心脏移植是治疗终末期心脏疾病的重要手段，高质量的供心是移植成功的关键。国际心肺移植协会注册数据显示，截至2016年，亚洲心脏移植数量仅占全球的5.7%，供心短缺及供心缺血时间是制约心脏移植发展的最主要因素[1]。因此，保护有限的供心资源，使其在植入前保持良好的质量，对提高受者心脏移植术后近、远期疗效具有重要意义。
目前，供心保存有两种方法，一种是传统静态冷保存技术（static cold storage，SCS），这是依赖于心脏保存液的保存技术，心脏保持舒张期停跳状态，完全浸泡于低温器官保存液中[2]。但心脏保存液的安全时限均为4～6 h[3-4]，这限制了心脏移植手术的时间，同时也限制了供心选择范围。另一种是机械灌注保存技术，包括低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）和常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）。HMP是借助机械灌注心脏保存液，供心保存期间处于停搏状态，基本原理与传统心脏保存液相似[5]。NMP是机械灌注氧合血，供心在保存期间处于跳动状态，最大程度保证供心接近体内状态，避免缺血缺氧带来的不利影响[6]。机械灌注保存技术借助机械灌注保存液或氧合血，源源不断地提供能量底物，避免心肌组织局部代谢产物蓄积，减轻活性氧自由基对心肌的损伤[7]。
为进一步提高供心保存质量和延长保存时间，我中心采用广西巴马小型猪建立体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）离体空跳猪心保存模型，探讨离体空跳供心保存方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物和仪器
2022年1月—2023年8月，选取健康广西巴马小型猪（实验动物许可证号：SCXK桂2018-0003）20头，雌雄各半，体重25～30 kg，由广西大学动物实验中心提供。相关仪器：ECMO机（德国迈柯唯MAQUET Rotaflow），膜式氧合器（意大利Dideco 901），体外循环管道（天津市塑料研究所有限公司），变温水箱（德国STOCKERT公司 SⅢ型），血气分析仪（丹麦雷度ABL800 FLEX），100B-ACT检测仪（北京科仪诚科技开发中心）。
1.2 心脏摘取
实验动物手术前禁饮禁食8 h。麻醉药物、其他物品以及抢救器械准备完毕后，于猪臀部肌肉注射阿托品0.5 mg、咪达唑仑10 mg、艾司氯胺酮注射液1～2 mg/kg。基础麻醉后，用24G静脉留置针于猪耳缘处建立静脉通道并固定。通过耳缘静脉依次推注舒芬太尼注射液0.15～0.25 μg/kg、咪达唑仑注射液0.1～0.2 mg/kg、罗库溴铵注射液0.5～0.2 mg/kg、丙泊酚注射液1.5～2 mg/kg。使用成人可视喉镜经口行气管插管，导管型号为 6.0～6.5，连接氧袋，使用呼吸球囊控制呼吸（维持呼吸频率15～20 次/min、潮气量8～10 mL/kg、吸气与呼气比例1∶1.5～2）。麻醉维持：微量泵持续输注丙泊酚注射液4～10 mg/（kg·h）。
全身麻醉下取胸部正中切口，静脉注射肝素3～4 mg /kg，从上腔静脉取肝素化全血500～600 mL，用于灌注液配置；剪开心包，切断头臂干，插入8F主动脉插管，切断上腔静脉和右上肺静脉并回收血液，于主动脉根部灌注4℃ HTK液，灌停心脏后，切断降主动脉起始部和两大分支，游离心脏，经肺静脉和二尖瓣口置入引流管，倒置心脏以使左心减压。取下猪心后立即进行ECMO离体灌注。
1.3 ECMO灌注液配制
采集血液后即刻配制灌注液。钠钾镁钙葡萄糖注射液200 mL，羟乙基淀粉100 mL，甲强龙40 mg，注射用氨甲环酸1 g，注射用头孢唑林钠1 g，葡萄糖酸钙注射液2 g，环磷腺苷葡胺注射液120 mg，5%碳酸氢钠40 mL，预充膜肺和管道。排气完毕后，使用一次性去白细胞滤器过滤猪血500～600 mL，加入储血罐。
1.4 ECMO离体空跳猪心模型建立
