左房室环；右侧延伸支跨过房室束上方区域和左侧延伸支在主动脉根后方相连续并膨大形成主动脉后结[6]。其功能尚存在争议，可能参与了房室折返型心律失常的形成[6] 。Atkinson等[7]证实右房室环具有异位起搏点能力，并推测该结构可能是房性心动过速的来源。
既往大量的CCS组织学研究结果为CCS定位奠定了解剖学基础，尽管不能肉眼直接识别，但根据一些解剖学标志判断CCS位置是心脏外科手术避免损伤传导系统的通行方法。SAN位于上腔静脉与右房的交界区，周围无纤维包鞘，肉眼难以识别，但有时SAN心外膜面会覆盖一层脂肪垫，或因该区域结缔组织丰富而在心外膜面呈现为一白色斑块[16]，据此也可大致推断其方位。AVN的解剖学定位标志则为上述的Koch三角。得益于这种定位方式的普及，与20世纪60年代相比，先心病矫治术后传导阻滞发生率显著下降[1, 3]，这也验证了这种定位方式的准确性。
但无论如何，通过解剖学标志定位CCS的方法是经验性的，并非所有人的CCS都完全一致。在约10%的案例中，SAN可呈马蹄形出现两个主体[9]。AVN在Koch三角中的位置也是可变的，Cabrera 等[17]通过解剖41例正常人心脏发现约3/4的AVN向上靠近三尖瓣隔瓣附着缘，约1/4向下靠近Koch三角底部而远离三尖瓣隔瓣。更大的变异性则体现在先心病患者人群中，以房室传导轴的变异最为典型。膜周型室间隔缺损边缘包含中心纤维体或室间隔膜部，AVN在Koch三角中的位置较正常位置要更靠近尾部，房室束则移动到Koch三角的冠状窦侧，左右束支围绕隔缺损的边缘走行。在房室管畸形中，由于房室间隔缺乏连贯性，AVN不再位于Koch三角，而位移至房室交界处的房间隔后方，合并共同房室瓣的畸形房室传导轴的走行则更为复杂[9]。在更极端的例子如矫正型大动脉转位中，AVN常分裂为两个并分别延续出各自的房室束，骑跨肺动脉瓣环后汇合成共干穿入室间隔[18]。
CCS变异的可能性使得其位置的不确定性增大，外科医生往往会避开整个上腔静脉与右房交界区域的操作，以防其中包含有SAN或其滋养血管。对于AVN，即使准确识别出Koch三角，也无法明确判断其起始及下级延伸所在具体位置。外科医生谨慎地避开CCS所有可能出现的位置会直接影响手术操作范围，可能增加遗漏残余畸形，而影响手术预后[19]。
2 心传导系统组织学显像及特征性分子靶点
最初关于CCS结构的研究都是基于组织切片层面，自1906年Tawara发现AVN并对其结构、功能进行描述以来，有关CCS解剖学结构的争论便一直存在[20]。房室之间是否真的存在离散的特化的电传导通路及如何证明其客观存在是争论的焦点[21]。Aschoff[22]和Monckeberg[23]根据前人的研究经验，提出了证明心肌组织中存在特化电通路的组织学依据：（1）传导系统在组织上与周围其他组织是互相分离的；（2）传导系统结构能在连续的切片中被追踪；（3）传导系统周围有绝缘纤维组织将其与周围工作心肌分隔开来。Masson三色染色是常用的心脏切片染色方法，染色后肌肉组织呈红色，而结缔组织呈浅蓝或青色，可根据不同区域颜色及细胞形态和排列方式区分工作心肌及CCS组织[17, 24]，但这种方法难以识别细微的CCS结构。随着现代分子生物技术的发展，根据细胞分子表型的不同能更精准地识别区分不同的组织结构，这为CCS识别提供了新依据[6]。利用CCS细胞表达的特征性靶点并结合免疫组织化学或免疫荧光技术，可实现对 CCS的直接显像[7, 14, 25]，对连续切片图像进行计算机 3D重建，能直观地观察到CCS在心脏中分布及走向。
超级化激活阳离子电流（If）通道蛋白4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4，HCN4）是介导传导细胞缓慢自动去极化过程的重要膜蛋白。其在SAN、AVN有高度的表达，而在工作心肌中呈现出极低表达或者无表达[6, 13]。此外，HCN4在右房室环、主动脉后结中也存在表达[6]，表达程度：SAN>右房室环>左房室环[7, 13]。HCN4几乎在所有的CCS结构中都存在表达，是CCS理想的分子标记物。也有人利用电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels，NaVs）对CCS进行荧光染色，发现NaV1.5在SAN及AVN中低表达，而在房室束、左右束支、浦肯野纤维网等快传导结构中高表达，因此NaV1.5可作为识别下游传导束的标记物 [25] 。
缝隙连接是位于心肌相邻细胞间的一类跨膜物质交换通道，由缝隙连接蛋白（connexin，Cx）参与构成，允许离子和小分子（<900 Da）渗透通过，是负责细胞间电和代谢偶联的关键结构。在心肌细胞中表达的Cx主要有3种：Cx40、Cx43和Cx45[26]。Cx的不同亚型在CCS及工作心肌中均有表达但存在差异：在SAN及AVN中观察到Cx45高表达，Cx43低表达；在心房肌中Cx43大量表达，Cx45低表达[6, 13]；Cx40在AVN及心室肌中低表达，在房室束、左右束支和浦肯野纤维网中高表达[7, 25]；此外，Cx45在房室束及房室环中也有大量表达，在周围工作心肌中低表达[13, 26-28]。因此，Cx40及Cx45可作为CCS相应结构的标记物，而Cx43常作为工作心肌的标记物。
