随着CT分辨率的提高和公众健康意识的增强，肺结节（pulmonary nodules，PN）检出人群激增，在我国的检出率为20%~80%[1]。肺结节是肺癌早期表现形式之一，有30%~40%的肺结节最终发展为肺癌[2]，实现超早期、精准诊疗肺结节是肺癌防治的有效路径和关键策略[3]。然而，现阶段以CT检查为主的肺结节随访管理不仅存在接受不必要的辐射等风险，过度诊疗也加重了患者的心理压力和社会经济负担。因此，在无创层面不断拓展新的肺结节诊疗路径成为近年来诸多团队持续探索的前沿与热点，具有重要的临床意义和应用前景。
大量临床研究表明，中医药能有效干预肺结节[4-6]。《肺结节中西医结合全程管理专家共识》的发布，进一步明确了中医药在肺结节诊疗中优势作用[7]。在肺结节的中医诊疗体系中，辨证论治是核心策略，而证素辨证则是这一策略的核心所在[8]。证素辨证以证候为基，从宏观表征层面认识肺结节患者机体状态，目前尚缺乏可将其量化的微观指标[9]。随着16S rRNA等微生物测序技术的不断发展，微生物在健康与疾病方面的重要作用日益凸显，微生物组在健康和疾病中到底扮演了什么样的角色？这一话题作为全世界最前沿的125个科学问题之一，受到持续广泛关注[10]。Science、Nature等顶级期刊研究均证明口腔菌群作为肺部微生物主要来源，参与塑造了包括肺癌在内的多种疾病的发生和发展[11-13]。课题组前期聚焦于肺癌这一重大疾病前期状态-肺结节，基于16S rRNA测序技术在属水平层面亦证实了唾液微生物具有作为肺结节诊断生物标志物的潜力[14]。
证素高度概括疾病外在表征，微生物反映机体内在变化，两者是疾病发展演变同一状态下不同层面的宏微观具象[15]。深入探究中医证素与微生物之间的相关性，有利于辨识病证的发生发展及病情转归。近年来，诸多团队也积极探索了二者的生物学相关性。黄伟荣团队[16]发现慢性萎缩性胃炎C-3阶段阴虚与普雷沃菌属（Prevotella）呈正相关，这可能是因为雷沃菌属（Prevotella）过量定植会促进炎症反应；沈睿等[17]研究指出“脾胃虚弱型”胃癌患者舌苔菌落中芽孢杆菌（Bacillus）显著富集，这可能与芽孢杆菌属（Bacillus）促进胃肠黏膜炎症，损伤胃肠功能有关。然而，聚焦肺结节，其唾液微生物与中医证素之间的潜在相关性目前尚缺乏研究证据。
因此，本研究以肺结节患者为研究对象，采集患者证素信息，分析肺结节患者中医证素分布及唾液菌群特征，采用排序回归分析、Mantel test分析、Spearman相关性分析等多级关联分析方法探索两者的相关性，以期为肺结节的中医证素辨证提供客观化生物学依据，亦对肺结节疾病的风险预警、靶向治疗、疗效评价提供新思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象
研究对象来自成都中医药大学附属医院、四川省肿瘤医院及成都市中西医结合医院2022年7月—2023年3月收治的符合诊断、纳入及排除标准的受试者。所有受试者均已签署书面知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 西医诊断标准
参照《肺结节诊治中国专家共识（2018年版）》中肺结节诊断标准[18]：影像学表现为直径≤3 cm的局灶性、类圆形、密度增高的实性或亚实性肺部阴影，可为孤立性或多发性，不伴肺不张、肺门淋巴结肿大和胸腔积液。
1.2.2 中医证素辨证标准
参照朱文锋教授《证素辨证学》中的证素诊断标准[19]，根据收集的中医四诊信息，将同一证素对应的所有症状-证素权重相加，从而得到证素权重积分；然后通过权重积分与阈值关系确定证素。
1.2.3 受试者纳入标准
（1）肺结节患者具有明确的胸部CT影像学异常，符合肺结节诊断标准；（2）健康人胸部CT影像学无肺结节及其他肺部异常现象；（3）无其他肿瘤病史；（4）无呼吸系统相关手术史；（5）年龄18～80岁，性别不限；（6）自愿同意参加本研究。
1.2.4 受试者排除标准
（1）患有恶性肿瘤、其他呼吸系统疾病（肺炎、肺结核等）以及其他严重的心血管、内分泌、血液系统等疾病；（2）有自身免疫性疾病病史，或长期免疫抑制剂使用史；（3）有未经治疗的传染性疾病病史；（4）患有口腔疾病等合并疾病；（5）近1个月内使用过抗生素类药物、酸奶等；（6）存在严重的精神障碍（感知障碍、思维障碍等）者。
1.2.5 信息与中医证素采集
查阅万方、维普、知网等数据库中与肺结节相关的中医文献，结合《中医诊断学》、《中医内科学》等教材中与本病相关的症状和体征，统计得到肺结节的常见症状，参照既往肺结节中医证素分布特征的研究[20]，制作肺结节中医证素采集表，记录患者一般信息（性别、年龄、吸烟史）以及肺结节信息与四诊信息。四诊信息采集由经培训过的中医专业的研究人员肺结节中医证素采集表根据进行临床信息采集。舌苔、脉象由课题组2名中医主任医师共同判定，如实记录。以朱文锋教授《证素辨证学》中“证候辨证素量表”制成证候辨证素计算Excel数据库，列出肺结节中医证素采集表中症状与体征对应证素的不同权值，累加分值并以分值≥70提取证素。
1.2.6 唾液样本采集
受试者身体前倾，头微低，微张口，由采样者将无菌EP管置于受试者下唇部，使唾液自然流入管中，采集非刺激性唾液2～3 mL，予干冰保存，4 h内转运至实验室−80 ℃冰箱等待后续试验。
1.2.7 唾液菌群16S rRNA检测
（1）唾液微生物DNA抽提与质检：根据制造商（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行唾液微生物群落总基因组DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测对提取的唾液基因组DNA进行质检，使用NanoDrop2000（美国Thermo Scientific公司）对DNA浓度、纯度进行定量检测。（2）PCR扩增和测序文库构建：以提取出的唾液微生物群落总基因组DNA为模板，对基因的V3-V4可变区使用携带Barcode序列的上游引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）进行PCR扩增（PCR仪：ABI GeneAmp®
