食管鳞状细胞癌（鳞癌）是我国食管癌的主要病理类型，严重威胁我国人民的健康。以免疫检查点抑制剂为主的免疫治疗极大改善了食管鳞癌患者的预后，但仍存在治疗疗效有限的问题。三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure，TLS）是在非淋巴器官内聚集形成的有组织异位淋巴结构。既往研究发现，食管鳞癌中的TLS与患者更好的预后相关，并且能增强患者的免疫治疗疗效。本文结合目前TLS在食管鳞癌领域的相关研究，对TLS与食管鳞癌患者预后及免疫治疗间的关系作一综述，希望能为开展食管鳞癌的精准免疫治疗提供参考。
食管癌是一种恶性程度高、预后较差的疾病，在全世界恶性肿瘤中发病率位居第10位，死亡率位居第6位[1]。东亚地区食管癌发病率为全球最高。中国每年食管癌新发病例和死亡病例约占全球一半，其中超过90%的食管癌病例的病理类型为食管鳞状细胞癌（鳞癌）[2]。随着食管癌早期筛查和早诊早治宣传的普及，食管癌患者的死亡率有所降低[3]。但由于食管癌早期症状隐匿，大部分食管癌在确诊时已处于局部进展期或晚期。近年来，以免疫检查点抑制剂为主的免疫治疗显著改善了食管鳞癌患者的生存。免疫治疗联合化疗已经成为晚期食管鳞癌的标准一线治疗方案。而在局部进展期食管鳞癌中，已有多个Ⅰ、Ⅱ期临床研究提示新辅助免疫治疗良好的安全性和有效性[4]。然而，仍然有部分患者不能从免疫治疗中获益[5]。如何增强免疫治疗的疗效、准确识别免疫治疗的获益人群仍是亟需解决的问题。
肿瘤微环境特征是决定免疫治疗疗效的关键因素[6]。其中，三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）是反映肿瘤微环境的重要标志物[7]。TLS是在非淋巴组织中后天形成的免疫细胞有组织聚集体，主要由T细胞和B细胞组成。TLS通常在正常生理条件下不会出现，而主要出现在慢性炎症环境中，例如自身免疫疾病、慢性感染以及肿瘤。既往研究表明，肿瘤内存在TLS的患者预后更好，这一现象在多种肿瘤中得到证实，包括肺癌[8]、乳腺癌[9]、结直肠癌[10]、子宫内膜癌[11]等。此外，TLS也被证明与肿瘤免疫治疗疗效相关。在不同类型的肿瘤中均观察到，有TLS的肿瘤对免疫治疗的响应明显更好[12-14]。但是TLS 塑造肿瘤微环境、发挥抗肿瘤效应的具体机制仍不清楚，因此深入解析TLS 有助于充分挖掘其在抗肿瘤免疫反应中的潜在应用价值，并为肿瘤精准免疫治疗提供参考。
本文将对TLS在食管鳞癌中的预后价值及其与免疫治疗疗效之间的关系进行综述，为食管鳞癌患者的预后评估和精准治疗提供新的思路和方向。
1 三级淋巴结构
TLS可分为非成熟TLS（immature TLS，iTLS）和成熟TLS（mature TLS，mTLS）两类[15]。iTLS主要呈现为T细胞和B细胞的无序聚集状态，其中T细胞呈耗竭状态，有少量树突状细胞（dendritic cell，DC），不产生有效免疫应答，肿瘤微环境为免疫抑制性。而mTLS则会以一个被CD3+ T细胞区域包围的CD20+ B细胞区域为典型结构特征，形成初级淋巴滤泡（primary follicle，PFL）或伴有生发中心（germinal center，GC）的次级淋巴滤泡（secondary follicle，SFL）结构，类似于次级淋巴器官（secondary lymphoid organ，SLO）中的淋巴滤泡。其中，CD3+ T细胞主要以CD4+ 滤泡辅助T细胞为主要组成成分[16]，同时也有CD8+ 杀伤T细胞、CD4+ 辅助性T细胞和调节性T细胞[17-19]。除了B细胞和T细胞作为mTLS中的主要免疫细胞亚群外，还有不同类型的DC，包括CD21+的滤泡树突状细胞（follicular dendritic cell，FDC）以及CD83+ 的成熟DC[17]。与SLO类似的，TLS中也有一个由成纤维网状细胞（fibroblastic reticular cell，FRC）构成的致密基质网[20]。而在mTLS周围的外周淋巴结地址素（peripheral node addressin，PNAd）阳性的高内皮细胞微静脉（high endothelial venule，HEV）也是mTLS的一个特点。虽然TLS在结构上与SLO有相似之处，但与SLO不同的是，大多数TLS缺少完整的包膜覆盖，TLS中的免疫细胞直接暴露于来自炎症微环境的信号分子，使TLS能产生更加有效的免疫应答[21]。