某些上游转录因子也可做为CCS标志物。T盒转录因子3（T-box transcription factor 3，Tbx3）广泛表达于除浦肯野纤维网外的SAN、AVN、房室束及左右束支中，且在工作心肌细胞中很少表达，可作为CCS的分子标记物[29]。Sizarov等[14] 在对人类胚胎心脏的研究中，在心房室环及主动脉后结区也观察到有Tbx3的表达。
基于这些特征性的分子靶点，CCS的显像更为准确。此外，应用转基因技术，将CCS标志性基因与报告基因相关联（如荧光酶基因、β-半乳糖苷酶基因等），利用报告基因的表达产物，仅需添加对应底物（如荧光素、LX-gal等），即可实现CCS显像，极大地提升了CCS可视化的便利性[30-32]。Liang等[33]综述了可用于传导系统显像的基因小鼠模型。
3 心传导系统非破坏性定位或显像技术
传统对于CCS结构的研究，往往需要制备组织切片，这些操作具有破坏性，因此局限于基础研究领域而临床应用价值有限。试图将CCS由“隐形”转化为“有形”的探索从未停止，近些年来逐渐出现了一些更有临床应用价值的非破坏性显像技术；见表1。此外，基于特异性靶点的活体荧光成像技术在CCS显像中的研究也取得了令人鼓舞成果，为CCS的实时显像提供了新的思路。
表1
CCS非破坏性定位或可视化技术
3.1 电阻抗测量及局部心电图技术
由于术后传导阻滞的发生与手术损伤CCS具有高度相关性，早在20世纪便开始有人探索更为直观的定位CCS方法。早期研究基于CCS的电传导特性，期望通过手持电极探测心脏中的电生理特性来区分CCS及工作心肌。
电阻抗测量法应用一定强度的交流电，通过手持电极探头即可直接测量局部组织间的电压差异，并将这种差异转化为不同频率和强度的声音信号。传导组织的阻抗较工作心肌更小，外科医生可根据仪器发出的声音差异来区分CCS和工作心肌，以此判断CCS的位置[34-35]。但阻抗的测量信号是组织在 3D空间内分布的复杂函数结果，这种分布在AVN区表现出高度的异质性，因此阻碍了定位的准确性，20世纪60年代后便再无此类研究。基于局部心电图的CCS定位方法也出现在早期的一些探索中，应用手持双极探头描绘出不同CCS部位的特征性心电图，根据这些特征性心电图判断相应CCS的位置[36-37]。这种方法更适用于定位传导方向明确的结构，如房室束及束支。一项对15例儿童和成人先心病患者的研究[38]表明，这种方法对远端房室束和右束支可以取得67%的成功率。但其局限在于测量局部心电图需要保持心肌的电活动，这有悖于体外循环下心内直视手术的心肌保护原则。这种方法在20世纪70年代后也无更进一步的有效性和安全性相关研究。
3.2 高分辨率磁共振成像技术及计算机断层扫描技术
Li等[39] 利用高分辨率磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）对兔心SAN和AVN进行 3D重建。使用Masson三色染色和神经丝免疫酶标染色（神经丝蛋白特异性表达于兔CCS）的方法制作组织切片，识别出SAN和AVN，在高精度MRI扫描图像中寻找并划分出相应区域，成功构建了包含有SAN和AVN的兔右房3D解剖学模型，并在此结构模型基础上构建电生理模型，成功模拟了正常情况和心房颤动时的右房和房室交界区电生理行为。Bordas 等[40]利用高分辨率MRI成像数据并结合特定的算法分析兔心MRI扫描参数，成功构建了游离浦肯野纤维及末端分支的3D模型并构建了兔心室的电生理模型。CCS在心脏中的分布和形态是研究心脏电生理的基础，动作电位传导方向也与工作心肌的排列方向密切相关，因此心肌细胞的排列方向也必须纳入此类电生理模型的考虑。但基于MRI成像的原理，获取心肌排列方向的数据是不可能的。因此，运用MRI技术构建的心脏电生理模型的准确性相对较弱。
Stephenson 等[10]利用高分辨率对比增强型显微计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）技术首次在离体的人类完整心脏中实现对CCS的 3D成像并利用扫描数据完成了1例室间隔缺损标本的3D打印模型制作[41]。通过对预先固定处理的离体心脏使用7.5% I2KI造影剂染色，利用不同组织对I2KI亲和力的不同、扫描时 X射线的衰减程度不同的特点以区别CCS组织，其成像特点为脂肪、工作心肌、结组织、结周组织和结缔组织体素值依次下降。Micro-CT不但具备非破坏性的特点，同时还有数据获取时间短、空间分辨率高（可达微米级）的优势，甚至可观察到心肌排列方向，从而建立包含心肌向量的电生理模型[42]。对比增强型micro-CT技术目前只能用于离体的小体积样本，并且需行固定和碘染色预处理，尚未用于真正的活体目标，距离实际临床应用仍有距离，但其快速、非破坏且相对低成本的特点预示了未来可能的应用前景。