1.3 数据处理与统计学分析
菌群α多样性指数（Sobs）由mothur软件计算分析。Beta多样性指数采用基于Bray-Curtis算法的主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）方法进行分析，菌群多样性分析使用R软件（version 3.6.2）对结果进行可视化呈现。菌群结构分析运用R软件（version 3.6.2）进行分析与绘制物种分析Venn图，群落Bar图、共线性网络图则通过Python 2.7进行数据分析和图片绘制。采用R软件（version 3.6.2）进行Wilcoxon秩和检验及线性判别分析（Lineardiscriminant Analysis Effect Size，LEfSe；
运用SPSS26.0版本对数据进行统计分析，连续变量若呈正态分布，则以均数±标准差（x±s）表示，并使用独立样本Student’s t检验进行组间比较；若为非正态分布，则以中位数（四分位数间距）［M（IQR）］表示，并使用Wilcoxon符号秩和检验进行组间比较。计数资料以频数、百分比表示，组间比较采用χ2检验、Fisher精确检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
本研究已获成都中医药大学附属医院伦理委员会审查批准（批准号：2022KL-051），并在中国临床试验注册中心注册（注册号：ChiCTR2200062140）。
2 结果
2.1 受试者临床特征
本研究共纳入肺结节患者173例，男69例（32.4%）、女104例（48.8%），中位年龄是45（32，55）岁。健康人40名，男12名、女28名，男女比例为1∶2.33，中位年龄42（33，48）岁。肺结节组（PN）和健康对照组（HC）组间比较结果见表1，除吸烟史之外，在年龄、性别基线特征方面，两组间差异均无统计学意义。
表1
两组受试者临床特征［例（%）/M（IQR）］
2.2 肺结节患者和健康人群的病位证素分布差异
PN组中病位证素根据例数从多到少排序，依次是：肺（90）、肝（79）、脾（45）、肾（45）、表（33）、心（26）和大肠（10）。HC组中病位证素例数最多的是肺（9）和脾（9），其次是肝（7）、肾（2）、表（2）、心（1）和大肠（1）。
两组病位证素在肺、肝、肾、表、心的分布差异具有统计学意义（P<0.05），其中肺结节患者的比例均更高。两组在脾、大肠的病位证素分布差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
表2
健康人群和肺结节患者病位证素分布差异［例（%）］
2.3 肺结节患者和健康人群的病性证素分布差异
肺结节患者中病性证素例数最多是阴虚（97），其次是痰（92）、气滞（82）、气虚（78）、湿（79）、血虚（63）、阳虚（52）、热（33）、瘀（31）、寒（21）、饮（13）、燥（10）。健康人群中例数从多到少排序，依次是：湿（11）、气虚（8）、痰（8）、气滞（8）、阳虚（7）、寒（6）、阴虚（5）、血虚（3）、饮（3）、瘀（1）、燥（0）。
肺结节患者和健康人群病性证素在阴虚、痰、气滞、气虚、湿、血虚、热、瘀的分布差异有统计学意义（P<0.05），且肺结节患者以上证素占比更高。两组病性证素在阳虚、寒、饮、燥的分布差异无统计学意义（P>0.05），见表3。
表3
健康人和肺结节患者病性证素分布差异［例（%）］
2.4 肺结节患者与健康人群唾液菌群分析
α多样性分析与β多样性分析结果提示肺结节患者口腔唾液菌群物种丰富度高于健康人群，两组之间唾液菌群相似性不同（P<0.05，图1a、b）。其中，PN组独有物种188个，HC组有33个独有物种（图1c）。物种组成层面，链球菌属（Streptococcus）、罗氏菌属（Rothia）、奈瑟菌属（Neisseria）、普雷沃菌属（Prevotella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、韦荣球菌属（Veillonella）、放线菌属（Actinomyces）、纤毛菌属（Leptotrichia）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、孪生球菌属（Gemella）为两组属水平相对丰度前10的物种（图1d、e）。基于Wilcoxon秩和检验的组间比较结果（图1f，P<0.05）和LEfSe的判别分析（图1g，LDA>3）双重验证显示，PN组显著富集的菌属包括：普雷沃菌（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）和TM7x；HC组中主要富集的菌属为奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）、放线杆菌属（Actinobacillus）、劳特罗普氏菌属（Lautropia）和团聚杆菌属（Aggregatibacter）。
图1
肺结节患者与健康人群唾液菌群分析结果
a：PN组与HC组Sobs指数线箱图；b：PN组与HC组PCoA散点图；c：PN组和HC组群落Bar图；d： PN组和HC组群落Venn图；e：PN组与HC组共线性网络图；f：基于Wilcoxon秩和检验的PN组和HC组物种差异分析；g：基于LEfSe分析的PN组和HC组物种差异分析
2.5 中医证素分布与唾液菌群相关性分析
考虑到与群落分布相关的环境因素复杂、多样，运用VIF分析筛选出独立性较强的环境因子。结果显示，19种证素环境因子在识别前后，其VIF值均＜10，因此各变量之间没有明显的多重共线性问题，可进行回归分析；见表4。
表4
VIF方差膨胀因子共线性分析
将单个病性、病位证素与唾液菌群β多样性做排序回归分析，由图2可知19个证素与唾液样本群落组成差异具有相关性。其中，病位-肺、病性-阴虚对唾液样本群落组成差异多样性具有显著性影响（P<0.05）。
图2
证素与唾液菌群β多样性排序回归分析