肿瘤中的TLS有多种识别方法，包括苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、多重免疫荧光（multiplexed immunofluorescence，mIF）染色等。其中，HE染色为最简单、应用最广的方法。通过HE染色可以观察到聚集的免疫细胞在肿瘤微环境中的分布，并和周围组织有较清晰的分界。然而HE染色的缺点在于无法准确评估其中的细胞类型，且受观察者的主观判断影响较大。IHC和mIF能够通过各种细胞表面标记物对TLS内的细胞构成进行识别，从而更加准确地评估TLS的类型。尤其是mIF能够同时在一个肿瘤样本切片内显示多个标志物的表达情况，对于评估TLS的状态和各种细胞类型的分布具有较大帮助。由于技术的限制，一张肿瘤切片中每次行IHC或mIF染色所能选择的标志物是有限的，因此选择合适的细胞标志物对于研究TLS具有重要意义。一般来讲，可以使用CD19或CD20鉴定B细胞，CD3、CD4、CD8鉴定T细胞，CD138鉴定浆细胞。在mTLS中可通过CD21和CD23鉴定FDC。Ki67可用于评估TLS中细胞的增殖情况，BCL6可作为GC B细胞和Tfh细胞的鉴定标志物。在TLS的附近区域，还可用PNAd探究HEV结构的分布。随着科学技术的发展，出现了更加先进的、能够使用更多标志物、分辨率更高的空间显像技术，这无疑促进了对肿瘤中TLS作用机制的进一步研究[22]。
2 食管鳞癌中的三级淋巴结构及其与患者预后的关系
根据既往文献[23-26]报道，食管鳞癌中存在较为丰富的TLS，其比例大约为72.7%～80.0%（表1）。而在其他肿瘤类型中，TLS+患者的比例分别为非小细胞肺癌74.1%[27]，肝细胞癌47.3%[28]，卵巢癌62.9%[29]。食管鳞癌中的TLS也可分为iTLS和mTLS两个阶段，并且含mTLS的患者比例明显高于仅含iTLS患者的比例。在食管鳞癌的相关研究中iTLS也被称为早期TLS[23]（early TLS，E-TLS）、聚集型TLS[25]（TLS aggregates，TLS AGG），在HE染色上主要表现为较小的、椭圆形的淋巴细胞聚集区（图1a），在mIF染色上缺乏明确的T细胞和B细胞区域，无GC，缺少CD21或者CD23信号。而mTLS又可进一步分为初级淋巴滤泡样TLS（PFL-TLS）和次级淋巴滤泡样TLS（SFL-TLS）。PFL-TLS表现为较大的、类圆形淋巴细胞聚集区域，但不伴有GC形成（图1b），在mIF染色中表现为有CD21信号，但缺乏CD23信号。而SFL-TLS则表现为有明确GC形成（图1c），在mIF染色中同时伴有CD21和CD23信号。
表1
食管鳞癌中TLS及其与患者预后关系相关研究汇总［例/%（n/N）］
图1
食管鳞癌中三级淋巴结构的HE染色图
a：非成熟三级淋巴结构；b：初级淋巴滤泡样三级淋巴结构；c：次级淋巴滤泡样三级淋巴结构；HE：苏木精-伊红
尽管有研究[30-32]表明在某些肿瘤类型中TLS与肿瘤进展相关，但在大多数肿瘤中TLS都与患者更好的预后相关[33]。既往研究[23-26,34]也发现，在直接接受手术的食管鳞癌患者中，TLS更丰富的患者相较于TLS更少的患者其术后生存时间更长，肿瘤复发或进展明显更少（表1）。Hayashi等[34]进一步发现这一相关性似乎与肿瘤分期也有关系。在Ⅲ～Ⅳ期食管鳞癌患者中，TLS较多的患者相较于TLS较少的患者其无进展生存期（progression-free survival，PFS）明显更长［HR=2.30，95%CI（1.42，3.72），P=0.0004］。而在Ⅰ期患者中，两组食管鳞癌患者的PFS差异无统计学意义［HR=1.58，95%CI（0.70，3.58），P=0.27］。在该研究中，研究人员还发现分期更晚的食管鳞癌患者TLS密度比分期更早的食管鳞癌患者明显更低，这提示TLS或许可抑制肿瘤进展。既往研究[18,35]也表明，TLS表达水平越高的患者其肿瘤微环境内含有更加丰富的肿瘤抗原特异性或激活的杀伤性淋巴细胞，从而达到更强的抗肿瘤免疫作用。