相位对比计算机断层扫描（phase-contrast computed tomography，PCCT）技术根据X射线在组织中的相位值变化差异来对组织进行成像。相较于根据不同组织X射线吸收程度不同来区分组织的传统CT，PCCT的成像分辨率和对比度更高（1 000倍），能对软组织中的细微结构进行高精度成像[43]。Shinohara等[43-44]应用PCCT技术对尸检获取的新生儿或婴儿离体心脏进行扫描，扫描图像中能清晰地识别出包绕在高密度纤维鞘内的、具有连续性的低密度房室传导轴结构（AVN、房室束、左束支及右束支）， 3D重建后还能更直观地显示其在完整心脏中的分布走行，从而实现对CCS的可视化。进一步利用PCCT对离体室间隔缺损畸形患儿心脏进行了非破坏性的解剖学及电生理学研究[45]。相较于对比增强型micro-CT技术，PCCT无需对离体心脏进行额外的碘染色，操作更为简单。但目前其对CCS成像尚不能用于活体患者，胸廓及肺泡内的气体会使X射线不均匀吸收和随机折射，从而干扰心脏内的相移值（phase shift value）探测。事实上PCCT目前尚无适用于临床使用的研发成果，但随着这一技术的不断革新，未来将有机会投入临床使用。
这些非破坏性的CCS可视化技术有益于更好地理解先心病、获得性心脏病及年龄等对CCS的影响及改变，为研究心脏电生理、CCS形态重构与心律失常之间的联系等研究方向提供新的见解，重建的模型也可为外科手术或内科电生理治疗方案的制订提供信息参考或临床教学便利。
3.3 心传导系统实时光学成像技术
利用适当波长的光激发组织产生自体荧光，并根据荧光差异区分不同组织的光谱法被广泛应用于区别某些正常及病理组织的研究。自20世纪90年代以来便有人尝试应用光谱法区别CCS及工作心肌[46-48]。尽管不同组织自体荧光的特定激发光波长和测量的发射光波长不尽相同，但CCS区域和工作心肌之间的光谱学差异足以对其进行区分。心肌组织的自发荧光来源于色氨酸、胶原蛋白和弹性蛋白，CCS和工作心肌光谱的不同提示这些自发荧光基团的分布是有组织特异性的。由于区分CCS和工作心肌的最佳激发光光谱多为紫外光或近紫外光，其潜在的致病性可能限制了其临床转化，目前尚无相关的临床研究，但这为术中实时的CCS荧光显像定位提供了思路。
Huang等[49]将荧光偶联小分子右旋糖苷直接施加在大鼠心外膜和心内膜表面，利用其能快速渗透并扩散入细胞外间隙而不进入细胞内的特点，对大鼠活心脏细胞外间隙进行荧光染色并使用光纤共聚焦显微镜（fibre-optic confocal microscopy，FCM）进行观察。FCM利用CCS与工作心肌微观结构排列的不同来区分二者：工作心肌表现出细胞外间隙的规则条纹排列，而SAN、AVN则呈现不规则网状排列，凭肉眼即可直观辨别。进一步验证其识别灵敏度及特异性可达99.2%±0.3% 和 98.0%±0.7%[50]。FCM能在不同焦平面对一定深度的荧光进行断层成像，其物镜偶联光纤后使用场景更加灵活，可安置于手术室直接于术中进行成像。首个临床试验[51]使用荧光素钠作为细胞外间隙荧光显色剂，对6例继发孔型房间隔缺损患者进行了FCM探测，证明了其有效性及安全性。这种FCM技术可以在极短时间内，于术中直接对组织进行实时成像，对手术进程影响小。FCM 有望成为复杂先心病手术期间定位传导组织区域的有效工具。由于激光穿透深度的限制，此共聚焦技术目前可以实现100 μm深度以内的组织结构显像[50]，因此仅能观察位置较为表浅的SAN及AVN，而对于更为深层的结构，如房室束、左右束支等则不适用。
3.4 基于特征性靶点的活体荧光显像技术
活体荧光显像技术是近年应用于临床的一种实时成像的新技术，利用特殊的荧光染料可以对肉眼难以区分的一些特殊结构或病变组织进行成像，如神经、血管、肿瘤等[52-54]。常用的染料包括吲哚菁绿、荧光素钠等，这些染料并无特异性结合能力，但不同组织或结构对这类荧光染料摄取、浓集、清除速度不同，因此能使特定组织显像。相较于上述非特异性荧光染料，使用抗体偶联的荧光染料作用于特异性靶点可以更有针对性地对目标部位进行显像。利用肿瘤标志物在癌细胞中过表达的特点，Kaushal 等[55]通过对小鼠静脉注射CEA抗体偶联的荧光染料成功实现了胰腺癌及结肠癌病灶的特异性显像，以指导肿瘤的手术切除。近红外光是指波长位于650～900 nm的光波，相较于传统荧光，近红外光具有穿透力强、空间分辨率高、光散射小的特点，对深部组织成像也能取得良好效果。静脉注射特异性抗体偶联的近红外光荧光染料甚至可以实现正常组织覆盖下的肿瘤灶显像[56-57]。