Mantel test分析是检验环境因子与菌群结构相关关系的非参数统计方法。由表5可知，证素与唾液菌群组成具有相关性（P<0.05）。进一步进行Mantel test网络热图分析，病位-肺，病性-阴虚对肺结节患者唾液菌群结构组成呈正相关（P<0.05）；见图3a。
表5
Mantel test分析
图3
证素与具体唾液微生物群落组成相关性分析
a：证素与唾液菌群的网络热图分析；b：基于Bray-Curtis距离的db-RDA分析；c：基于Spearman相关性分析的Heatmap图；d：证素与唾液菌群的VPA分析；e：证素与唾液菌群的Procrustes分析
基于Bray-Curtis距离算法进行db-RDA分析评估证素对唾液菌群群落组成的影响，全部样本点聚类形成了两个cluster（图3b）。进一步的统计相关性系数及显著性检验结果显示，病位-心、肺；病性-阴虚、痰、湿、饮和与唾液微生物群落组成具有显著相关性；见表6。
表6
db-RDA环境因子分析
为探讨证素与具体唾液微生物群落组成相关性，采用Spearman相关性分析计算唾液优势菌属与证素分布之间的相关性，相关性Heatmap图显示（图3c）：病位-肺与普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）呈正相关（r=0.23，P<0.01；r=0.21，P<0.01），与梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.19，P<0.01）。病性-阴虚与卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）呈正相关（r=0.17，P<0.05；r=0.23，P<0.01），与梭杆菌属（Fusobacterium）、韦荣氏球菌属（Veillonella）呈负相关（r=−0.25，P<0.01；r=−0.20，P<0.01）。病性-痰与罗氏菌属（Rothia）呈正相关（r=0.14，P<0.05），与梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.21，P<0.01）。病性-湿与罗氏菌属（Rothia）呈正相关（r=0.15，P<0.05），与嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.15，P<0.05；r=−0.15，P<0.05）。
病位、病性证素不仅与唾液菌群群落组成具有相关性，通过VPA分析发现证素还对唾液微生物菌群结构变化具有一定解释度，见图3d；Procrustes分析进一步证实证素的变化与微生物变化具有一致性（M2=0.015，P<0.05）；见图3e。
3 讨论
3.1 中医证素分布结果与目前中医对肺结节病因病机的认知相符
肺结节的主要病位证素在肺。肺为华盖，居胸中，主气司呼吸，其宣发肃降功能调畅一身气机。“百病皆生于气”，气与津液、血液等有形物质的运行密切相关，肺宣发肃降功能失常是肺结节形成的关键病机。肺通调水道依赖于肺气宣发与肃降，宣降失司则水液代谢失常，不能及时布散，停于肺络为积；痰留日久，影响肺朝百脉，血行不畅而为瘀，痰瘀互结于肺络，推动肺结节演进。肺结节仅次于肺病位中医证素的是肝。一方面，肝主一身之气机疏泄，气机正常的升降出入需要肝发挥疏泄功能协同肺宣发肃降共同完成；另一方面，现代快节奏生活方式影响下，学习、工作等竞争愈发激烈，焦虑、抑郁等不良情绪极易产生，情志不畅则肝气郁结，木火刑金致肺气郁闭，肺内浊气停聚壅滞，为肺结节的发生提供条件。在病性证素方面，阴虚、痰病性证素排在前二。肺结节第一病性证素是阴虚。一方面可能是因为是阴虚体质的患者本身是肺结节易感体质[21]，另一方面，烟草、雾霾等有毒气体或环境污染易伤肺阴，导致肺阴亏虚，燥热内生，炼津成痰成瘀。痰是肺结节次要病性证素。《医林绳墨·积聚》云：“积者阴也……症之所因，皆因痰之所起，气之所结耳……积者，痰之积也”。痰属阴，为有形之邪，在肺结节形成过程中扮演了重要角色。或因肺失宣肃通调水道失司，或因脾虚无法散津液，或因肾虚无法温化水液皆可致水液停聚为痰，日久成积。肺、肝为主要病位证素，阴虚、痰为重要病性证素，本研究中的的中医证素分布结果与目前中医对肺结节病因病机的认知相符[7]。
3.2 唾液微生物对肺结节诊疗具有潜在价值
随着测序技术的发展，唾液微生物作为体液标志物在鉴别肺癌与健康人、肺癌与肺部良性病变等方面的潜力已经被证实[22-23]。我们研究结果表明：与HC组相比，PN组唾液样本中主要富集的菌属有：普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）和TM7x。肺结节作为肺癌的早期表现，虽然目前尚缺乏口腔微生物对肺结节发病机制的作用研究，但口腔微生物与肺癌发生发展的关系已被广泛报道。多项流行病学的证据表明，口腔微生态紊乱的人群患肺癌概率增加[24-25]。普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）、等口腔致病菌可通过吸入、血行转移入肺内，影响微环境稳态，引起细胞增殖凋亡，免疫炎性反应，促进肺癌细胞侵袭转移[26-30]。现代研究证实卟啉单胞菌属（Porphyromonas）中的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展相关[31]。一方面，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）可通过增加促炎因子表达，促进有利于癌症形成与发展的炎症环境[32]；另一方面，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）还具有免疫抑制能力，驱动巨噬细胞极化为促肿瘤M2肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表型[33]，同时能调节p53功能，促进癌细胞的生存和增殖[34-35]。据此推断牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）可能促进肺结节癌转化。综合文献阅读及研究成果可见，唾液菌群失调可能推动肺结节恶性演进，对特定菌群的动态监测或可作为未来肺结节和肺癌早期筛查及诊断的重要依据，同时也为利用靶向微生物制剂或微生物移植等手段进行肺结节防治提供了新的切入点。