使用一次性输血器和三通阀连接8F主动脉插管，使用0.9%氯化钠注射液500 mL，经主动脉根部冲洗离体猪心冠状动脉和心腔中的心脏停搏液（HTK液），避免髙钾导致供心复跳后出现心律失常等不良反应。ECMO管路、膜式氧合器预充排气后，连接猪心主动脉导管。将猪心置于与ECMO机连接的标本罐中，建立ECMO循环，沿主动脉根部冠状动脉口连续顺行性灌注氧合温血液，离体心脏复跳，维持灌注8 h。ECMO灌注血液运行路径为：储血罐→ECMO离心泵→膜式氧合器→主动脉插管→主动脉→左右冠状动脉→冠状静脉窦→右心房→右心室→离体猪心标本罐→储血罐。根据灌注压调整转速
图1
供心获取及ECMO离体空跳猪心模型建立
a：实验动物气管插管全身麻醉；b：心脏暴露；c：主动脉插管；d：血液获取；e：离体心脏获取；f：离体心脏ECMO循环；ECMO：体外膜肺氧合
1.5 指标检测
检测时间点：ECMO循环建立，猪心复跳时（T0），ECMO循环第1 h（T1）、第2 h（T2）、第3 h（T3）、第4 h（T4）、第5 h（T5）、第6 h（T6）、第7 h（T7）、第8 h（T8）。检测ECMO灌注压、灌注流量、氧浓度、氧流量、心率，记录血温变化、心脏复跳时间。检测血气指标：二氧化碳分压、氧分压、碱剩余及pH值。采用ELISA方法检测炎症因子：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，JM-01217P1），白介素（interleukin，IL）-6（JM-01252P1），IL-8（JM-01251P1）。采用日立7180心肌酶分析仪检测心肌损伤标志物：肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、肌红蛋白和肌钙蛋白含量。检测活化凝血时间（activated coagulation time，ACT）。
1.6 心肌组织形态学检测
于T0和T8两个时间点，使用一次性活组织取样钳取40～80 mg左心室心肌组织用于病理学检查。经组织包埋、切片、染色、封片等步骤制片，使用光学显微镜进行观察，选择目标区域拍照并分析。
1.7 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）描述，不同时间点的比较采用重复测量方差分析。检验水准α=0.05。
1.8 伦理审查
动物饲养、实验过程及实验后处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并获得广西中医药大学动物伦理委员会审批，审批号：DW20190305-047。
2 结果
2.1 血流动力学、血气变化
离体猪心在T0～T8时间点的血流动力学指标（心率、灌注压、灌注流量、氧浓度、氧流量）和血气指标（pH、二氧化碳分压、氧分压、碱剩余）差异均无统计学意义（P>0.05）；见表1。不同时间点ACT检测结果为
表1
20例离体猪心保存期间不同时间点血流动力学和血气变化（x±s）
2.2 电解质变化
离体猪心在T0～T8时间点的电解质（K+、Na+、Ca2+、Mg2+）差异均无统计学意义（P>0.05）；见表2。
表2
20例离体猪心保存期间不同时间点电解质变化（x±s，mmol/L）
2.3 炎症因子和心肌损伤指标变化
分别检测T0、T4、T8时间点的炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-8）和心肌损伤指标（CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白）变化。结果显示，各时间点的炎症因子含量差异无统计学意义（P>0.05），但心肌损伤相关蛋白含量逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01）；见表3～4。
表3
20例离体猪心保存期间不同时间点炎症因子和心肌损伤指标变化（x±s）
表4
心肌损伤指标的两时间点间比较
2.4 左心室心肌组织形态学变化
T0时点的心肌纤维排列整齐，染色均匀，细胞结构清晰无破坏，无炎性细胞浸润。与T0时间点比较，T8时间点的心肌结构变化不大，肌纤维排列依然整齐、紧密，未见明显断裂；胞质未见水肿，间质可见少量炎性细胞浸润。总体上心肌细胞损伤程度较轻；见图2。
图2
左心室心肌组织苏木精-伊红染色图（×200倍）
a：T0时间点的染色图；b：T8时间点的染色图
3 讨论