最近，也有研究利用特异性标志物对CCS的活体荧光显像进行了探索。Goodyer等[58]选择了特异性表达于CCS细胞表面的Cntn2（contactin 2）作为标志物，设计了相应的抗体偶联的近红外光染料（mCntn2-800），可在细胞外与Cntn2蛋白特异性结合。通过对小鼠静脉注射mCntn2-800，成功实现了对SAN、AVN、浦肯野纤维网等结构的活体荧光成像。注射染料前后并未发现小鼠心电图特征明显改变，初步证明了其短期安全性。他们还针对人源Cntn2蛋白设计了全人源单克隆Fab，经验证，其同样能够高度特异地结合于人类CCS，证明了这种方法应用于临床的可行性。该方法对CCS的显像具有成像质量、特异性及空间分辨率高的特点，穿透深度达厘米级的近红外光对深埋于组织下的左右束支和细小的浦肯野纤维网也能有不错的成像效果。同时，该方法操作更为简单，不会影响手术进程，这在一定程度上解决了前述FCM的一些局限性。但目前该技术尚未开展相关临床试验，对于CCS埋藏深度更深、表面覆盖组织更为致密的人类心脏，成像效果未知，其长期安全性尚无法确定。
4 小结与展望
CCS的病理学研究奠定了当前识别定位CCS的基础。基于以往大量的关于CCS的高精度切片研究结果，人们对正常或异常心脏中的CCS结构有了比较完整的认识，熟练使用解剖标志来定位CCS区域已经成为合格的心脏外科医生的必备技能。得益于此，与20世纪60年代相比，需要术后安置起搏器的传导阻滞发生率显著下降。但近20年来的先心病矫治术后传导阻滞的发生率趋于平稳而并无继续下降趋势，无论是简单先心病还是复杂先心病矫治，这说明利用解剖标志定位CCS避免损伤的方法作用已达饱和。新的更加精准的CCS显像及定位技术的出现势必将打破这一僵局，在手术干预期间对CCS进行更为准确的定位可能会显著降低传导损伤发生率，特别是在解剖标志定位非常困难的复杂病例中。
高分辨率MRI和各类计算机断层扫描技术可以实现对完整心脏中CCS高精度成像，直观地显示CCS与周围结构之间的关系，为研究心脏电生理、心律失常与CCS结构之间的联系等研究方向提供新见解。重建模型可以3D图形或3D打印的方式存档，用于指导医疗方案制定、临床教学等。相较于传统的连续病理切片，具有方便快捷、空间分辨率高的优势。但上述研究仅被应用于离体心脏，尚未应用于活体，其临床适用性尚待证明，但随着相关技术的不断革新，未来将有机会投入临床使用。利用FCM成功在活体动物中实现对CCS的实时定位，弥补了传统根据解剖标志定位的局限性，使得CCS的定位更为直观和准确。CCS的FCM术中实时定位技术对降低术后传导阻滞发生率，尤其对于复杂先心病手术有着巨大的临床价值。但FCM只能实现一定深度范围内的CCS结构成像，主要为SAN及AVN，对于更深层次的房室束和束支则无法探查。长久以来，利用特异性分子靶点的CCS显像主要依托于组织切片的免疫荧光技术，但得益于活体荧光显像相关技术和设备的问世及临床普及，使用抗体偶联的荧光染料同样可以实现活体动物的CCS实时荧光成像，这也许可作为CCS术中实时成像的技术思路和未来发展方向。结合高穿透性的近红外光荧光染料有望解决当前FCM技术成像深度的局限。若临床试验能进一步证明其有效性及安全性，并能成功实现临床转化，将是手术识别定位CCS的一项里程碑式的突破。
利益冲突：无。
作者贡献：于锴参与本文的撰写和修改；干昌平对文章的内容进行指导和修正。
心脏冲动的产生及传导由特化的心肌组织—心传导系统（cardiac conduction system，CCS）参与。心脏传导细胞具有自律性，能自发且有节律地产生冲动，其中以窦房结（sinoatrial node，SAN）自律性最强，在传导系统中起主导作用。冲动首先在SAN自发产生，在向下传导的过程中，出现任何扰动都有可能诱发严重的心律失常。尽管心律失常的发生率及死亡率占人群心血管病事件中的比重并不低，但一些心律失常的病理生理学机制却尚存争议。研究CCS在心脏中的解剖结构是研究心脏电生理及传导相关疾病的基础。外科手术过程中的缝合、夹持或牵拉等对CCS的直接损伤是术后发生暂时或永久传导阻滞的重要原因[1]，正确识别判断CCS，避免其损伤可有效降低术后传导阻滞发生率。
人们对CCS结构的认识经历了一个漫长的过程，相较于同样起着传导电冲动功能的外周神经，CCS体积细小，且包裹在周围的纤维结缔组织鞘不丰富，仅凭肉眼难以识别辨认。依靠一些重要的解剖学标志定位CCS是目前心脏外科医生避免CCS损伤的基本手段。但CCS往往存在一定的变异性，尤其在先天性心脏病（先心病）患者人群中，越为复杂的畸形其变异度越大。这些变异增大了传统定位方法的不确定性，CCS定位困难使得术中损伤的可能性大大增加，这体现在更加复杂的先心病矫治手术，术后传导阻滞的发生率越高，从简单畸形的3%～6%，到复杂畸形的>20%[2-4]。严重的传导阻滞需植入埋藏式起搏器以维持正常心律，为患者带来额外的医疗负担、降低生活质量甚至影响预后。
本文回顾了CCS组织学显像方法及其特异性分子靶点和历来对于CCS定位及可视化的探索，并着重探讨近年来出现的CCS非破坏性成像技术及手术实时定位方法的临床应用前景及未来发展方向。
1 心脏传导系统的解剖定位及变异
