引用本文： 张伟, 王南鹏, 高庆军, 周彦, 段海松, 张微, 赵代伟. 甲状腺乳头状癌BRAFV600E突变与临床病理特征和甲状腺球蛋白的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(2): 200-203. doi: 10.7507/1007-9424.20150054 复制
甲状腺乳头状癌（PTC）约占所有甲状腺癌的80%～90%，是甲状腺癌生物学特性中恶性程度最低的一类肿瘤[1]。对于PTC的治疗，目前国内外公认的最佳治疗方案是行甲状腺全切除或近全切除+颈部淋巴结清扫或甲状腺腺叶切除+峡部切除术，术后131碘（131I）治疗以及甲状腺激素的终身抑制及替代治疗[2]。本研究应用巢式PCR方法对我院55例PTC患者的石蜡包埋组织行BRAFV600E基因位点突变的检测，并结合患者临床病理特征及规范化治疗后检测的Tg值进行研究，试图了解基因突变与临床病理特征及规范化治疗后Tg值变化的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院甲状腺外科及头颈外科2012年1～3月期间行根治性手术切除且经病理组织学检测证实为PTC的55例石蜡包埋组织标本。所有选择标本的患者均行甲状腺全切除+颈部淋巴结清扫，其中行中央区淋巴结清扫48例，中央并颈侧区淋巴结清扫7例。术后1个月均在我院核医学科行规范的131I治疗，具体剂量参照2012年甲状腺结节和甲状腺癌的诊疗指南[2]并统计该55例患者行规范化治疗后检测的Tg值，并且Tg值均在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下测定，同时复查抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb），每3个月复查1次Tg及TgAb。随访时间为2年，患者随访率100%，无一例有确切颈部复发或转移证据和再次手术指征，包括Tg值持续大于10μg/L、颈部超声和RX-WBS均有明显异常，无死亡患者。
1.2 巢式PCR方法检测
1.2.1 试剂和引物
DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）购于QIAamp公司，PCR Master Mix购于BioTeke公司。BRAF上游引物为5’-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3’，BRAF下游引物为5’-TCATAATGCTTG-CTCTGATAGGA-3’，扩增片段长度为16 bp，由上海生工合成。Cycle-Pure kit 100购于Omega公司。测序部分检测试剂盒购于上海源奇生物医药公司。
1.2.2 组织DNA提取
按DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）试剂盒操作，其中二甲苯脱蜡2次，56℃水浴消化约12 h，并对提取的DNA使用BioTeke公司的DNA浓度测定仪行浓度测定，然后将DNA置于-20℃冰箱保存。
1.2.3 巢式PCR
配制25μL体系：PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 1μL，ddH2O 9.5μL放入PCR仪中。设置94℃5 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃45 s，35个循环，72℃延伸10 min，得到产物。
1.2.4 PCR的纯化
取PCR产物按照Omega公司的Cycle-Pure kit 100试剂盒操作，即为PCR纯化产物。
1.2.5 部分检测及测序
对PCR纯化产物，按照上海源奇生物医药公司的测序部分检测试剂盒上说明进行操作，得到产物后按照ABI的3500测序仪进行测序，得到测序图像。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析。采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BRAFV600E基因位点突变检测结果
55例PTC患者中，26例无BRAFV600E基因位点突变即为野生型（图 1）；29例出现BRAFV600E基因位点突变（图 2），突变率为52.7%。
图1
野生型测序结果图。黑色箭头指的检测1 799位点的基因，只有红色T峰，即为野生型 图 2 突变型测序结果图。黑色箭头指的检测1 799位点的基因，绿色的A峰是突变峰，红色的T峰，即为突变型
2.2 BRAFV600E突变与PTC患者的临床病理特征及规范化治疗后Tg的关系
结果见表 1。从表 1可见，患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期与BRAFV600E基因突变无关（P > 0.05）；肿瘤有包膜外浸润、多灶性、有淋巴结转移、规范化治疗后Tg均值> 1.0μg/L时与BRAFV600E基因突变有关（P < 0.05）。