供心缺血时间及心肌质量是直接影响心脏移植成败及受者远期生存质量的关键因素。研究[8]表明，心脏移植供心缺血时间与术后心功能恢复及冠状动脉增殖病变发生风险均密切相关。供心缺血时间＞4 h是移植术后受体1个月死亡率升高的危险因素[9]。供心缺血时间是导致心肌质量下降的主要因素，因此，供心保存的关键在于缩短缺血时间，但供心保存的允许时间越长，越有利于供心的长途转运和扩大供心来源范围，进而缓解供心紧缺和移植手术的时间限制。因此，探索既能缩短供心缺血时间、提高供心质量，又能延长保存时间的供心保存方法，成为心脏移植领域的研究热点，也是亟待解决的关键技术。目前，临床上常用的心脏保存技术是SCS技术，但保存时间仅4～6 h，且保存期间供心处于冷缺血状态，供心保存质量并不理想。相比之下，机械灌注供心保存技术具有避免缺血导致不利影响的优势，因而成为值得探索的更优的供心保存技术。然而目前该技术还不成熟，临床应用有限。本研究利用ECMO机器作为体外氧合及灌注系统，采用广西巴马小型猪作为供体，构建体外氧合灌注空跳供心的保存模型，并对供心质量进行评价，研究结果显示，供心保存时间可达8 h以上，且供心质量良好。
3.1 迅速建立ECMO灌注模型，避免缺血性心肌损伤
本研究从供心摘取到建立ECMO灌注，平均用时5～8 min，即供心缺血状态仅持续5～8 min。已有研究[10]表明，缺血时间至少21 min后才会引起心肌损害，而缺血-再灌注损伤是在缺血27 min后再灌注时才会出现。故本研究的供心保存技术不存在缺血导致的缺血-再灌注损伤现象。这在心肌组织染色结果得到了证明，HE染色发现20例供心左心室心肌组织均无明显炎症浸润和细胞坏死。与目前临床上常用的SCS技术相比，具有明显的优势，可以提高供心保存质量。本研究中，3例猪心发生心室颤动，可能的原因有：（1）心肌细胞缺血、缺氧；（2）电解质紊乱；（3）酸碱平衡失调；（4）低温；（5）炎症反应。
3.2 去白细胞全血为主的灌注液更有利于心肌保护
在机械灌注供心保存技术中，灌注液即是心脏保护液。而无论是常规心脏手术中的心肌保护，还是心脏移植中的心脏保存，心脏保护液都起着十分关键的作用。在机械灌注供心保存中，其应用目的主要是维持心肌细胞的代谢需要，避免心肌损伤，保证术后心功能恢复。
目前，临床上应用最普遍的心脏保护液有UW液、HTK液以及Celsior液。UW液是具有较高渗透压和黏度的高钾溶液，应用于机械灌注时，组织水肿发生率比Celsior液低，但易导致心脏血管异常收缩。HTK液是一种低钠、低钙、微高钾且富含组氨酸的器官保存液，具有较强的缓冲能力，可减轻心肌细胞水肿。离体心脏中残留的HTK液会使整个灌注液中的钾离子水平升高，心脏复跳困难，故冲洗是必要的。Celsior液兼具UW液的渗透功效和HTK液的缓冲能力，但长时间保存易导致心肌水肿。目前尚无具有绝对优势的心肌保存液[11]。新型心肌保存液或改良保存液，如细胞外液型保存液Somah液、在Celsior液基础上发展起来的CRMB液以及HTK液基础上发展而来的Custodiol-N液，虽然从理论上有更多的优势和良好的心肌保护效果，但目前仍处于实验研究阶段，需进一步临床验证[12]。
本研究利用供体自身的去白细胞全血作为主体配置灌注液，具有以下优点：（1）以血液为基本成份，符合心肌细胞灌注的生理模式，为缺血的心肌组织提供了不同程度的血液供应；为心肌维持基本代谢提供全面的代谢底物，有利于供心保存期间的新陈代谢。（2）以血液为载体，含氧量高，能通过血红蛋白的携氧能力维持心肌有氧代谢，以达到心肌保护的作用。（3）灌注液中的胶体缓冲系统、生理水平的电解质有利于维持离子的正常分布以及酸碱平衡的稳定。（4）血液中的红细胞可改善心肌的微循环，对清除氧自由基等有害物质具有一定作用。（5）含血灌注液中的蛋白成分可提供胶体渗透压，即使长时间心脏停跳和反复多次保护液灌注，其中的晶体保护液灌入量仍较少，可避免大量液体造成水超负荷和组织水肿。（6）含血保护液可有效保护心脏收缩及舒张功能，在减轻心肌水肿方面具有积极意义[13-15]。
此外，本研究灌注液中还加入了羟乙基淀粉、甲强龙、氨甲环酸、头孢唑林钠、葡萄糖酸钙注射液、环磷腺苷葡胺、碳酸氢钠等，可提供能量和抗炎成分，不但充分保证了心肌代谢的能量需求，还可预防炎症的发生。
在体外循环过程中，血液成分与体外循环管道接触会刺激白细胞释放TNF和IL等细胞因子，激发炎性反应，可能会导致各种器官功能受损[16]，这也是供心机械灌注保存技术面临的挑战。若由于血液成分与体外循环管道接触而产生的炎症无法得到控制，则会造成心肌功能障碍，降低供心保存质量。本研究结果显示，T0、T4、T8时间点主要细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8水平差异无统计学意义，这表明本研究的灌注液在预防和抗炎方面是有效的，这与本研究HE染色结果一致。