大多数脊椎动物中，在心房及心室入口处都可以分别观察到一个产生冲动的起搏组织和另一个类-起搏组织，在哺乳动物中能更清楚地从形态学上被划分为SAN和房室结（atrioventricular node，AVN）；而除鳄鱼外的变温动物则不具有房室束、束支及浦肯野纤维这类特殊的房室传导系统[5]。对于人类心脏，目前的普遍共识是CCS由SAN、AVN、房室束、左右束支及终末的浦肯野纤维构成。随着对CCS结构了解的深入，研究者们还发现了与AVN相连且有别于工作心肌细胞的其他组成部分—房室环及主动脉后结[6]等，因其有与传导细胞高度相似的表达特点，被认为可能是CCS传导的一部分，且可能与某些心律失常形成机制有关[6-7]。
SAN是心脏的正常起搏点，位于上腔静脉与右房界嵴的交界处，SAN的自动去极化是心脏能自发收缩的基础。SAN主体位于上腔静脉与右房交界的终沟处[8-9]，并由宽变窄向下腔静脉方向延伸，同时向四周投射组织至界嵴、终沟、梳状肌及房间隔[10]。房室传导轴由AVN、房室束、左右束支构成，是正常情况下连接心房与心室电传导的唯一通道。AVN位于Koch三角内。房室束起源自AVN前端，分为穿透部和分支部，穿透部在中心纤维体中穿行，向前向下延伸到主动脉无冠窦水平时穿出中心纤维体，然后从无冠窦和右冠窦之间的房室束段（即分支部）上发出细小纤维形成扁平带状的左束支，未参与分散的纤维继续向下延续形成右束支[11]。左束支发出后，在室间隔左侧心内膜下走行并再次分支，大致分为两簇：前簇主要扫过左室流出道区域并深入前乳头肌；后簇转向左室后部并深入后乳头肌[11-12]。右束支在右侧室间隔心肌层内穿行一段距离后浅出至右侧心内膜深面，并向前下方走行，经隔缘肉柱至前乳头肌根部，分支分布于右室壁[12]左右束支各级分支最终形成心肌内的浦肯野纤维网。房室环及主动脉后结是近年来发现的CCS的另一成分，在人类和一些动物中均能观察到[13-15]。房室环由AVN向右下及左下分别发出延伸支并包绕在三尖瓣及二尖瓣周围形成，即右房室环和左房室环；右侧延伸支跨过房室束上方区域和左侧延伸支在主动脉根后方相连续并膨大形成主动脉后结[6]。其功能尚存在争议，可能参与了房室折返型心律失常的形成[6] 。Atkinson等[7]证实右房室环具有异位起搏点能力，并推测该结构可能是房性心动过速的来源。
既往大量的CCS组织学研究结果为CCS定位奠定了解剖学基础，尽管不能肉眼直接识别，但根据一些解剖学标志判断CCS位置是心脏外科手术避免损伤传导系统的通行方法。SAN位于上腔静脉与右房的交界区，周围无纤维包鞘，肉眼难以识别，但有时SAN心外膜面会覆盖一层脂肪垫，或因该区域结缔组织丰富而在心外膜面呈现为一白色斑块[16]，据此也可大致推断其方位。AVN的解剖学定位标志则为上述的Koch三角。得益于这种定位方式的普及，与20世纪60年代相比，先心病矫治术后传导阻滞发生率显著下降[1, 3]，这也验证了这种定位方式的准确性。
但无论如何，通过解剖学标志定位CCS的方法是经验性的，并非所有人的CCS都完全一致。在约10%的案例中，SAN可呈马蹄形出现两个主体[9]。AVN在Koch三角中的位置也是可变的，Cabrera 等[17]通过解剖41例正常人心脏发现约3/4的AVN向上靠近三尖瓣隔瓣附着缘，约1/4向下靠近Koch三角底部而远离三尖瓣隔瓣。更大的变异性则体现在先心病患者人群中，以房室传导轴的变异最为典型。膜周型室间隔缺损边缘包含中心纤维体或室间隔膜部，AVN在Koch三角中的位置较正常位置要更靠近尾部，房室束则移动到Koch三角的冠状窦侧，左右束支围绕隔缺损的边缘走行。在房室管畸形中，由于房室间隔缺乏连贯性，AVN不再位于Koch三角，而位移至房室交界处的房间隔后方，合并共同房室瓣的畸形房室传导轴的走行则更为复杂[9]。在更极端的例子如矫正型大动脉转位中，AVN常分裂为两个并分别延续出各自的房室束，骑跨肺动脉瓣环后汇合成共干穿入室间隔[18]。
CCS变异的可能性使得其位置的不确定性增大，外科医生往往会避开整个上腔静脉与右房交界区域的操作，以防其中包含有SAN或其滋养血管。对于AVN，即使准确识别出Koch三角，也无法明确判断其起始及下级延伸所在具体位置。外科医生谨慎地避开CCS所有可能出现的位置会直接影响手术操作范围，可能增加遗漏残余畸形，而影响手术预后[19]。
2 心传导系统组织学显像及特征性分子靶点
最初关于CCS结构的研究都是基于组织切片层面，自1906年Tawara发现AVN并对其结构、功能进行描述以来，有关CCS解剖学结构的争论便一直存在[20]。房室之间是否真的存在离散的特化的电传导通路及如何证明其客观存在是争论的焦点[21]。Aschoff[22]和Monckeberg[23]根据前人的研究经验，提出了证明心肌组织中存在特化电通路的组织学依据：（1）传导系统在组织上与周围其他组织是互相分离的；（2）传导系统结构能在连续的切片中被追踪；（3）传导系统周围有绝缘纤维组织将其与周围工作心肌分隔开来。Masson三色染色是常用的心脏切片染色方法，染色后肌肉组织呈红色，而结缔组织呈浅蓝或青色，可根据不同区域颜色及细胞形态和排列方式区分工作心肌及CCS组织[17, 24]，但这种方法难以识别细微的CCS结构。随着现代分子生物技术的发展，根据细胞分子表型的不同能更精准地识别区分不同的组织结构，这为CCS识别提供了新依据[6]。利用CCS细胞表达的特征性靶点并结合免疫组织化学或免疫荧光技术，可实现对 CCS的直接显像[7, 14, 25]，对连续切片图像进行计算机 3D重建，能直观地观察到CCS在心脏中分布及走向。