此外，不同类型的TLS对食管鳞癌患者预后的影响也不同，mTLS与食管鳞癌患者的预后更有相关性。相较于仅有iTLS的食管鳞癌患者，具有mTLS的食管鳞癌患者的OS和无病生存期（disease-free survival，DFS）更优，而仅有iTLS的食管鳞癌患者和没有TLS的食管鳞癌患者的OS和DFS无显著差异[24,34]。在mTLS或iTLS中，B细胞分别起着抑制或促进肿瘤的作用，这可能是导致mTLS患者预后更好的原因之一[36]。在iTLS中，B细胞可能会表达或者释放一些免疫抑制性分子，影响免疫细胞产生有效的抗肿瘤免疫反应。相反，在mTLS中B细胞可能通过向CD8+ T细胞呈递肿瘤来源抗原以“教育”CD8+ T细胞，进而发挥抗肿瘤作用[18]。有趣的是，在具有mTLS的食管鳞癌肿瘤样本中，CD8+ T细胞的浸润数量也明显更多[24,37]。此外，研究[17,24]发现，在食管鳞癌和非小细胞肺癌患者中，同时具有高CD8+ T细胞浸润和丰富TLS的患者预后明显比仅有高CD8+ T细胞浸润而没有或少有TLS的患者更优。这提示，在肿瘤微环境中单纯CD8+ T细胞的存在不足以诱导持续的抗肿瘤免疫反应，还需要B细胞的参与发挥关键的协同作用。对于TLS而言，形成GC和产生浆细胞是最终的归宿。浆细胞能够产生肿瘤抗原特异性抗体，从而激活补体以及抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[38-39]。此外，B细胞自身也可以作为抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），向CD4+ T细胞或者CD8+ T细胞呈递抗原[40-41]，发挥抗肿瘤免疫功能。这些B细胞可向肿瘤浸润T细胞提供持续的共刺激信号以及促进趋化因子介导的T细胞转运，由此产生持久的肿瘤杀伤功能[42]。这些研究结果表明，以CD8+ 杀伤T细胞为代表的细胞免疫和以B细胞为代表的体液免疫在抗肿瘤免疫中发挥协同作用。这也解释了mTLS+食管鳞癌患者相对于仅有iTLS的患者预后更好。
3 食管鳞癌中的三级淋巴结构与免疫治疗的关系
细胞程序性死亡受体1 （programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）通路作为当前肿瘤免疫治疗的主要作用靶点，在临床上得到广泛应用。然而，免疫治疗疗效在不同患者中也有一定差异，如何为肿瘤患者选择更好的疗效标志物成为免疫治疗的关键。虽然PD-L1表达水平是免疫治疗理论获益标志物，但学术界对于PD-L1能否有效用于预测食管鳞癌患者从免疫治疗中获益仍存在争议。一项纳入5项晚期食管鳞癌Ⅲ期临床研究的Meta分析[43]显示，在PD-L1表达水平较低的患者中免疫治疗联合化疗仍能带来显著的临床获益。无论是以肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score，TPS）还是联合阳性分数（combined positive score，CPS）作为PD-L1表达水平的指标，免疫治疗联合化疗对比单独化疗均在PD-L1低表达患者中展现出明显生存获益。这些临床数据提示，在目前“免疫联合”的主流治疗模式下，我们需要更加可靠的免疫治疗疗效标志物。
TLS作为反映肿瘤微环境的重要标志物，已有研究显示TLS能够在多种肿瘤中增强免疫治疗的疗效，包括黑色素瘤[12-13]、软组织肉瘤[14]、肺癌[44]等。越来越多的研究开始探索以TLS作为免疫治疗疗效标志物的可能性。在PEMBROSARC研究[45]中，研究者探究了以TLS作为标志物筛选软组织肉瘤患者接受免疫治疗的效果。该研究纳入了接受免疫治疗前确认有TLS存在的35例软组织肉瘤患者，同期也纳入了41例未进行TLS筛选的患者。研究结果发现与未经TLS筛选的患者相比，TLS阳性患者的客观缓解率（objective response rate，ORR）和PFS均显著提升或延长（分别为30% vs. 2%，4.9个月 vs. 1.5个月）。在食管鳞癌中，目前还未有以TLS作为生物标志物的相关研究开展，但已有研究报道其免疫治疗疗效与TLS相关。一项纳入34例手术后复发食管癌患者的研究[34]发现，在原发肿瘤中TLS密度较高的患者相较于TLS密度较低的患者在接受单独免疫治疗后PFS显著延长［HR=3.19，95%CI（1.36，7.43），P=0.004］。