3.3 ECMO灌注系统可提升供心质量并延长保存时间
本研究结果显示，T0～T8各血气指标差异均无统计学意义，这说明ECMO灌注系统不仅可以氧合血液、保证充足的血氧供应、维持心肌细胞氧合代谢和其他生理反应对氧的需求、减少无氧呼吸产生乳酸对心肌造成损伤，还可以排除灌注液中的二氧化碳、维持灌注液的酸碱平衡。同时，持续灌注冠状血管床，带走乳酸、腺苷等代谢产物，进而减轻细胞内酸中毒和黄嘌呤氧化酶所介导的缺血-再灌注损伤[17]。与SCS保存技术相比，既能保证氧供又能减轻乳酸等代谢产物对心肌造成的损伤。由于本研究实验仪器血气分析仪试剂包中缺乏乳酸检测，故未测定乳酸值，后续研究将把该指标纳入研究范围，以更全面地评估供心保存质量。
电解质的稳定对心功能的维持和心肌保护具有重要作用。低钠血症可导致心肌收缩功能下降，加重心力衰竭，从而导致心肌受损，心肌酶升高[18]；血清钠浓度>150 mmol/L将导致高钠血症[19]。本实验于心脏离体前采集猪血，所能采集血量仅约500～700 mL，除去加入储血罐的血量，无多余血液用于冲洗。使用0.9%氯化钠冲洗心脏，在心脏中的残留量少，约10 mL，不会引起高钠。产生高钠血症的原因可能有以下几点：（1）ECMO循环灌注预充液中加入钠钾镁钙葡萄糖注射液，导致氧合血灌注液钠离子含量增加；（2）预充液中的钠离子浓度与血清钠浓度不同，会引起血清钠浓度和细胞外液张力变化，导致高钠血症[20]。高渗细胞外液会造成细胞内液向细胞外转移，从而引起细胞脱水。同时，血清高钠会引起转化生长因子β水平升高，促使血管平滑肌细胞肥大，降低血管顺应性，造成心血管重构，引起外周血管阻力升高[21-22]。高钾血症可引起心脏传导系统受阻，导致心律失常、心脏骤停，从而引起心肌损伤，出现心肌酶升高[23]。低钙血症可引起心肌收缩功能下降，出现心律失常、心室颤动和心脏骤停等严重后果[24]；低镁血症可引起心脏传导减慢、心律失常和心脏骤停等严重后果[25]。因此，体外空跳离体供心的保存必须保持灌注液电解质处于平衡状态。而在供心保存期间必然会因血细胞凋亡、心肌细胞的生理活动导致灌注液中钠、钾、钙、镁离子的浓度发生变化。而本研究结果显示，T0～T8时间点的电解质水平均处于稳定状态。在ECMO运行期间可监测灌注液的电解质浓度，进而采取相应措施进行调节，保持灌注体系的内环境处于稳定状态，维持正常心肌功能的同时减少心肌损伤。
CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白是心肌损伤的标志物，在静息状态下主要存在于心肌或骨骼肌细胞内，当细胞受到损伤时，从细胞中释放入血，导致血液中的浓度升高[26-28]。本研究结果显示，T0～T8时间点灌注液中CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白的浓度差异有统计学意义，但心肌组织HE染色并未显示出明显的心肌坏死，说明供心的心肌损伤较轻，未产生器质性损坏。
综上所述，基于ECMO技术的体外空跳供心保存技术，是一种接近于生理状态的供心保存方法，具有减少供心缺血、保证氧和代谢底物供给、稳定灌注液中离子成分、抑制炎症反应的作用，进而起到保护心肌、保证供心质量、延长供心保存时间的作用，有利于临床供心转运和术前准备。此外，基于ECMO技术的供心保存技术不同于低温机械携氧灌注保存技术，其在灌注期间保持灌注液在34℃左右，属于NMP保存技术，在供心保存期间还可以随时对供心进行功能评估，有望提高移植成功率，延长受体的生存时间并提高生活质量。但在供心保存期间需注意灌注压、流量、流速、灌注液温度等参数的设置。
本研究尚处于动物实验阶段，需临床试验验证，且灌注液的血液成分来源于供体，这在实际临床应用中可能难以操作。因而在灌注液的全血来源上还需优化，比如采用与供体相同血型的全血替代等，这也是我们下一步的研究内容。
利益冲突：无。
作者贡献：银世杰负责论文设计，数据整理与分析，论文初稿撰写，供心保存监督；岳晓、王春华负责手术操作辅助，实验室检测，供心保存；武伟、覃冠斌、罗兰负责实验动物麻醉；黄强信负责手术操作获取供心；何贵新负责论文审阅及修改。