超级化激活阳离子电流（If）通道蛋白4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4，HCN4）是介导传导细胞缓慢自动去极化过程的重要膜蛋白。其在SAN、AVN有高度的表达，而在工作心肌中呈现出极低表达或者无表达[6, 13]。此外，HCN4在右房室环、主动脉后结中也存在表达[6]，表达程度：SAN>右房室环>左房室环[7, 13]。HCN4几乎在所有的CCS结构中都存在表达，是CCS理想的分子标记物。也有人利用电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels，NaVs）对CCS进行荧光染色，发现NaV1.5在SAN及AVN中低表达，而在房室束、左右束支、浦肯野纤维网等快传导结构中高表达，因此NaV1.5可作为识别下游传导束的标记物 [25] 。
缝隙连接是位于心肌相邻细胞间的一类跨膜物质交换通道，由缝隙连接蛋白（connexin，Cx）参与构成，允许离子和小分子（<900 Da）渗透通过，是负责细胞间电和代谢偶联的关键结构。在心肌细胞中表达的Cx主要有3种：Cx40、Cx43和Cx45[26]。Cx的不同亚型在CCS及工作心肌中均有表达但存在差异：在SAN及AVN中观察到Cx45高表达，Cx43低表达；在心房肌中Cx43大量表达，Cx45低表达[6, 13]；Cx40在AVN及心室肌中低表达，在房室束、左右束支和浦肯野纤维网中高表达[7, 25]；此外，Cx45在房室束及房室环中也有大量表达，在周围工作心肌中低表达[13, 26-28]。因此，Cx40及Cx45可作为CCS相应结构的标记物，而Cx43常作为工作心肌的标记物。
某些上游转录因子也可做为CCS标志物。T盒转录因子3（T-box transcription factor 3，Tbx3）广泛表达于除浦肯野纤维网外的SAN、AVN、房室束及左右束支中，且在工作心肌细胞中很少表达，可作为CCS的分子标记物[29]。Sizarov等[14] 在对人类胚胎心脏的研究中，在心房室环及主动脉后结区也观察到有Tbx3的表达。
基于这些特征性的分子靶点，CCS的显像更为准确。此外，应用转基因技术，将CCS标志性基因与报告基因相关联（如荧光酶基因、β-半乳糖苷酶基因等），利用报告基因的表达产物，仅需添加对应底物（如荧光素、LX-gal等），即可实现CCS显像，极大地提升了CCS可视化的便利性[30-32]。Liang等[33]综述了可用于传导系统显像的基因小鼠模型。
3 心传导系统非破坏性定位或显像技术
传统对于CCS结构的研究，往往需要制备组织切片，这些操作具有破坏性，因此局限于基础研究领域而临床应用价值有限。试图将CCS由“隐形”转化为“有形”的探索从未停止，近些年来逐渐出现了一些更有临床应用价值的非破坏性显像技术；见表1。此外，基于特异性靶点的活体荧光成像技术在CCS显像中的研究也取得了令人鼓舞成果，为CCS的实时显像提供了新的思路。
表1
CCS非破坏性定位或可视化技术
3.1 电阻抗测量及局部心电图技术
由于术后传导阻滞的发生与手术损伤CCS具有高度相关性，早在20世纪便开始有人探索更为直观的定位CCS方法。早期研究基于CCS的电传导特性，期望通过手持电极探测心脏中的电生理特性来区分CCS及工作心肌。
电阻抗测量法应用一定强度的交流电，通过手持电极探头即可直接测量局部组织间的电压差异，并将这种差异转化为不同频率和强度的声音信号。传导组织的阻抗较工作心肌更小，外科医生可根据仪器发出的声音差异来区分CCS和工作心肌，以此判断CCS的位置[34-35]。但阻抗的测量信号是组织在 3D空间内分布的复杂函数结果，这种分布在AVN区表现出高度的异质性，因此阻碍了定位的准确性，20世纪60年代后便再无此类研究。基于局部心电图的CCS定位方法也出现在早期的一些探索中，应用手持双极探头描绘出不同CCS部位的特征性心电图，根据这些特征性心电图判断相应CCS的位置[36-37]。这种方法更适用于定位传导方向明确的结构，如房室束及束支。一项对15例儿童和成人先心病患者的研究[38]表明，这种方法对远端房室束和右束支可以取得67%的成功率。但其局限在于测量局部心电图需要保持心肌的电活动，这有悖于体外循环下心内直视手术的心肌保护原则。这种方法在20世纪70年代后也无更进一步的有效性和安全性相关研究。
3.2 高分辨率磁共振成像技术及计算机断层扫描技术