关于在食管鳞癌中TLS促进免疫治疗疗效的相关机制，目前尚无明确结论。肿瘤微环境中的TLS中存在一群特殊的CD8+ T细胞亚群，称之为耗竭前体T细胞（progenitor exhausted T cell，Tpex）。在肿瘤抗原的长期刺激下，一部分肿瘤浸润淋巴细胞将会上调表达一些免疫抑制性受体，如PD-1、TIM3、LAG-3以及TIGIT，这一部分细胞被称为耗竭T细胞（Tex）[46]。Tex亚群是响应PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的主要细胞类型，免疫治疗能够重新激活Tex使其发挥抗肿瘤作用[47-48]。但是Tex亚群本身具有异质性，包含Tpex及终末耗竭T细胞（terminal exhausted T cells，Ttex）两个亚群，其中Tpex亚群才是维持CD8+ T细胞介导的长期免疫反应以及响应免疫治疗的关键细胞群[49-53]。PD-1/PD-L1通路阻断主要作用于Tpex亚群，使其进一步分化成为下游细胞亚群，即Ttex亚群[47-48,50,54]。肿瘤微环境中Tpex亚群的比例越高，肿瘤患者接受免疫治疗后的预后就越好[55-57]。而肿瘤微环境中的TLS可能帮助Tpex在肿瘤内聚集，从而增强免疫治疗疗效[58-60]。在食管鳞癌中，最近有研究[61]发现，一群Tpex样CD8+ T细胞能够增强肿瘤对于免疫治疗的响应，并且这群细胞能够作为免疫治疗疗效的有效预测标志物。此外，研究人员发现这群细胞还和B细胞共定位于TLS结构中，并和TLS相关B细胞有较强的细胞相互作用关系。该研究提示，Tpex亚群细胞可能是TLS促进食管鳞癌响应免疫治疗的一个重要靶细胞群。
虽然TLS与肿瘤免疫治疗疗效之间的关系已基本确定，但TLS与化疗之间的关系仍存在一定争议。有研究[62]认为化疗可以诱导TLS的生成，而有的研究[63]认为化疗会影响mTLS的形成。一项纳入114例接受化疗的非小细胞肺癌患者的研究[64]发现，mTLS+患者和mTLS−患者预后无显著差异。该研究结果与另一项使用POPLAR研究患者数据的研究结果类似。POPLAR研究[65]是一项Ⅱ期随机对照临床研究，纳入了287例接受一线化疗后复发的晚期非小细胞肺癌患者，并按1∶1比例随机分组接受免疫治疗或二线化疗方案。Patil等[66]使用该临床研究中的患者数据发现，在免疫治疗组中TLS+患者的生存明显优于TLS−患者，而在化疗组中TLS+患者和TLS−患者的生存无显著差异。以上研究结果提示，TLS与免疫治疗疗效之间的关系具有治疗方式特异性。
由于TLS与更好的肿瘤免疫治疗疗效相关，因此在肿瘤微环境中诱导TLS的形成被视为提升免疫治疗疗效的潜在策略。在一些临床前模型中，已有多项研究通过细胞因子、趋化因子或生物材料等方法成功诱导TLS的形成，初步展现出效果[7]。然而，这些方案尚未获得成为主流癌症治疗方案所需的有效性和稳定性。我们仍需要在单细胞和空间水平更加深入地了解TLS的形成和功能，以不断改进诱导和调节TLS的治疗策略。目前关于TLS在食管鳞癌中的研究相对较少，TLS与食管鳞癌免疫治疗疗效的关联仍值得进一步探讨。
4 总结与展望
食管鳞癌肿瘤微环境中TLS的形成和发展对于肿瘤患者的生存预后有积极作用。在响应免疫治疗方面，虽然目前关于食管鳞癌中免疫治疗疗效和TLS关系的文献报道较少，但已有的研究结果提示，TLS能够促进食管鳞癌响应免疫治疗。由于仅使用常规病理学方法即可完成对肿瘤患者TLS情况的评估，这为将TLS作为泛肿瘤生物标志物来预测免疫治疗疗效提供可能。在其他肿瘤中，除了已经报道结果的PEMBROSARC研究外，还有多个临床研究正在探究TLS作为评估患者接受免疫治疗疗效指标的有效性（NCT04874311、NCT04705818、NCT06084689）。对于食管鳞癌，应用TLS作为评估免疫治疗疗效的一大问题在于标本的取用。由于胃镜或超声内镜等活检方式所钳夹的组织较小，且组织结构在钳夹时多已被破坏，这给使用传统的HE、IHC或mIF等方法准确评估患者TLS情况带来困难。未来我们还需要进一步研究TLS结构和功能，综合TLS的多种特征，结合转录组测序等新技术手段和前瞻性临床研究建立和完善TLS评分机制。在探索TLS作为预测免疫治疗疗效靶点的同时，诱导TLS形成也成为提高肿瘤免疫治疗疗效的研究热点[33]。总之，解析TLS的生物学特征将为深入认识食管鳞癌肿瘤微环境提供新的思路，为实现食管鳞癌的精准免疫治疗提供方向。