心脏移植是治疗终末期心脏疾病的重要手段，高质量的供心是移植成功的关键。国际心肺移植协会注册数据显示，截至2016年，亚洲心脏移植数量仅占全球的5.7%，供心短缺及供心缺血时间是制约心脏移植发展的最主要因素[1]。因此，保护有限的供心资源，使其在植入前保持良好的质量，对提高受者心脏移植术后近、远期疗效具有重要意义。
目前，供心保存有两种方法，一种是传统静态冷保存技术（static cold storage，SCS），这是依赖于心脏保存液的保存技术，心脏保持舒张期停跳状态，完全浸泡于低温器官保存液中[2]。但心脏保存液的安全时限均为4～6 h[3-4]，这限制了心脏移植手术的时间，同时也限制了供心选择范围。另一种是机械灌注保存技术，包括低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）和常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）。HMP是借助机械灌注心脏保存液，供心保存期间处于停搏状态，基本原理与传统心脏保存液相似[5]。NMP是机械灌注氧合血，供心在保存期间处于跳动状态，最大程度保证供心接近体内状态，避免缺血缺氧带来的不利影响[6]。机械灌注保存技术借助机械灌注保存液或氧合血，源源不断地提供能量底物，避免心肌组织局部代谢产物蓄积，减轻活性氧自由基对心肌的损伤[7]。
为进一步提高供心保存质量和延长保存时间，我中心采用广西巴马小型猪建立体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）离体空跳猪心保存模型，探讨离体空跳供心保存方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物和仪器
2022年1月—2023年8月，选取健康广西巴马小型猪（实验动物许可证号：SCXK桂2018-0003）20头，雌雄各半，体重25～30 kg，由广西大学动物实验中心提供。相关仪器：ECMO机（德国迈柯唯MAQUET Rotaflow），膜式氧合器（意大利Dideco 901），体外循环管道（天津市塑料研究所有限公司），变温水箱（德国STOCKERT公司 SⅢ型），血气分析仪（丹麦雷度ABL800 FLEX），100B-ACT检测仪（北京科仪诚科技开发中心）。
1.2 心脏摘取
实验动物手术前禁饮禁食8 h。麻醉药物、其他物品以及抢救器械准备完毕后，于猪臀部肌肉注射阿托品0.5 mg、咪达唑仑10 mg、艾司氯胺酮注射液1～2 mg/kg。基础麻醉后，用24G静脉留置针于猪耳缘处建立静脉通道并固定。通过耳缘静脉依次推注舒芬太尼注射液0.15～0.25 μg/kg、咪达唑仑注射液0.1～0.2 mg/kg、罗库溴铵注射液0.5～0.2 mg/kg、丙泊酚注射液1.5～2 mg/kg。使用成人可视喉镜经口行气管插管，导管型号为 6.0～6.5，连接氧袋，使用呼吸球囊控制呼吸（维持呼吸频率15～20 次/min、潮气量8～10 mL/kg、吸气与呼气比例1∶1.5～2）。麻醉维持：微量泵持续输注丙泊酚注射液4～10 mg/（kg·h）。
全身麻醉下取胸部正中切口，静脉注射肝素3～4 mg /kg，从上腔静脉取肝素化全血500～600 mL，用于灌注液配置；剪开心包，切断头臂干，插入8F主动脉插管，切断上腔静脉和右上肺静脉并回收血液，于主动脉根部灌注4℃ HTK液，灌停心脏后，切断降主动脉起始部和两大分支，游离心脏，经肺静脉和二尖瓣口置入引流管，倒置心脏以使左心减压。取下猪心后立即进行ECMO离体灌注。
1.3 ECMO灌注液配制
采集血液后即刻配制灌注液。钠钾镁钙葡萄糖注射液200 mL，羟乙基淀粉100 mL，甲强龙40 mg，注射用氨甲环酸1 g，注射用头孢唑林钠1 g，葡萄糖酸钙注射液2 g，环磷腺苷葡胺注射液120 mg，5%碳酸氢钠40 mL，预充膜肺和管道。排气完毕后，使用一次性去白细胞滤器过滤猪血500～600 mL，加入储血罐。
1.4 ECMO离体空跳猪心模型建立