3.3 肺结节患者中医证素与唾液菌群特征具有相关性
既往研究证实微生物与慢性萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、肝硬化等疾病的中医证素紧密关联[36-37]，表明微生物可作为中医证素客观化指标的潜力。我们的相关性分析结果亦显示肺结节患者证素分布与唾液菌群特征具有显著相关性：在属水平6个优势菌属中，普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病位-肺呈正相关，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）与病性-阴虚呈正相关。李杲亦直言“肺主卫”，肺卫之气，其与人体抵御病邪的能力有密切关系。中医之“卫气”与现代医学中的免疫系统概念与与不谋而合，其实质可与免疫细胞来源、分布、功能一一对应[38]。大量研究表明，口腔微生物与免疫微环境密切相关。如Wen等[39]发现普雷沃氏菌属（Prevotella）可能通过诱导肠道上皮细胞环状核苷酸分泌来调节先天免疫系统及适应性免疫系统。Chopra[40]等发现牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）通过释放大量黏附素调节中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞（Th1/Th2/Th17）以调控宿主免疫反应。可见，普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病性-肺关联，既直接参与肺部感染、肺癌等肺部疾病发生发展[41-42]，又能够影响与肺紧密关联的免疫系统（卫气）。
阴虚证在病理方面往往表现出炎症因子增加，相关信号通路激活等特征[43]，同时炎症反应在临床中通常可表现为发热、红、肿、热痛等一派“火旺”之象，火易迫津外泄、消灼阴液，体内津液耗伤则阴虚。因此，炎症属中医“阴虚”范畴。而口腔微生物与机体炎症反应同样有密切的关系。我们研究显示，颗粒链球菌属（Granulicatella）与病性-阴虚呈正相关。其不仅与口腔黏膜炎、牙周炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等炎性疾病潜在关联[44-46]，还是IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的有效诱导剂[47]。卟啉单胞菌属（Porphyromonas）不仅与肺结节主要病位证素-肺存在关联，还与主要病性证素-阴虚具有相关性，因此具有双重关联性的卟啉单胞菌属（Porphyromonas）对于探讨中医证素与唾液菌群特征的相关性更具代表性。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与炎症的发生发展紧密关联[32]。其既能通过Toll样受体4（TLR-4）识别自身细菌外膜LPS成分，刺激MyD 88依赖性和非依赖性途径，释放NF-κB，导致促炎细胞因子的产生，形成炎症环境[48]；又可通过Toll样受体2（TLR-2）诱导人支气管上皮细胞和咽上皮细胞中IL-6和IL-8 mRNA表达，促进促炎细胞因子的产生，诱导炎症环境形成[49]。炎症微环境在肺结节的发生发展中占据重要地位，50%的肺结节病理因素由炎症引起[50]。由此可见，唾液微生物与肺结节中医证素之间存在密切生物学关联，口腔微生物的丰度变化或可作为肺结节患者证素的客观量化指标。
本研究的局限性及研究展望总结如下：（1）样本量有待进一步扩大：本研究作为研究团队关于微生物与肺结节（microbiome with pulmonary nodule，MCEPN）系列研究的先导性成果，前期我们共收集了213例临床样本，样本量有限。目前研究团队正持续开展多中心、大样本研究，同步进行追踪随访，后续将从结节大小、密度、良恶性等多角度对肺结节的生物学特征进行刻画。（2）微生物多样性分析技术有限：基于16S rRNA高通量测序的生物信息学分析，虽能够显示肺结节疾病的微生物群落物种组成、物种丰度、富集菌属，但并未细化到菌种水平、基因及蛋白质的功能，我们目前正在结合宏基因组、蛋白质组学、代谢组学等多组学技术，进一步研究“微生物-宿主”间的相互作用。（3）作用机制有待进一步阐明：本研究对唾液微生物与肺结节的发病机制的探索是初步和预测的，研究团队正在基于类器官和基因编辑技术，积极探索并构建多基因联合驱动的肺结节动物模型，开展基础实验深入解析肺结节疾病演进背后复杂的作用机制，进一步明确唾液微生物群影响肺结节疾病状态的关键途径，以期深入探索中医药通过靶向唾液菌群阻延肺结节恶性演进的确切效应，为肺结节及早期肺癌的诊疗提供新的切入点。
肺结节患者和健康人群在肺、肝、阴虚、痰、湿等证素的分布存在差异，在卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、普雷沃菌属（Prevotella）等唾液菌群的物种丰度组成方面有所不同。其中，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病位-肺、病性-阴虚具有显著双重关联性，其丰度变化或可作为阴虚型肺结节患者症候改善的微观指标。包括卟啉单胞菌属（Porphyromonas）在内的唾液微生物组具有作为监测肺结节患者疾病状态变化的无创性生物标志物的潜力，亦可成为肺结节中医证素客观化的量化指标。
利益冲突：无。
作者贡献：向红霞和何佳玮负责数据分析，论文设计和初稿撰写及修改；谭施言、付西负责数据采集，统计分析；由凤鸣负责论文设计和审阅、对编辑部的意见进行核修；由丽婷、石薇负责数据整理和分析；任益锋和马琼负责研究方案制定及指导，文章的知识性内容审阅与修改、对编辑部的意见进行核修。