利益冲突：无。
作者贡献：牛振屹、金润森负责论文设计，初稿撰写、审阅与修改；颜克鹏负责论文审阅与修改；张燕、李鹤成负责论文设计、审阅与修改。
食管癌是一种恶性程度高、预后较差的疾病，在全世界恶性肿瘤中发病率位居第10位，死亡率位居第6位[1]。东亚地区食管癌发病率为全球最高。中国每年食管癌新发病例和死亡病例约占全球一半，其中超过90%的食管癌病例的病理类型为食管鳞状细胞癌（鳞癌）[2]。随着食管癌早期筛查和早诊早治宣传的普及，食管癌患者的死亡率有所降低[3]。但由于食管癌早期症状隐匿，大部分食管癌在确诊时已处于局部进展期或晚期。近年来，以免疫检查点抑制剂为主的免疫治疗显著改善了食管鳞癌患者的生存。免疫治疗联合化疗已经成为晚期食管鳞癌的标准一线治疗方案。而在局部进展期食管鳞癌中，已有多个Ⅰ、Ⅱ期临床研究提示新辅助免疫治疗良好的安全性和有效性[4]。然而，仍然有部分患者不能从免疫治疗中获益[5]。如何增强免疫治疗的疗效、准确识别免疫治疗的获益人群仍是亟需解决的问题。
肿瘤微环境特征是决定免疫治疗疗效的关键因素[6]。其中，三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）是反映肿瘤微环境的重要标志物[7]。TLS是在非淋巴组织中后天形成的免疫细胞有组织聚集体，主要由T细胞和B细胞组成。TLS通常在正常生理条件下不会出现，而主要出现在慢性炎症环境中，例如自身免疫疾病、慢性感染以及肿瘤。既往研究表明，肿瘤内存在TLS的患者预后更好，这一现象在多种肿瘤中得到证实，包括肺癌[8]、乳腺癌[9]、结直肠癌[10]、子宫内膜癌[11]等。此外，TLS也被证明与肿瘤免疫治疗疗效相关。在不同类型的肿瘤中均观察到，有TLS的肿瘤对免疫治疗的响应明显更好[12-14]。但是TLS 塑造肿瘤微环境、发挥抗肿瘤效应的具体机制仍不清楚，因此深入解析TLS 有助于充分挖掘其在抗肿瘤免疫反应中的潜在应用价值，并为肿瘤精准免疫治疗提供参考。
本文将对TLS在食管鳞癌中的预后价值及其与免疫治疗疗效之间的关系进行综述，为食管鳞癌患者的预后评估和精准治疗提供新的思路和方向。
1 三级淋巴结构
TLS可分为非成熟TLS（immature TLS，iTLS）和成熟TLS（mature TLS，mTLS）两类[15]。iTLS主要呈现为T细胞和B细胞的无序聚集状态，其中T细胞呈耗竭状态，有少量树突状细胞（dendritic cell，DC），不产生有效免疫应答，肿瘤微环境为免疫抑制性。而mTLS则会以一个被CD3+ T细胞区域包围的CD20+ B细胞区域为典型结构特征，形成初级淋巴滤泡（primary follicle，PFL）或伴有生发中心（germinal center，GC）的次级淋巴滤泡（secondary follicle，SFL）结构，类似于次级淋巴器官（secondary lymphoid organ，SLO）中的淋巴滤泡。其中，CD3+ T细胞主要以CD4+ 滤泡辅助T细胞为主要组成成分[16]，同时也有CD8+ 杀伤T细胞、CD4+ 辅助性T细胞和调节性T细胞[17-19]。除了B细胞和T细胞作为mTLS中的主要免疫细胞亚群外，还有不同类型的DC，包括CD21+的滤泡树突状细胞（follicular dendritic cell，FDC）以及CD83+ 的成熟DC[17]。与SLO类似的，TLS中也有一个由成纤维网状细胞（fibroblastic reticular cell，FRC）构成的致密基质网[20]。而在mTLS周围的外周淋巴结地址素（peripheral node addressin，PNAd）阳性的高内皮细胞微静脉（high endothelial venule，HEV）也是mTLS的一个特点。虽然TLS在结构上与SLO有相似之处，但与SLO不同的是，大多数TLS缺少完整的包膜覆盖，TLS中的免疫细胞直接暴露于来自炎症微环境的信号分子，使TLS能产生更加有效的免疫应答[21]。