使用一次性输血器和三通阀连接8F主动脉插管，使用0.9%氯化钠注射液500 mL，经主动脉根部冲洗离体猪心冠状动脉和心腔中的心脏停搏液（HTK液），避免髙钾导致供心复跳后出现心律失常等不良反应。ECMO管路、膜式氧合器预充排气后，连接猪心主动脉导管。将猪心置于与ECMO机连接的标本罐中，建立ECMO循环，沿主动脉根部冠状动脉口连续顺行性灌注氧合温血液，离体心脏复跳，维持灌注8 h。ECMO灌注血液运行路径为：储血罐→ECMO离心泵→膜式氧合器→主动脉插管→主动脉→左右冠状动脉→冠状静脉窦→右心房→右心室→离体猪心标本罐→储血罐。根据灌注压调整转速
图1
供心获取及ECMO离体空跳猪心模型建立
a：实验动物气管插管全身麻醉；b：心脏暴露；c：主动脉插管；d：血液获取；e：离体心脏获取；f：离体心脏ECMO循环；ECMO：体外膜肺氧合
1.5 指标检测
检测时间点：ECMO循环建立，猪心复跳时（T0），ECMO循环第1 h（T1）、第2 h（T2）、第3 h（T3）、第4 h（T4）、第5 h（T5）、第6 h（T6）、第7 h（T7）、第8 h（T8）。检测ECMO灌注压、灌注流量、氧浓度、氧流量、心率，记录血温变化、心脏复跳时间。检测血气指标：二氧化碳分压、氧分压、碱剩余及pH值。采用ELISA方法检测炎症因子：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，JM-01217P1），白介素（interleukin，IL）-6（JM-01252P1），IL-8（JM-01251P1）。采用日立7180心肌酶分析仪检测心肌损伤标志物：肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、肌红蛋白和肌钙蛋白含量。检测活化凝血时间（activated coagulation time，ACT）。
1.6 心肌组织形态学检测
于T0和T8两个时间点，使用一次性活组织取样钳取40～80 mg左心室心肌组织用于病理学检查。经组织包埋、切片、染色、封片等步骤制片，使用光学显微镜进行观察，选择目标区域拍照并分析。
1.7 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）描述，不同时间点的比较采用重复测量方差分析。检验水准α=0.05。
1.8 伦理审查
动物饲养、实验过程及实验后处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并获得广西中医药大学动物伦理委员会审批，审批号：DW20190305-047。
2 结果
2.1 血流动力学、血气变化
离体猪心在T0～T8时间点的血流动力学指标（心率、灌注压、灌注流量、氧浓度、氧流量）和血气指标（pH、二氧化碳分压、氧分压、碱剩余）差异均无统计学意义（P>0.05）；见表1。不同时间点ACT检测结果为
表1
20例离体猪心保存期间不同时间点血流动力学和血气变化（x±s）
2.2 电解质变化
离体猪心在T0～T8时间点的电解质（K+、Na+、Ca2+、Mg2+）差异均无统计学意义（P>0.05）；见表2。
表2
20例离体猪心保存期间不同时间点电解质变化（x±s，mmol/L）
2.3 炎症因子和心肌损伤指标变化
分别检测T0、T4、T8时间点的炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-8）和心肌损伤指标（CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白）变化。结果显示，各时间点的炎症因子含量差异无统计学意义（P>0.05），但心肌损伤相关蛋白含量逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01）；见表3～4。
表3
20例离体猪心保存期间不同时间点炎症因子和心肌损伤指标变化（x±s）
表4
心肌损伤指标的两时间点间比较
2.4 左心室心肌组织形态学变化
T0时点的心肌纤维排列整齐，染色均匀，细胞结构清晰无破坏，无炎性细胞浸润。与T0时间点比较，T8时间点的心肌结构变化不大，肌纤维排列依然整齐、紧密，未见明显断裂；胞质未见水肿，间质可见少量炎性细胞浸润。总体上心肌细胞损伤程度较轻；见图2。
图2
左心室心肌组织苏木精-伊红染色图（×200倍）
a：T0时间点的染色图；b：T8时间点的染色图
3 讨论