随着CT分辨率的提高和公众健康意识的增强，肺结节（pulmonary nodules，PN）检出人群激增，在我国的检出率为20%~80%[1]。肺结节是肺癌早期表现形式之一，有30%~40%的肺结节最终发展为肺癌[2]，实现超早期、精准诊疗肺结节是肺癌防治的有效路径和关键策略[3]。然而，现阶段以CT检查为主的肺结节随访管理不仅存在接受不必要的辐射等风险，过度诊疗也加重了患者的心理压力和社会经济负担。因此，在无创层面不断拓展新的肺结节诊疗路径成为近年来诸多团队持续探索的前沿与热点，具有重要的临床意义和应用前景。
大量临床研究表明，中医药能有效干预肺结节[4-6]。《肺结节中西医结合全程管理专家共识》的发布，进一步明确了中医药在肺结节诊疗中优势作用[7]。在肺结节的中医诊疗体系中，辨证论治是核心策略，而证素辨证则是这一策略的核心所在[8]。证素辨证以证候为基，从宏观表征层面认识肺结节患者机体状态，目前尚缺乏可将其量化的微观指标[9]。随着16S rRNA等微生物测序技术的不断发展，微生物在健康与疾病方面的重要作用日益凸显，微生物组在健康和疾病中到底扮演了什么样的角色？这一话题作为全世界最前沿的125个科学问题之一，受到持续广泛关注[10]。Science、Nature等顶级期刊研究均证明口腔菌群作为肺部微生物主要来源，参与塑造了包括肺癌在内的多种疾病的发生和发展[11-13]。课题组前期聚焦于肺癌这一重大疾病前期状态-肺结节，基于16S rRNA测序技术在属水平层面亦证实了唾液微生物具有作为肺结节诊断生物标志物的潜力[14]。
证素高度概括疾病外在表征，微生物反映机体内在变化，两者是疾病发展演变同一状态下不同层面的宏微观具象[15]。深入探究中医证素与微生物之间的相关性，有利于辨识病证的发生发展及病情转归。近年来，诸多团队也积极探索了二者的生物学相关性。黄伟荣团队[16]发现慢性萎缩性胃炎C-3阶段阴虚与普雷沃菌属（Prevotella）呈正相关，这可能是因为雷沃菌属（Prevotella）过量定植会促进炎症反应；沈睿等[17]研究指出“脾胃虚弱型”胃癌患者舌苔菌落中芽孢杆菌（Bacillus）显著富集，这可能与芽孢杆菌属（Bacillus）促进胃肠黏膜炎症，损伤胃肠功能有关。然而，聚焦肺结节，其唾液微生物与中医证素之间的潜在相关性目前尚缺乏研究证据。
因此，本研究以肺结节患者为研究对象，采集患者证素信息，分析肺结节患者中医证素分布及唾液菌群特征，采用排序回归分析、Mantel test分析、Spearman相关性分析等多级关联分析方法探索两者的相关性，以期为肺结节的中医证素辨证提供客观化生物学依据，亦对肺结节疾病的风险预警、靶向治疗、疗效评价提供新思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象
研究对象来自成都中医药大学附属医院、四川省肿瘤医院及成都市中西医结合医院2022年7月—2023年3月收治的符合诊断、纳入及排除标准的受试者。所有受试者均已签署书面知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 西医诊断标准
参照《肺结节诊治中国专家共识（2018年版）》中肺结节诊断标准[18]：影像学表现为直径≤3 cm的局灶性、类圆形、密度增高的实性或亚实性肺部阴影，可为孤立性或多发性，不伴肺不张、肺门淋巴结肿大和胸腔积液。
1.2.2 中医证素辨证标准
参照朱文锋教授《证素辨证学》中的证素诊断标准[19]，根据收集的中医四诊信息，将同一证素对应的所有症状-证素权重相加，从而得到证素权重积分；然后通过权重积分与阈值关系确定证素。
1.2.3 受试者纳入标准
（1）肺结节患者具有明确的胸部CT影像学异常，符合肺结节诊断标准；（2）健康人胸部CT影像学无肺结节及其他肺部异常现象；（3）无其他肿瘤病史；（4）无呼吸系统相关手术史；（5）年龄18～80岁，性别不限；（6）自愿同意参加本研究。
1.2.4 受试者排除标准
（1）患有恶性肿瘤、其他呼吸系统疾病（肺炎、肺结核等）以及其他严重的心血管、内分泌、血液系统等疾病；（2）有自身免疫性疾病病史，或长期免疫抑制剂使用史；（3）有未经治疗的传染性疾病病史；（4）患有口腔疾病等合并疾病；（5）近1个月内使用过抗生素类药物、酸奶等；（6）存在严重的精神障碍（感知障碍、思维障碍等）者。
1.2.5 信息与中医证素采集
查阅万方、维普、知网等数据库中与肺结节相关的中医文献，结合《中医诊断学》、《中医内科学》等教材中与本病相关的症状和体征，统计得到肺结节的常见症状，参照既往肺结节中医证素分布特征的研究[20]，制作肺结节中医证素采集表，记录患者一般信息（性别、年龄、吸烟史）以及肺结节信息与四诊信息。四诊信息采集由经培训过的中医专业的研究人员肺结节中医证素采集表根据进行临床信息采集。舌苔、脉象由课题组2名中医主任医师共同判定，如实记录。以朱文锋教授《证素辨证学》中“证候辨证素量表”制成证候辨证素计算Excel数据库，列出肺结节中医证素采集表中症状与体征对应证素的不同权值，累加分值并以分值≥70提取证素。
1.2.6 唾液样本采集
受试者身体前倾，头微低，微张口，由采样者将无菌EP管置于受试者下唇部，使唾液自然流入管中，采集非刺激性唾液2～3 mL，予干冰保存，4 h内转运至实验室−80 ℃冰箱等待后续试验。
1.2.7 唾液菌群16S rRNA检测
（1）唾液微生物DNA抽提与质检：根据制造商（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行唾液微生物群落总基因组DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测对提取的唾液基因组DNA进行质检，使用NanoDrop2000（美国Thermo Scientific公司）对DNA浓度、纯度进行定量检测。（2）PCR扩增和测序文库构建：以提取出的唾液微生物群落总基因组DNA为模板，对基因的V3-V4可变区使用携带Barcode序列的上游引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）进行PCR扩增（PCR仪：ABI GeneAmp®
1.3 数据处理与统计学分析