Li等[39] 利用高分辨率磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）对兔心SAN和AVN进行 3D重建。使用Masson三色染色和神经丝免疫酶标染色（神经丝蛋白特异性表达于兔CCS）的方法制作组织切片，识别出SAN和AVN，在高精度MRI扫描图像中寻找并划分出相应区域，成功构建了包含有SAN和AVN的兔右房3D解剖学模型，并在此结构模型基础上构建电生理模型，成功模拟了正常情况和心房颤动时的右房和房室交界区电生理行为。Bordas 等[40]利用高分辨率MRI成像数据并结合特定的算法分析兔心MRI扫描参数，成功构建了游离浦肯野纤维及末端分支的3D模型并构建了兔心室的电生理模型。CCS在心脏中的分布和形态是研究心脏电生理的基础，动作电位传导方向也与工作心肌的排列方向密切相关，因此心肌细胞的排列方向也必须纳入此类电生理模型的考虑。但基于MRI成像的原理，获取心肌排列方向的数据是不可能的。因此，运用MRI技术构建的心脏电生理模型的准确性相对较弱。
Stephenson 等[10]利用高分辨率对比增强型显微计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）技术首次在离体的人类完整心脏中实现对CCS的 3D成像并利用扫描数据完成了1例室间隔缺损标本的3D打印模型制作[41]。通过对预先固定处理的离体心脏使用7.5% I2KI造影剂染色，利用不同组织对I2KI亲和力的不同、扫描时 X射线的衰减程度不同的特点以区别CCS组织，其成像特点为脂肪、工作心肌、结组织、结周组织和结缔组织体素值依次下降。Micro-CT不但具备非破坏性的特点，同时还有数据获取时间短、空间分辨率高（可达微米级）的优势，甚至可观察到心肌排列方向，从而建立包含心肌向量的电生理模型[42]。对比增强型micro-CT技术目前只能用于离体的小体积样本，并且需行固定和碘染色预处理，尚未用于真正的活体目标，距离实际临床应用仍有距离，但其快速、非破坏且相对低成本的特点预示了未来可能的应用前景。
相位对比计算机断层扫描（phase-contrast computed tomography，PCCT）技术根据X射线在组织中的相位值变化差异来对组织进行成像。相较于根据不同组织X射线吸收程度不同来区分组织的传统CT，PCCT的成像分辨率和对比度更高（1 000倍），能对软组织中的细微结构进行高精度成像[43]。Shinohara等[43-44]应用PCCT技术对尸检获取的新生儿或婴儿离体心脏进行扫描，扫描图像中能清晰地识别出包绕在高密度纤维鞘内的、具有连续性的低密度房室传导轴结构（AVN、房室束、左束支及右束支）， 3D重建后还能更直观地显示其在完整心脏中的分布走行，从而实现对CCS的可视化。进一步利用PCCT对离体室间隔缺损畸形患儿心脏进行了非破坏性的解剖学及电生理学研究[45]。相较于对比增强型micro-CT技术，PCCT无需对离体心脏进行额外的碘染色，操作更为简单。但目前其对CCS成像尚不能用于活体患者，胸廓及肺泡内的气体会使X射线不均匀吸收和随机折射，从而干扰心脏内的相移值（phase shift value）探测。事实上PCCT目前尚无适用于临床使用的研发成果，但随着这一技术的不断革新，未来将有机会投入临床使用。
这些非破坏性的CCS可视化技术有益于更好地理解先心病、获得性心脏病及年龄等对CCS的影响及改变，为研究心脏电生理、CCS形态重构与心律失常之间的联系等研究方向提供新的见解，重建的模型也可为外科手术或内科电生理治疗方案的制订提供信息参考或临床教学便利。
3.3 心传导系统实时光学成像技术
利用适当波长的光激发组织产生自体荧光，并根据荧光差异区分不同组织的光谱法被广泛应用于区别某些正常及病理组织的研究。自20世纪90年代以来便有人尝试应用光谱法区别CCS及工作心肌[46-48]。尽管不同组织自体荧光的特定激发光波长和测量的发射光波长不尽相同，但CCS区域和工作心肌之间的光谱学差异足以对其进行区分。心肌组织的自发荧光来源于色氨酸、胶原蛋白和弹性蛋白，CCS和工作心肌光谱的不同提示这些自发荧光基团的分布是有组织特异性的。由于区分CCS和工作心肌的最佳激发光光谱多为紫外光或近紫外光，其潜在的致病性可能限制了其临床转化，目前尚无相关的临床研究，但这为术中实时的CCS荧光显像定位提供了思路。
Huang等[49]将荧光偶联小分子右旋糖苷直接施加在大鼠心外膜和心内膜表面，利用其能快速渗透并扩散入细胞外间隙而不进入细胞内的特点，对大鼠活心脏细胞外间隙进行荧光染色并使用光纤共聚焦显微镜（fibre-optic confocal microscopy，FCM）进行观察。FCM利用CCS与工作心肌微观结构排列的不同来区分二者：工作心肌表现出细胞外间隙的规则条纹排列，而SAN、AVN则呈现不规则网状排列，凭肉眼即可直观辨别。进一步验证其识别灵敏度及特异性可达99.2%±0.3% 和 98.0%±0.7%[50]。FCM能在不同焦平面对一定深度的荧光进行断层成像，其物镜偶联光纤后使用场景更加灵活，可安置于手术室直接于术中进行成像。首个临床试验[51]使用荧光素钠作为细胞外间隙荧光显色剂，对6例继发孔型房间隔缺损患者进行了FCM探测，证明了其有效性及安全性。这种FCM技术可以在极短时间内，于术中直接对组织进行实时成像，对手术进程影响小。FCM 有望成为复杂先心病手术期间定位传导组织区域的有效工具。由于激光穿透深度的限制，此共聚焦技术目前可以实现100 μm深度以内的组织结构显像[50]，因此仅能观察位置较为表浅的SAN及AVN，而对于更为深层的结构，如房室束、左右束支等则不适用。