表1
BRAFV600E突变与PTC患者临床病理特征及规范化治疗后Tg的关系（例）
3 讨论
3.1 BRAF基因突变
BRAF基因在1988年由Ikawa等[3]首先在人类尤文氏肉瘤中发现并将其克隆出来，BRAF基因突变是指BRAF基因的第15外显子的第600密码子1 799号上的核苷酸由胸腺嘧啶（T）突变为腺嘌呤（A）即T1799A，导致编码产物由缬氨酸（V）替换为谷氨酸（E）的突变点（V600E）。该基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，与鸟类的c-Rmail原癌基因同源。该基因至少含有7个转录区，能编码多种蛋白质，其中包括全长约94 kD、有783个氨基酸残基的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶，属丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶类，该突变可以激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[4]，参与细胞周期调控，对细胞的生长、增殖、分化和凋亡发挥重要作用[3]。当BRAF基因突变异常激活MAPK通路时则可能导致细胞增殖分化的失控，最终导致肿瘤的发生[5-6]。有研究[7-8]发现，RET/PTC-RAS-RAF-MEK/ERK-MAPK信号传导通路在甲状腺癌的发生和转移中起到重要的作用。Davies等[9]研究表明，BRAF基因突变是导致MAPK信号通路异常激活的主要原因之一。本研究对手术切除的55例PTC患者的肿瘤组织的BRAFV600E基因进行检测，结果发现，29例出现BRAFV600E基因15外显子的1 799号上的核苷酸由T突变为A的位点突变，突变率为52.7%，与文献[9]报道该基因突变率为29%～82%符合。
3.2 BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的关系
目前国内外对BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的关系报道较少且结果不一[10-11]。Xing等[10]的研究结果表明，BRAFV600E突变与甲状腺外侵犯、甲状腺包膜浸润和淋巴结转移密切相关。牛卫等[12]的研究结果发现，BRAFV600E基因突变率与PTC患者的性别、年龄、TNM肿瘤分期无关。Puxeddu等[13]关于BRAFV600E突变研究表明，它诱导或促进基因组不稳定性和更具侵袭性，结果造成肿瘤去分化和显著抑制细胞凋亡。Elisei等[14]有一项与PTC病死率关系的15年的研究发现，BRAFV600E突变作为单独影响因素与患者病死率有关，突变患者的病死率显著高于无突变患者。本研究发现，BRAFV600E基因突变与PTC患者的年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期无关（P > 0.05），与包膜浸润、多灶性、有颈部淋巴结转移有关（P < 0.05）。结果提示，BRAFV600E基因突变可引起肿瘤侵犯到包膜外，并出现颈部淋巴结转移，肿瘤的多灶性可能是肿瘤早期出现腺体内转移表现。
3.3 BRAFV600E基因突变与Tg的关系
尽管进行甲状腺全切除术，但术后放射性碘成像往往发现甲状腺床有残留甲状腺组织的存在，再行131I清除术后残留甲状腺组织治疗后，放射性碘成像会发现甲状腺床上无残余甲状腺组织，考虑全部去除体内甲状腺，此时Tg的作用才得到真正的体现，Tg是一个监测甲状腺癌复发转移有临床意义的指标[15]。Tg对PTC复发或转移灶诊断的灵敏度、特异度和准确性分别为76.9%、66.7%和75%[16]。检测Tg及TgAb时，如果TgAb在正常范围(0～60 U/mL)，可以排除TgAb对患者Tg值的影响[17]。本研究所有患者术后均检测Tg和TgAb，Tg值均为在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下测定，随访的所有患者中无一例有确切颈部复发或转移证据和再次手术指征，包括颈部超声和RX-WBS均有明显异常，无死亡患者。
目前公认的TSH抑制下Tg的切点值为1.0μg/L，核医学科清除术后残留甲状腺组织治疗的剂量在30～100 mCi（具体剂量参照指南[2]实施），术后在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下，Tg值越大，提示有残余或复发灶存在可能性越大。本研究中发现，BRAFV600E基因突变患者在规范化治疗后Tg值> 1.0μg/L的例数与未突变患者的Tg值> 1.0μg/L的例数进行比较，差异有统计学意义（χ2=5.03，P=0.03），突变患者规范化治疗后Tg值大于未突变者，这可能与突变可以诱导转化生长因子-B的分泌和能抑制Na+/I-同向转运体基因的功能有关[18]，导致对放射性碘摄取差，残余的肿瘤可以继续分泌Tg。因此我们认为，如果术前通过检测肿瘤组织的BRAFV600E基因突变，对突变患者建议术中甲状腺全切除及颈部淋巴结清扫术，术后的131I清除术后残留甲状腺组织及积极促甲状腺激素刺激激素抑制治疗，便于随访Tg。