肿瘤中的TLS有多种识别方法，包括苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、多重免疫荧光（multiplexed immunofluorescence，mIF）染色等。其中，HE染色为最简单、应用最广的方法。通过HE染色可以观察到聚集的免疫细胞在肿瘤微环境中的分布，并和周围组织有较清晰的分界。然而HE染色的缺点在于无法准确评估其中的细胞类型，且受观察者的主观判断影响较大。IHC和mIF能够通过各种细胞表面标记物对TLS内的细胞构成进行识别，从而更加准确地评估TLS的类型。尤其是mIF能够同时在一个肿瘤样本切片内显示多个标志物的表达情况，对于评估TLS的状态和各种细胞类型的分布具有较大帮助。由于技术的限制，一张肿瘤切片中每次行IHC或mIF染色所能选择的标志物是有限的，因此选择合适的细胞标志物对于研究TLS具有重要意义。一般来讲，可以使用CD19或CD20鉴定B细胞，CD3、CD4、CD8鉴定T细胞，CD138鉴定浆细胞。在mTLS中可通过CD21和CD23鉴定FDC。Ki67可用于评估TLS中细胞的增殖情况，BCL6可作为GC B细胞和Tfh细胞的鉴定标志物。在TLS的附近区域，还可用PNAd探究HEV结构的分布。随着科学技术的发展，出现了更加先进的、能够使用更多标志物、分辨率更高的空间显像技术，这无疑促进了对肿瘤中TLS作用机制的进一步研究[22]。
2 食管鳞癌中的三级淋巴结构及其与患者预后的关系
根据既往文献[23-26]报道，食管鳞癌中存在较为丰富的TLS，其比例大约为72.7%～80.0%（表1）。而在其他肿瘤类型中，TLS+患者的比例分别为非小细胞肺癌74.1%[27]，肝细胞癌47.3%[28]，卵巢癌62.9%[29]。食管鳞癌中的TLS也可分为iTLS和mTLS两个阶段，并且含mTLS的患者比例明显高于仅含iTLS患者的比例。在食管鳞癌的相关研究中iTLS也被称为早期TLS[23]（early TLS，E-TLS）、聚集型TLS[25]（TLS aggregates，TLS AGG），在HE染色上主要表现为较小的、椭圆形的淋巴细胞聚集区（图1a），在mIF染色上缺乏明确的T细胞和B细胞区域，无GC，缺少CD21或者CD23信号。而mTLS又可进一步分为初级淋巴滤泡样TLS（PFL-TLS）和次级淋巴滤泡样TLS（SFL-TLS）。PFL-TLS表现为较大的、类圆形淋巴细胞聚集区域，但不伴有GC形成（图1b），在mIF染色中表现为有CD21信号，但缺乏CD23信号。而SFL-TLS则表现为有明确GC形成（图1c），在mIF染色中同时伴有CD21和CD23信号。
表1
食管鳞癌中TLS及其与患者预后关系相关研究汇总［例/%（n/N）］
图1
食管鳞癌中三级淋巴结构的HE染色图
a：非成熟三级淋巴结构；b：初级淋巴滤泡样三级淋巴结构；c：次级淋巴滤泡样三级淋巴结构；HE：苏木精-伊红
尽管有研究[30-32]表明在某些肿瘤类型中TLS与肿瘤进展相关，但在大多数肿瘤中TLS都与患者更好的预后相关[33]。既往研究[23-26,34]也发现，在直接接受手术的食管鳞癌患者中，TLS更丰富的患者相较于TLS更少的患者其术后生存时间更长，肿瘤复发或进展明显更少（表1）。Hayashi等[34]进一步发现这一相关性似乎与肿瘤分期也有关系。在Ⅲ～Ⅳ期食管鳞癌患者中，TLS较多的患者相较于TLS较少的患者其无进展生存期（progression-free survival，PFS）明显更长［HR=2.30，95%CI（1.42，3.72），P=0.0004］。而在Ⅰ期患者中，两组食管鳞癌患者的PFS差异无统计学意义［HR=1.58，95%CI（0.70，3.58），P=0.27］。在该研究中，研究人员还发现分期更晚的食管鳞癌患者TLS密度比分期更早的食管鳞癌患者明显更低，这提示TLS或许可抑制肿瘤进展。既往研究[18,35]也表明，TLS表达水平越高的患者其肿瘤微环境内含有更加丰富的肿瘤抗原特异性或激活的杀伤性淋巴细胞，从而达到更强的抗肿瘤免疫作用。