供心缺血时间及心肌质量是直接影响心脏移植成败及受者远期生存质量的关键因素。研究[8]表明，心脏移植供心缺血时间与术后心功能恢复及冠状动脉增殖病变发生风险均密切相关。供心缺血时间＞4 h是移植术后受体1个月死亡率升高的危险因素[9]。供心缺血时间是导致心肌质量下降的主要因素，因此，供心保存的关键在于缩短缺血时间，但供心保存的允许时间越长，越有利于供心的长途转运和扩大供心来源范围，进而缓解供心紧缺和移植手术的时间限制。因此，探索既能缩短供心缺血时间、提高供心质量，又能延长保存时间的供心保存方法，成为心脏移植领域的研究热点，也是亟待解决的关键技术。目前，临床上常用的心脏保存技术是SCS技术，但保存时间仅4～6 h，且保存期间供心处于冷缺血状态，供心保存质量并不理想。相比之下，机械灌注供心保存技术具有避免缺血导致不利影响的优势，因而成为值得探索的更优的供心保存技术。然而目前该技术还不成熟，临床应用有限。本研究利用ECMO机器作为体外氧合及灌注系统，采用广西巴马小型猪作为供体，构建体外氧合灌注空跳供心的保存模型，并对供心质量进行评价，研究结果显示，供心保存时间可达8 h以上，且供心质量良好。
3.1 迅速建立ECMO灌注模型，避免缺血性心肌损伤
本研究从供心摘取到建立ECMO灌注，平均用时5～8 min，即供心缺血状态仅持续5～8 min。已有研究[10]表明，缺血时间至少21 min后才会引起心肌损害，而缺血-再灌注损伤是在缺血27 min后再灌注时才会出现。故本研究的供心保存技术不存在缺血导致的缺血-再灌注损伤现象。这在心肌组织染色结果得到了证明，HE染色发现20例供心左心室心肌组织均无明显炎症浸润和细胞坏死。与目前临床上常用的SCS技术相比，具有明显的优势，可以提高供心保存质量。本研究中，3例猪心发生心室颤动，可能的原因有：（1）心肌细胞缺血、缺氧；（2）电解质紊乱；（3）酸碱平衡失调；（4）低温；（5）炎症反应。
3.2 去白细胞全血为主的灌注液更有利于心肌保护
在机械灌注供心保存技术中，灌注液即是心脏保护液。而无论是常规心脏手术中的心肌保护，还是心脏移植中的心脏保存，心脏保护液都起着十分关键的作用。在机械灌注供心保存中，其应用目的主要是维持心肌细胞的代谢需要，避免心肌损伤，保证术后心功能恢复。
目前，临床上应用最普遍的心脏保护液有UW液、HTK液以及Celsior液。UW液是具有较高渗透压和黏度的高钾溶液，应用于机械灌注时，组织水肿发生率比Celsior液低，但易导致心脏血管异常收缩。HTK液是一种低钠、低钙、微高钾且富含组氨酸的器官保存液，具有较强的缓冲能力，可减轻心肌细胞水肿。离体心脏中残留的HTK液会使整个灌注液中的钾离子水平升高，心脏复跳困难，故冲洗是必要的。Celsior液兼具UW液的渗透功效和HTK液的缓冲能力，但长时间保存易导致心肌水肿。目前尚无具有绝对优势的心肌保存液[11]。新型心肌保存液或改良保存液，如细胞外液型保存液Somah液、在Celsior液基础上发展起来的CRMB液以及HTK液基础上发展而来的Custodiol-N液，虽然从理论上有更多的优势和良好的心肌保护效果，但目前仍处于实验研究阶段，需进一步临床验证[12]。
本研究利用供体自身的去白细胞全血作为主体配置灌注液，具有以下优点：（1）以血液为基本成份，符合心肌细胞灌注的生理模式，为缺血的心肌组织提供了不同程度的血液供应；为心肌维持基本代谢提供全面的代谢底物，有利于供心保存期间的新陈代谢。（2）以血液为载体，含氧量高，能通过血红蛋白的携氧能力维持心肌有氧代谢，以达到心肌保护的作用。（3）灌注液中的胶体缓冲系统、生理水平的电解质有利于维持离子的正常分布以及酸碱平衡的稳定。（4）血液中的红细胞可改善心肌的微循环，对清除氧自由基等有害物质具有一定作用。（5）含血灌注液中的蛋白成分可提供胶体渗透压，即使长时间心脏停跳和反复多次保护液灌注，其中的晶体保护液灌入量仍较少，可避免大量液体造成水超负荷和组织水肿。（6）含血保护液可有效保护心脏收缩及舒张功能，在减轻心肌水肿方面具有积极意义[13-15]。
此外，本研究灌注液中还加入了羟乙基淀粉、甲强龙、氨甲环酸、头孢唑林钠、葡萄糖酸钙注射液、环磷腺苷葡胺、碳酸氢钠等，可提供能量和抗炎成分，不但充分保证了心肌代谢的能量需求，还可预防炎症的发生。