甲状腺乳头状癌（PTC）约占所有甲状腺癌的80%～90%，是甲状腺癌生物学特性中恶性程度最低的一类肿瘤[1]。对于PTC的治疗，目前国内外公认的最佳治疗方案是行甲状腺全切除或近全切除+颈部淋巴结清扫或甲状腺腺叶切除+峡部切除术，术后131碘（131I）治疗以及甲状腺激素的终身抑制及替代治疗[2]。本研究应用巢式PCR方法对我院55例PTC患者的石蜡包埋组织行BRAFV600E基因位点突变的检测，并结合患者临床病理特征及规范化治疗后检测的Tg值进行研究，试图了解基因突变与临床病理特征及规范化治疗后Tg值变化的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取我院甲状腺外科及头颈外科2012年1～3月期间行根治性手术切除且经病理组织学检测证实为PTC的55例石蜡包埋组织标本。所有选择标本的患者均行甲状腺全切除+颈部淋巴结清扫，其中行中央区淋巴结清扫48例，中央并颈侧区淋巴结清扫7例。术后1个月均在我院核医学科行规范的131I治疗，具体剂量参照2012年甲状腺结节和甲状腺癌的诊疗指南[2]并统计该55例患者行规范化治疗后检测的Tg值，并且Tg值均在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下测定，同时复查抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb），每3个月复查1次Tg及TgAb。随访时间为2年，患者随访率100%，无一例有确切颈部复发或转移证据和再次手术指征，包括Tg值持续大于10μg/L、颈部超声和RX-WBS均有明显异常，无死亡患者。
1.2 巢式PCR方法检测
1.2.1 试剂和引物
DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）购于QIAamp公司，PCR Master Mix购于BioTeke公司。BRAF上游引物为5’-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3’，BRAF下游引物为5’-TCATAATGCTTG-CTCTGATAGGA-3’，扩增片段长度为16 bp，由上海生工合成。Cycle-Pure kit 100购于Omega公司。测序部分检测试剂盒购于上海源奇生物医药公司。
1.2.2 组织DNA提取
按DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）试剂盒操作，其中二甲苯脱蜡2次，56℃水浴消化约12 h，并对提取的DNA使用BioTeke公司的DNA浓度测定仪行浓度测定，然后将DNA置于-20℃冰箱保存。
1.2.3 巢式PCR
配制25μL体系：PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 1μL，ddH2O 9.5μL放入PCR仪中。设置94℃5 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃45 s，35个循环，72℃延伸10 min，得到产物。
1.2.4 PCR的纯化
取PCR产物按照Omega公司的Cycle-Pure kit 100试剂盒操作，即为PCR纯化产物。
1.2.5 部分检测及测序
对PCR纯化产物，按照上海源奇生物医药公司的测序部分检测试剂盒上说明进行操作，得到产物后按照ABI的3500测序仪进行测序，得到测序图像。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析。采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BRAFV600E基因位点突变检测结果
55例PTC患者中，26例无BRAFV600E基因位点突变即为野生型（图 1）；29例出现BRAFV600E基因位点突变（图 2），突变率为52.7%。
图1
野生型测序结果图。黑色箭头指的检测1 799位点的基因，只有红色T峰，即为野生型 图 2 突变型测序结果图。黑色箭头指的检测1 799位点的基因，绿色的A峰是突变峰，红色的T峰，即为突变型
2.2 BRAFV600E突变与PTC患者的临床病理特征及规范化治疗后Tg的关系
结果见表 1。从表 1可见，患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期与BRAFV600E基因突变无关（P > 0.05）；肿瘤有包膜外浸润、多灶性、有淋巴结转移、规范化治疗后Tg均值> 1.0μg/L时与BRAFV600E基因突变有关（P < 0.05）。
表1
BRAFV600E突变与PTC患者临床病理特征及规范化治疗后Tg的关系（例）
3 讨论