此外，不同类型的TLS对食管鳞癌患者预后的影响也不同，mTLS与食管鳞癌患者的预后更有相关性。相较于仅有iTLS的食管鳞癌患者，具有mTLS的食管鳞癌患者的OS和无病生存期（disease-free survival，DFS）更优，而仅有iTLS的食管鳞癌患者和没有TLS的食管鳞癌患者的OS和DFS无显著差异[24,34]。在mTLS或iTLS中，B细胞分别起着抑制或促进肿瘤的作用，这可能是导致mTLS患者预后更好的原因之一[36]。在iTLS中，B细胞可能会表达或者释放一些免疫抑制性分子，影响免疫细胞产生有效的抗肿瘤免疫反应。相反，在mTLS中B细胞可能通过向CD8+ T细胞呈递肿瘤来源抗原以“教育”CD8+ T细胞，进而发挥抗肿瘤作用[18]。有趣的是，在具有mTLS的食管鳞癌肿瘤样本中，CD8+ T细胞的浸润数量也明显更多[24,37]。此外，研究[17,24]发现，在食管鳞癌和非小细胞肺癌患者中，同时具有高CD8+ T细胞浸润和丰富TLS的患者预后明显比仅有高CD8+ T细胞浸润而没有或少有TLS的患者更优。这提示，在肿瘤微环境中单纯CD8+ T细胞的存在不足以诱导持续的抗肿瘤免疫反应，还需要B细胞的参与发挥关键的协同作用。对于TLS而言，形成GC和产生浆细胞是最终的归宿。浆细胞能够产生肿瘤抗原特异性抗体，从而激活补体以及抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[38-39]。此外，B细胞自身也可以作为抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），向CD4+ T细胞或者CD8+ T细胞呈递抗原[40-41]，发挥抗肿瘤免疫功能。这些B细胞可向肿瘤浸润T细胞提供持续的共刺激信号以及促进趋化因子介导的T细胞转运，由此产生持久的肿瘤杀伤功能[42]。这些研究结果表明，以CD8+ 杀伤T细胞为代表的细胞免疫和以B细胞为代表的体液免疫在抗肿瘤免疫中发挥协同作用。这也解释了mTLS+食管鳞癌患者相对于仅有iTLS的患者预后更好。
3 食管鳞癌中的三级淋巴结构与免疫治疗的关系
细胞程序性死亡受体1 （programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）通路作为当前肿瘤免疫治疗的主要作用靶点，在临床上得到广泛应用。然而，免疫治疗疗效在不同患者中也有一定差异，如何为肿瘤患者选择更好的疗效标志物成为免疫治疗的关键。虽然PD-L1表达水平是免疫治疗理论获益标志物，但学术界对于PD-L1能否有效用于预测食管鳞癌患者从免疫治疗中获益仍存在争议。一项纳入5项晚期食管鳞癌Ⅲ期临床研究的Meta分析[43]显示，在PD-L1表达水平较低的患者中免疫治疗联合化疗仍能带来显著的临床获益。无论是以肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score，TPS）还是联合阳性分数（combined positive score，CPS）作为PD-L1表达水平的指标，免疫治疗联合化疗对比单独化疗均在PD-L1低表达患者中展现出明显生存获益。这些临床数据提示，在目前“免疫联合”的主流治疗模式下，我们需要更加可靠的免疫治疗疗效标志物。
TLS作为反映肿瘤微环境的重要标志物，已有研究显示TLS能够在多种肿瘤中增强免疫治疗的疗效，包括黑色素瘤[12-13]、软组织肉瘤[14]、肺癌[44]等。越来越多的研究开始探索以TLS作为免疫治疗疗效标志物的可能性。在PEMBROSARC研究[45]中，研究者探究了以TLS作为标志物筛选软组织肉瘤患者接受免疫治疗的效果。该研究纳入了接受免疫治疗前确认有TLS存在的35例软组织肉瘤患者，同期也纳入了41例未进行TLS筛选的患者。研究结果发现与未经TLS筛选的患者相比，TLS阳性患者的客观缓解率（objective response rate，ORR）和PFS均显著提升或延长（分别为30% vs. 2%，4.9个月 vs. 1.5个月）。在食管鳞癌中，目前还未有以TLS作为生物标志物的相关研究开展，但已有研究报道其免疫治疗疗效与TLS相关。一项纳入34例手术后复发食管癌患者的研究[34]发现，在原发肿瘤中TLS密度较高的患者相较于TLS密度较低的患者在接受单独免疫治疗后PFS显著延长［HR=3.19，95%CI（1.36，7.43），P=0.004］。