菌群α多样性指数（Sobs）由mothur软件计算分析。Beta多样性指数采用基于Bray-Curtis算法的主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）方法进行分析，菌群多样性分析使用R软件（version 3.6.2）对结果进行可视化呈现。菌群结构分析运用R软件（version 3.6.2）进行分析与绘制物种分析Venn图，群落Bar图、共线性网络图则通过Python 2.7进行数据分析和图片绘制。采用R软件（version 3.6.2）进行Wilcoxon秩和检验及线性判别分析（Lineardiscriminant Analysis Effect Size，LEfSe；
运用SPSS26.0版本对数据进行统计分析，连续变量若呈正态分布，则以均数±标准差（x±s）表示，并使用独立样本Student’s t检验进行组间比较；若为非正态分布，则以中位数（四分位数间距）［M（IQR）］表示，并使用Wilcoxon符号秩和检验进行组间比较。计数资料以频数、百分比表示，组间比较采用χ2检验、Fisher精确检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
本研究已获成都中医药大学附属医院伦理委员会审查批准（批准号：2022KL-051），并在中国临床试验注册中心注册（注册号：ChiCTR2200062140）。
2 结果
2.1 受试者临床特征
本研究共纳入肺结节患者173例，男69例（32.4%）、女104例（48.8%），中位年龄是45（32，55）岁。健康人40名，男12名、女28名，男女比例为1∶2.33，中位年龄42（33，48）岁。肺结节组（PN）和健康对照组（HC）组间比较结果见表1，除吸烟史之外，在年龄、性别基线特征方面，两组间差异均无统计学意义。
表1
两组受试者临床特征［例（%）/M（IQR）］
2.2 肺结节患者和健康人群的病位证素分布差异
PN组中病位证素根据例数从多到少排序，依次是：肺（90）、肝（79）、脾（45）、肾（45）、表（33）、心（26）和大肠（10）。HC组中病位证素例数最多的是肺（9）和脾（9），其次是肝（7）、肾（2）、表（2）、心（1）和大肠（1）。
两组病位证素在肺、肝、肾、表、心的分布差异具有统计学意义（P<0.05），其中肺结节患者的比例均更高。两组在脾、大肠的病位证素分布差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
表2
健康人群和肺结节患者病位证素分布差异［例（%）］
2.3 肺结节患者和健康人群的病性证素分布差异
肺结节患者中病性证素例数最多是阴虚（97），其次是痰（92）、气滞（82）、气虚（78）、湿（79）、血虚（63）、阳虚（52）、热（33）、瘀（31）、寒（21）、饮（13）、燥（10）。健康人群中例数从多到少排序，依次是：湿（11）、气虚（8）、痰（8）、气滞（8）、阳虚（7）、寒（6）、阴虚（5）、血虚（3）、饮（3）、瘀（1）、燥（0）。
肺结节患者和健康人群病性证素在阴虚、痰、气滞、气虚、湿、血虚、热、瘀的分布差异有统计学意义（P<0.05），且肺结节患者以上证素占比更高。两组病性证素在阳虚、寒、饮、燥的分布差异无统计学意义（P>0.05），见表3。
表3
健康人和肺结节患者病性证素分布差异［例（%）］
2.4 肺结节患者与健康人群唾液菌群分析
α多样性分析与β多样性分析结果提示肺结节患者口腔唾液菌群物种丰富度高于健康人群，两组之间唾液菌群相似性不同（P<0.05，图1a、b）。其中，PN组独有物种188个，HC组有33个独有物种（图1c）。物种组成层面，链球菌属（Streptococcus）、罗氏菌属（Rothia）、奈瑟菌属（Neisseria）、普雷沃菌属（Prevotella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、韦荣球菌属（Veillonella）、放线菌属（Actinomyces）、纤毛菌属（Leptotrichia）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、孪生球菌属（Gemella）为两组属水平相对丰度前10的物种（图1d、e）。基于Wilcoxon秩和检验的组间比较结果（图1f，P<0.05）和LEfSe的判别分析（图1g，LDA>3）双重验证显示，PN组显著富集的菌属包括：普雷沃菌（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）和TM7x；HC组中主要富集的菌属为奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）、放线杆菌属（Actinobacillus）、劳特罗普氏菌属（Lautropia）和团聚杆菌属（Aggregatibacter）。
图1
肺结节患者与健康人群唾液菌群分析结果
a：PN组与HC组Sobs指数线箱图；b：PN组与HC组PCoA散点图；c：PN组和HC组群落Bar图；d： PN组和HC组群落Venn图；e：PN组与HC组共线性网络图；f：基于Wilcoxon秩和检验的PN组和HC组物种差异分析；g：基于LEfSe分析的PN组和HC组物种差异分析
2.5 中医证素分布与唾液菌群相关性分析
考虑到与群落分布相关的环境因素复杂、多样，运用VIF分析筛选出独立性较强的环境因子。结果显示，19种证素环境因子在识别前后，其VIF值均＜10，因此各变量之间没有明显的多重共线性问题，可进行回归分析；见表4。
表4
VIF方差膨胀因子共线性分析
将单个病性、病位证素与唾液菌群β多样性做排序回归分析，由图2可知19个证素与唾液样本群落组成差异具有相关性。其中，病位-肺、病性-阴虚对唾液样本群落组成差异多样性具有显著性影响（P<0.05）。
图2
证素与唾液菌群β多样性排序回归分析
Mantel test分析是检验环境因子与菌群结构相关关系的非参数统计方法。由表5可知，证素与唾液菌群组成具有相关性（P<0.05）。进一步进行Mantel test网络热图分析，病位-肺，病性-阴虚对肺结节患者唾液菌群结构组成呈正相关（P<0.05）；见图3a。