3.1 BRAF基因突变
BRAF基因在1988年由Ikawa等[3]首先在人类尤文氏肉瘤中发现并将其克隆出来，BRAF基因突变是指BRAF基因的第15外显子的第600密码子1 799号上的核苷酸由胸腺嘧啶（T）突变为腺嘌呤（A）即T1799A，导致编码产物由缬氨酸（V）替换为谷氨酸（E）的突变点（V600E）。该基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，与鸟类的c-Rmail原癌基因同源。该基因至少含有7个转录区，能编码多种蛋白质，其中包括全长约94 kD、有783个氨基酸残基的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶，属丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶类，该突变可以激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[4]，参与细胞周期调控，对细胞的生长、增殖、分化和凋亡发挥重要作用[3]。当BRAF基因突变异常激活MAPK通路时则可能导致细胞增殖分化的失控，最终导致肿瘤的发生[5-6]。有研究[7-8]发现，RET/PTC-RAS-RAF-MEK/ERK-MAPK信号传导通路在甲状腺癌的发生和转移中起到重要的作用。Davies等[9]研究表明，BRAF基因突变是导致MAPK信号通路异常激活的主要原因之一。本研究对手术切除的55例PTC患者的肿瘤组织的BRAFV600E基因进行检测，结果发现，29例出现BRAFV600E基因15外显子的1 799号上的核苷酸由T突变为A的位点突变，突变率为52.7%，与文献[9]报道该基因突变率为29%～82%符合。
3.2 BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的关系
目前国内外对BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的关系报道较少且结果不一[10-11]。Xing等[10]的研究结果表明，BRAFV600E突变与甲状腺外侵犯、甲状腺包膜浸润和淋巴结转移密切相关。牛卫等[12]的研究结果发现，BRAFV600E基因突变率与PTC患者的性别、年龄、TNM肿瘤分期无关。Puxeddu等[13]关于BRAFV600E突变研究表明，它诱导或促进基因组不稳定性和更具侵袭性，结果造成肿瘤去分化和显著抑制细胞凋亡。Elisei等[14]有一项与PTC病死率关系的15年的研究发现，BRAFV600E突变作为单独影响因素与患者病死率有关，突变患者的病死率显著高于无突变患者。本研究发现，BRAFV600E基因突变与PTC患者的年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期无关（P > 0.05），与包膜浸润、多灶性、有颈部淋巴结转移有关（P < 0.05）。结果提示，BRAFV600E基因突变可引起肿瘤侵犯到包膜外，并出现颈部淋巴结转移，肿瘤的多灶性可能是肿瘤早期出现腺体内转移表现。
3.3 BRAFV600E基因突变与Tg的关系
尽管进行甲状腺全切除术，但术后放射性碘成像往往发现甲状腺床有残留甲状腺组织的存在，再行131I清除术后残留甲状腺组织治疗后，放射性碘成像会发现甲状腺床上无残余甲状腺组织，考虑全部去除体内甲状腺，此时Tg的作用才得到真正的体现，Tg是一个监测甲状腺癌复发转移有临床意义的指标[15]。Tg对PTC复发或转移灶诊断的灵敏度、特异度和准确性分别为76.9%、66.7%和75%[16]。检测Tg及TgAb时，如果TgAb在正常范围(0～60 U/mL)，可以排除TgAb对患者Tg值的影响[17]。本研究所有患者术后均检测Tg和TgAb，Tg值均为在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下测定，随访的所有患者中无一例有确切颈部复发或转移证据和再次手术指征，包括颈部超声和RX-WBS均有明显异常，无死亡患者。
目前公认的TSH抑制下Tg的切点值为1.0μg/L，核医学科清除术后残留甲状腺组织治疗的剂量在30～100 mCi（具体剂量参照指南[2]实施），术后在促甲状腺激素刺激激素抑制状态下，Tg值越大，提示有残余或复发灶存在可能性越大。本研究中发现，BRAFV600E基因突变患者在规范化治疗后Tg值> 1.0μg/L的例数与未突变患者的Tg值> 1.0μg/L的例数进行比较，差异有统计学意义（χ2=5.03，P=0.03），突变患者规范化治疗后Tg值大于未突变者，这可能与突变可以诱导转化生长因子-B的分泌和能抑制Na+/I-同向转运体基因的功能有关[18]，导致对放射性碘摄取差，残余的肿瘤可以继续分泌Tg。因此我们认为，如果术前通过检测肿瘤组织的BRAFV600E基因突变，对突变患者建议术中甲状腺全切除及颈部淋巴结清扫术，术后的131I清除术后残留甲状腺组织及积极促甲状腺激素刺激激素抑制治疗，便于随访Tg。