关于在食管鳞癌中TLS促进免疫治疗疗效的相关机制，目前尚无明确结论。肿瘤微环境中的TLS中存在一群特殊的CD8+ T细胞亚群，称之为耗竭前体T细胞（progenitor exhausted T cell，Tpex）。在肿瘤抗原的长期刺激下，一部分肿瘤浸润淋巴细胞将会上调表达一些免疫抑制性受体，如PD-1、TIM3、LAG-3以及TIGIT，这一部分细胞被称为耗竭T细胞（Tex）[46]。Tex亚群是响应PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的主要细胞类型，免疫治疗能够重新激活Tex使其发挥抗肿瘤作用[47-48]。但是Tex亚群本身具有异质性，包含Tpex及终末耗竭T细胞（terminal exhausted T cells，Ttex）两个亚群，其中Tpex亚群才是维持CD8+ T细胞介导的长期免疫反应以及响应免疫治疗的关键细胞群[49-53]。PD-1/PD-L1通路阻断主要作用于Tpex亚群，使其进一步分化成为下游细胞亚群，即Ttex亚群[47-48,50,54]。肿瘤微环境中Tpex亚群的比例越高，肿瘤患者接受免疫治疗后的预后就越好[55-57]。而肿瘤微环境中的TLS可能帮助Tpex在肿瘤内聚集，从而增强免疫治疗疗效[58-60]。在食管鳞癌中，最近有研究[61]发现，一群Tpex样CD8+ T细胞能够增强肿瘤对于免疫治疗的响应，并且这群细胞能够作为免疫治疗疗效的有效预测标志物。此外，研究人员发现这群细胞还和B细胞共定位于TLS结构中，并和TLS相关B细胞有较强的细胞相互作用关系。该研究提示，Tpex亚群细胞可能是TLS促进食管鳞癌响应免疫治疗的一个重要靶细胞群。
虽然TLS与肿瘤免疫治疗疗效之间的关系已基本确定，但TLS与化疗之间的关系仍存在一定争议。有研究[62]认为化疗可以诱导TLS的生成，而有的研究[63]认为化疗会影响mTLS的形成。一项纳入114例接受化疗的非小细胞肺癌患者的研究[64]发现，mTLS+患者和mTLS−患者预后无显著差异。该研究结果与另一项使用POPLAR研究患者数据的研究结果类似。POPLAR研究[65]是一项Ⅱ期随机对照临床研究，纳入了287例接受一线化疗后复发的晚期非小细胞肺癌患者，并按1∶1比例随机分组接受免疫治疗或二线化疗方案。Patil等[66]使用该临床研究中的患者数据发现，在免疫治疗组中TLS+患者的生存明显优于TLS−患者，而在化疗组中TLS+患者和TLS−患者的生存无显著差异。以上研究结果提示，TLS与免疫治疗疗效之间的关系具有治疗方式特异性。
由于TLS与更好的肿瘤免疫治疗疗效相关，因此在肿瘤微环境中诱导TLS的形成被视为提升免疫治疗疗效的潜在策略。在一些临床前模型中，已有多项研究通过细胞因子、趋化因子或生物材料等方法成功诱导TLS的形成，初步展现出效果[7]。然而，这些方案尚未获得成为主流癌症治疗方案所需的有效性和稳定性。我们仍需要在单细胞和空间水平更加深入地了解TLS的形成和功能，以不断改进诱导和调节TLS的治疗策略。目前关于TLS在食管鳞癌中的研究相对较少，TLS与食管鳞癌免疫治疗疗效的关联仍值得进一步探讨。
4 总结与展望
食管鳞癌肿瘤微环境中TLS的形成和发展对于肿瘤患者的生存预后有积极作用。在响应免疫治疗方面，虽然目前关于食管鳞癌中免疫治疗疗效和TLS关系的文献报道较少，但已有的研究结果提示，TLS能够促进食管鳞癌响应免疫治疗。由于仅使用常规病理学方法即可完成对肿瘤患者TLS情况的评估，这为将TLS作为泛肿瘤生物标志物来预测免疫治疗疗效提供可能。在其他肿瘤中，除了已经报道结果的PEMBROSARC研究外，还有多个临床研究正在探究TLS作为评估患者接受免疫治疗疗效指标的有效性（NCT04874311、NCT04705818、NCT06084689）。对于食管鳞癌，应用TLS作为评估免疫治疗疗效的一大问题在于标本的取用。由于胃镜或超声内镜等活检方式所钳夹的组织较小，且组织结构在钳夹时多已被破坏，这给使用传统的HE、IHC或mIF等方法准确评估患者TLS情况带来困难。未来我们还需要进一步研究TLS结构和功能，综合TLS的多种特征，结合转录组测序等新技术手段和前瞻性临床研究建立和完善TLS评分机制。在探索TLS作为预测免疫治疗疗效靶点的同时，诱导TLS形成也成为提高肿瘤免疫治疗疗效的研究热点[33]。总之，解析TLS的生物学特征将为深入认识食管鳞癌肿瘤微环境提供新的思路，为实现食管鳞癌的精准免疫治疗提供方向。
利益冲突：无。
作者贡献：牛振屹、金润森负责论文设计，初稿撰写、审阅与修改；颜克鹏负责论文审阅与修改；张燕、李鹤成负责论文设计、审阅与修改。