3.4 基于特征性靶点的活体荧光显像技术
活体荧光显像技术是近年应用于临床的一种实时成像的新技术，利用特殊的荧光染料可以对肉眼难以区分的一些特殊结构或病变组织进行成像，如神经、血管、肿瘤等[52-54]。常用的染料包括吲哚菁绿、荧光素钠等，这些染料并无特异性结合能力，但不同组织或结构对这类荧光染料摄取、浓集、清除速度不同，因此能使特定组织显像。相较于上述非特异性荧光染料，使用抗体偶联的荧光染料作用于特异性靶点可以更有针对性地对目标部位进行显像。利用肿瘤标志物在癌细胞中过表达的特点，Kaushal 等[55]通过对小鼠静脉注射CEA抗体偶联的荧光染料成功实现了胰腺癌及结肠癌病灶的特异性显像，以指导肿瘤的手术切除。近红外光是指波长位于650～900 nm的光波，相较于传统荧光，近红外光具有穿透力强、空间分辨率高、光散射小的特点，对深部组织成像也能取得良好效果。静脉注射特异性抗体偶联的近红外光荧光染料甚至可以实现正常组织覆盖下的肿瘤灶显像[56-57]。
最近，也有研究利用特异性标志物对CCS的活体荧光显像进行了探索。Goodyer等[58]选择了特异性表达于CCS细胞表面的Cntn2（contactin 2）作为标志物，设计了相应的抗体偶联的近红外光染料（mCntn2-800），可在细胞外与Cntn2蛋白特异性结合。通过对小鼠静脉注射mCntn2-800，成功实现了对SAN、AVN、浦肯野纤维网等结构的活体荧光成像。注射染料前后并未发现小鼠心电图特征明显改变，初步证明了其短期安全性。他们还针对人源Cntn2蛋白设计了全人源单克隆Fab，经验证，其同样能够高度特异地结合于人类CCS，证明了这种方法应用于临床的可行性。该方法对CCS的显像具有成像质量、特异性及空间分辨率高的特点，穿透深度达厘米级的近红外光对深埋于组织下的左右束支和细小的浦肯野纤维网也能有不错的成像效果。同时，该方法操作更为简单，不会影响手术进程，这在一定程度上解决了前述FCM的一些局限性。但目前该技术尚未开展相关临床试验，对于CCS埋藏深度更深、表面覆盖组织更为致密的人类心脏，成像效果未知，其长期安全性尚无法确定。
4 小结与展望
CCS的病理学研究奠定了当前识别定位CCS的基础。基于以往大量的关于CCS的高精度切片研究结果，人们对正常或异常心脏中的CCS结构有了比较完整的认识，熟练使用解剖标志来定位CCS区域已经成为合格的心脏外科医生的必备技能。得益于此，与20世纪60年代相比，需要术后安置起搏器的传导阻滞发生率显著下降。但近20年来的先心病矫治术后传导阻滞的发生率趋于平稳而并无继续下降趋势，无论是简单先心病还是复杂先心病矫治，这说明利用解剖标志定位CCS避免损伤的方法作用已达饱和。新的更加精准的CCS显像及定位技术的出现势必将打破这一僵局，在手术干预期间对CCS进行更为准确的定位可能会显著降低传导损伤发生率，特别是在解剖标志定位非常困难的复杂病例中。
高分辨率MRI和各类计算机断层扫描技术可以实现对完整心脏中CCS高精度成像，直观地显示CCS与周围结构之间的关系，为研究心脏电生理、心律失常与CCS结构之间的联系等研究方向提供新见解。重建模型可以3D图形或3D打印的方式存档，用于指导医疗方案制定、临床教学等。相较于传统的连续病理切片，具有方便快捷、空间分辨率高的优势。但上述研究仅被应用于离体心脏，尚未应用于活体，其临床适用性尚待证明，但随着相关技术的不断革新，未来将有机会投入临床使用。利用FCM成功在活体动物中实现对CCS的实时定位，弥补了传统根据解剖标志定位的局限性，使得CCS的定位更为直观和准确。CCS的FCM术中实时定位技术对降低术后传导阻滞发生率，尤其对于复杂先心病手术有着巨大的临床价值。但FCM只能实现一定深度范围内的CCS结构成像，主要为SAN及AVN，对于更深层次的房室束和束支则无法探查。长久以来，利用特异性分子靶点的CCS显像主要依托于组织切片的免疫荧光技术，但得益于活体荧光显像相关技术和设备的问世及临床普及，使用抗体偶联的荧光染料同样可以实现活体动物的CCS实时荧光成像，这也许可作为CCS术中实时成像的技术思路和未来发展方向。结合高穿透性的近红外光荧光染料有望解决当前FCM技术成像深度的局限。若临床试验能进一步证明其有效性及安全性，并能成功实现临床转化，将是手术识别定位CCS的一项里程碑式的突破。
利益冲突：无。
作者贡献：于锴参与本文的撰写和修改；干昌平对文章的内容进行指导和修正。