表5
Mantel test分析
图3
证素与具体唾液微生物群落组成相关性分析
a：证素与唾液菌群的网络热图分析；b：基于Bray-Curtis距离的db-RDA分析；c：基于Spearman相关性分析的Heatmap图；d：证素与唾液菌群的VPA分析；e：证素与唾液菌群的Procrustes分析
基于Bray-Curtis距离算法进行db-RDA分析评估证素对唾液菌群群落组成的影响，全部样本点聚类形成了两个cluster（图3b）。进一步的统计相关性系数及显著性检验结果显示，病位-心、肺；病性-阴虚、痰、湿、饮和与唾液微生物群落组成具有显著相关性；见表6。
表6
db-RDA环境因子分析
为探讨证素与具体唾液微生物群落组成相关性，采用Spearman相关性分析计算唾液优势菌属与证素分布之间的相关性，相关性Heatmap图显示（图3c）：病位-肺与普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）呈正相关（r=0.23，P<0.01；r=0.21，P<0.01），与梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.19，P<0.01）。病性-阴虚与卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）呈正相关（r=0.17，P<0.05；r=0.23，P<0.01），与梭杆菌属（Fusobacterium）、韦荣氏球菌属（Veillonella）呈负相关（r=−0.25，P<0.01；r=−0.20，P<0.01）。病性-痰与罗氏菌属（Rothia）呈正相关（r=0.14，P<0.05），与梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.21，P<0.01）。病性-湿与罗氏菌属（Rothia）呈正相关（r=0.15，P<0.05），与嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）呈负相关（r=−0.15，P<0.05；r=−0.15，P<0.05）。
病位、病性证素不仅与唾液菌群群落组成具有相关性，通过VPA分析发现证素还对唾液微生物菌群结构变化具有一定解释度，见图3d；Procrustes分析进一步证实证素的变化与微生物变化具有一致性（M2=0.015，P<0.05）；见图3e。
3 讨论
3.1 中医证素分布结果与目前中医对肺结节病因病机的认知相符
肺结节的主要病位证素在肺。肺为华盖，居胸中，主气司呼吸，其宣发肃降功能调畅一身气机。“百病皆生于气”，气与津液、血液等有形物质的运行密切相关，肺宣发肃降功能失常是肺结节形成的关键病机。肺通调水道依赖于肺气宣发与肃降，宣降失司则水液代谢失常，不能及时布散，停于肺络为积；痰留日久，影响肺朝百脉，血行不畅而为瘀，痰瘀互结于肺络，推动肺结节演进。肺结节仅次于肺病位中医证素的是肝。一方面，肝主一身之气机疏泄，气机正常的升降出入需要肝发挥疏泄功能协同肺宣发肃降共同完成；另一方面，现代快节奏生活方式影响下，学习、工作等竞争愈发激烈，焦虑、抑郁等不良情绪极易产生，情志不畅则肝气郁结，木火刑金致肺气郁闭，肺内浊气停聚壅滞，为肺结节的发生提供条件。在病性证素方面，阴虚、痰病性证素排在前二。肺结节第一病性证素是阴虚。一方面可能是因为是阴虚体质的患者本身是肺结节易感体质[21]，另一方面，烟草、雾霾等有毒气体或环境污染易伤肺阴，导致肺阴亏虚，燥热内生，炼津成痰成瘀。痰是肺结节次要病性证素。《医林绳墨·积聚》云：“积者阴也……症之所因，皆因痰之所起，气之所结耳……积者，痰之积也”。痰属阴，为有形之邪，在肺结节形成过程中扮演了重要角色。或因肺失宣肃通调水道失司，或因脾虚无法散津液，或因肾虚无法温化水液皆可致水液停聚为痰，日久成积。肺、肝为主要病位证素，阴虚、痰为重要病性证素，本研究中的的中医证素分布结果与目前中医对肺结节病因病机的认知相符[7]。
3.2 唾液微生物对肺结节诊疗具有潜在价值
随着测序技术的发展，唾液微生物作为体液标志物在鉴别肺癌与健康人、肺癌与肺部良性病变等方面的潜力已经被证实[22-23]。我们研究结果表明：与HC组相比，PN组唾液样本中主要富集的菌属有：普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）和TM7x。肺结节作为肺癌的早期表现，虽然目前尚缺乏口腔微生物对肺结节发病机制的作用研究，但口腔微生物与肺癌发生发展的关系已被广泛报道。多项流行病学的证据表明，口腔微生态紊乱的人群患肺癌概率增加[24-25]。普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线菌属（Actinomyces）、月形单胞菌属（Selenomonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）、等口腔致病菌可通过吸入、血行转移入肺内，影响微环境稳态，引起细胞增殖凋亡，免疫炎性反应，促进肺癌细胞侵袭转移[26-30]。现代研究证实卟啉单胞菌属（Porphyromonas）中的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展相关[31]。一方面，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）可通过增加促炎因子表达，促进有利于癌症形成与发展的炎症环境[32]；另一方面，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）还具有免疫抑制能力，驱动巨噬细胞极化为促肿瘤M2肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表型[33]，同时能调节p53功能，促进癌细胞的生存和增殖[34-35]。据此推断牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）可能促进肺结节癌转化。综合文献阅读及研究成果可见，唾液菌群失调可能推动肺结节恶性演进，对特定菌群的动态监测或可作为未来肺结节和肺癌早期筛查及诊断的重要依据，同时也为利用靶向微生物制剂或微生物移植等手段进行肺结节防治提供了新的切入点。