在体外循环过程中，血液成分与体外循环管道接触会刺激白细胞释放TNF和IL等细胞因子，激发炎性反应，可能会导致各种器官功能受损[16]，这也是供心机械灌注保存技术面临的挑战。若由于血液成分与体外循环管道接触而产生的炎症无法得到控制，则会造成心肌功能障碍，降低供心保存质量。本研究结果显示，T0、T4、T8时间点主要细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8水平差异无统计学意义，这表明本研究的灌注液在预防和抗炎方面是有效的，这与本研究HE染色结果一致。
3.3 ECMO灌注系统可提升供心质量并延长保存时间
本研究结果显示，T0～T8各血气指标差异均无统计学意义，这说明ECMO灌注系统不仅可以氧合血液、保证充足的血氧供应、维持心肌细胞氧合代谢和其他生理反应对氧的需求、减少无氧呼吸产生乳酸对心肌造成损伤，还可以排除灌注液中的二氧化碳、维持灌注液的酸碱平衡。同时，持续灌注冠状血管床，带走乳酸、腺苷等代谢产物，进而减轻细胞内酸中毒和黄嘌呤氧化酶所介导的缺血-再灌注损伤[17]。与SCS保存技术相比，既能保证氧供又能减轻乳酸等代谢产物对心肌造成的损伤。由于本研究实验仪器血气分析仪试剂包中缺乏乳酸检测，故未测定乳酸值，后续研究将把该指标纳入研究范围，以更全面地评估供心保存质量。
电解质的稳定对心功能的维持和心肌保护具有重要作用。低钠血症可导致心肌收缩功能下降，加重心力衰竭，从而导致心肌受损，心肌酶升高[18]；血清钠浓度>150 mmol/L将导致高钠血症[19]。本实验于心脏离体前采集猪血，所能采集血量仅约500～700 mL，除去加入储血罐的血量，无多余血液用于冲洗。使用0.9%氯化钠冲洗心脏，在心脏中的残留量少，约10 mL，不会引起高钠。产生高钠血症的原因可能有以下几点：（1）ECMO循环灌注预充液中加入钠钾镁钙葡萄糖注射液，导致氧合血灌注液钠离子含量增加；（2）预充液中的钠离子浓度与血清钠浓度不同，会引起血清钠浓度和细胞外液张力变化，导致高钠血症[20]。高渗细胞外液会造成细胞内液向细胞外转移，从而引起细胞脱水。同时，血清高钠会引起转化生长因子β水平升高，促使血管平滑肌细胞肥大，降低血管顺应性，造成心血管重构，引起外周血管阻力升高[21-22]。高钾血症可引起心脏传导系统受阻，导致心律失常、心脏骤停，从而引起心肌损伤，出现心肌酶升高[23]。低钙血症可引起心肌收缩功能下降，出现心律失常、心室颤动和心脏骤停等严重后果[24]；低镁血症可引起心脏传导减慢、心律失常和心脏骤停等严重后果[25]。因此，体外空跳离体供心的保存必须保持灌注液电解质处于平衡状态。而在供心保存期间必然会因血细胞凋亡、心肌细胞的生理活动导致灌注液中钠、钾、钙、镁离子的浓度发生变化。而本研究结果显示，T0～T8时间点的电解质水平均处于稳定状态。在ECMO运行期间可监测灌注液的电解质浓度，进而采取相应措施进行调节，保持灌注体系的内环境处于稳定状态，维持正常心肌功能的同时减少心肌损伤。
CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白是心肌损伤的标志物，在静息状态下主要存在于心肌或骨骼肌细胞内，当细胞受到损伤时，从细胞中释放入血，导致血液中的浓度升高[26-28]。本研究结果显示，T0～T8时间点灌注液中CK、CK-MB、肌红蛋白和肌钙蛋白的浓度差异有统计学意义，但心肌组织HE染色并未显示出明显的心肌坏死，说明供心的心肌损伤较轻，未产生器质性损坏。
综上所述，基于ECMO技术的体外空跳供心保存技术，是一种接近于生理状态的供心保存方法，具有减少供心缺血、保证氧和代谢底物供给、稳定灌注液中离子成分、抑制炎症反应的作用，进而起到保护心肌、保证供心质量、延长供心保存时间的作用，有利于临床供心转运和术前准备。此外，基于ECMO技术的供心保存技术不同于低温机械携氧灌注保存技术，其在灌注期间保持灌注液在34℃左右，属于NMP保存技术，在供心保存期间还可以随时对供心进行功能评估，有望提高移植成功率，延长受体的生存时间并提高生活质量。但在供心保存期间需注意灌注压、流量、流速、灌注液温度等参数的设置。
本研究尚处于动物实验阶段，需临床试验验证，且灌注液的血液成分来源于供体，这在实际临床应用中可能难以操作。因而在灌注液的全血来源上还需优化，比如采用与供体相同血型的全血替代等，这也是我们下一步的研究内容。
利益冲突：无。
作者贡献：银世杰负责论文设计，数据整理与分析，论文初稿撰写，供心保存监督；岳晓、王春华负责手术操作辅助，实验室检测，供心保存；武伟、覃冠斌、罗兰负责实验动物麻醉；黄强信负责手术操作获取供心；何贵新负责论文审阅及修改。