3.3 肺结节患者中医证素与唾液菌群特征具有相关性
既往研究证实微生物与慢性萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、肝硬化等疾病的中医证素紧密关联[36-37]，表明微生物可作为中医证素客观化指标的潜力。我们的相关性分析结果亦显示肺结节患者证素分布与唾液菌群特征具有显著相关性：在属水平6个优势菌属中，普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病位-肺呈正相关，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、颗粒链球菌属（Granulicatella）与病性-阴虚呈正相关。李杲亦直言“肺主卫”，肺卫之气，其与人体抵御病邪的能力有密切关系。中医之“卫气”与现代医学中的免疫系统概念与与不谋而合，其实质可与免疫细胞来源、分布、功能一一对应[38]。大量研究表明，口腔微生物与免疫微环境密切相关。如Wen等[39]发现普雷沃氏菌属（Prevotella）可能通过诱导肠道上皮细胞环状核苷酸分泌来调节先天免疫系统及适应性免疫系统。Chopra[40]等发现牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）通过释放大量黏附素调节中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞（Th1/Th2/Th17）以调控宿主免疫反应。可见，普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病性-肺关联，既直接参与肺部感染、肺癌等肺部疾病发生发展[41-42]，又能够影响与肺紧密关联的免疫系统（卫气）。
阴虚证在病理方面往往表现出炎症因子增加，相关信号通路激活等特征[43]，同时炎症反应在临床中通常可表现为发热、红、肿、热痛等一派“火旺”之象，火易迫津外泄、消灼阴液，体内津液耗伤则阴虚。因此，炎症属中医“阴虚”范畴。而口腔微生物与机体炎症反应同样有密切的关系。我们研究显示，颗粒链球菌属（Granulicatella）与病性-阴虚呈正相关。其不仅与口腔黏膜炎、牙周炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等炎性疾病潜在关联[44-46]，还是IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的有效诱导剂[47]。卟啉单胞菌属（Porphyromonas）不仅与肺结节主要病位证素-肺存在关联，还与主要病性证素-阴虚具有相关性，因此具有双重关联性的卟啉单胞菌属（Porphyromonas）对于探讨中医证素与唾液菌群特征的相关性更具代表性。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与炎症的发生发展紧密关联[32]。其既能通过Toll样受体4（TLR-4）识别自身细菌外膜LPS成分，刺激MyD 88依赖性和非依赖性途径，释放NF-κB，导致促炎细胞因子的产生，形成炎症环境[48]；又可通过Toll样受体2（TLR-2）诱导人支气管上皮细胞和咽上皮细胞中IL-6和IL-8 mRNA表达，促进促炎细胞因子的产生，诱导炎症环境形成[49]。炎症微环境在肺结节的发生发展中占据重要地位，50%的肺结节病理因素由炎症引起[50]。由此可见，唾液微生物与肺结节中医证素之间存在密切生物学关联，口腔微生物的丰度变化或可作为肺结节患者证素的客观量化指标。
本研究的局限性及研究展望总结如下：（1）样本量有待进一步扩大：本研究作为研究团队关于微生物与肺结节（microbiome with pulmonary nodule，MCEPN）系列研究的先导性成果，前期我们共收集了213例临床样本，样本量有限。目前研究团队正持续开展多中心、大样本研究，同步进行追踪随访，后续将从结节大小、密度、良恶性等多角度对肺结节的生物学特征进行刻画。（2）微生物多样性分析技术有限：基于16S rRNA高通量测序的生物信息学分析，虽能够显示肺结节疾病的微生物群落物种组成、物种丰度、富集菌属，但并未细化到菌种水平、基因及蛋白质的功能，我们目前正在结合宏基因组、蛋白质组学、代谢组学等多组学技术，进一步研究“微生物-宿主”间的相互作用。（3）作用机制有待进一步阐明：本研究对唾液微生物与肺结节的发病机制的探索是初步和预测的，研究团队正在基于类器官和基因编辑技术，积极探索并构建多基因联合驱动的肺结节动物模型，开展基础实验深入解析肺结节疾病演进背后复杂的作用机制，进一步明确唾液微生物群影响肺结节疾病状态的关键途径，以期深入探索中医药通过靶向唾液菌群阻延肺结节恶性演进的确切效应，为肺结节及早期肺癌的诊疗提供新的切入点。
肺结节患者和健康人群在肺、肝、阴虚、痰、湿等证素的分布存在差异，在卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、普雷沃菌属（Prevotella）等唾液菌群的物种丰度组成方面有所不同。其中，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）与病位-肺、病性-阴虚具有显著双重关联性，其丰度变化或可作为阴虚型肺结节患者症候改善的微观指标。包括卟啉单胞菌属（Porphyromonas）在内的唾液微生物组具有作为监测肺结节患者疾病状态变化的无创性生物标志物的潜力，亦可成为肺结节中医证素客观化的量化指标。
利益冲突：无。
作者贡献：向红霞和何佳玮负责数据分析，论文设计和初稿撰写及修改；谭施言、付西负责数据采集，统计分析；由凤鸣负责论文设计和审阅、对编辑部的意见进行核修；由丽婷、石薇负责数据整理和分析；任益锋和马琼负责研究方案制定及指导，文章的知识性内容审阅与修改、对编辑部的意见进行核修。
