引用本文： 杨兵, 郭庆军, 田大治, 李俊杰, 张骊, 谢炎, 陈池义, 蒋文涛. 成人肝移植供受体 CYP3A5 基因分型对术后他克莫司临床个体化用药的应用价值探讨. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(9): 1084-1088. doi: 10.7507/1007-9424.201912120 复制
患者肝移植术后免疫抑制剂不足或过量均可导致不良预后，个体化免疫抑制治疗是主要解决措施[1]。他克莫司是肝移植术后免疫抑制治疗的基础用药，但其治疗窗狭窄，药代动力学个体差异大，临床上很难建立经验用药的方案[2-3]。本研究通过测定肝移植供受体的 CYP3A5 基因分型，从而探讨不同个体间药物代谢基因的差异对他克莫司代谢的影响。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
纳入标准：① 年龄在 18 到 70 岁之间；② 首次行同种异体原位肝移植术；③ 无严重心、肺、肾等疾病；④ 术后均采用相同的免疫抑制治疗方案（他克莫司+吗替麦考酚酯+注射用甲泼尼龙琥珀酸钠）。排除标准：① 临床及术后随访资料不全；② 多器官联合移植；③ 患者术后早期肝功能延迟恢复；④ 依从性差且结果准确性差（如服药或抽血时间不规律）的患者；⑤ 患者术后应用影响 CYP3A4 和 CYP3A5 酶活性的药物（如伏立康唑、伊曲康唑和雷帕霉素），或氨基糖苷类、两性霉素 B、环孢素等可能会增加他克莫司副反应的药物；⑥ 术后胃肠道功能长期不能恢复（如严重腹泻、呕吐等），影响他克莫司吸收的患者；⑦ 存在严重贫血、重度感染或电解质紊乱等严重影响预后的疾病。
1.2 临床资料
回顾性收集天津市第一中心医院 2018 年 7 月至 2019 年 6 月期间符合标准的肝移植患者及其对应供体的临床资料。所有研究对象在术前检测了 CYP3A5 基因型。同时采集供受体的姓名、性别、年龄、住院号、联系方式、原发病、手术日期、血型、体质量等一般资料。所有患者术后均采用相同的抗排斥治疗方案，均未出现严重感染、排斥反应或药物肾毒性，并检测术后 1、2、3 及 4 周时他克莫司的血药浓度。最终根据纳入和排除标准纳入肝移植患者及其对应供体各 98 例，其临床资料见表 1。
表1
98 例供受体的临床资料
1.3 CYP3A5 基因分型测定
术前应用 EDTA 抗凝管采集供体和受体外周血，送到指定实验室检测。提取样本 DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测 CYP3A5 基因型，其中 PCR 扩增引物：正引物为 5′-GAAGCAAGTGGGAGAAAG-3′，负引物为 5′-TGATGAAGGGTAATGTGG-3′。PCR 反应条件为：94 ℃ 预变性 4 min；变性、退火及延伸条件分别为 94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s 和 72 ℃ 30 s，共 35 个循环。PCR 扩增产物经 2% 琼脂糖电泳后行溴化乙啶染色，再放入凝胶成像系统仪内观察结果，测序分析基因序列。之后将测序结果与人 CYP3A5 基因序列进行比对，判断目标位点的基因型。
1.4 免疫抑制治疗方案
患者术后均采用他克莫司（华东制药有限公司）+吗替麦考酚酯+甲泼尼龙琥珀酸钠三联抗排斥治疗方案。根据患者的临床指标和体质量设定他克莫司的口服初始剂量，同时根据患者的临床生化指标、血药浓度、药物反应及联合用药情况调整给药剂量，使药物浓度维持在治疗水平（6～9 ng/mL）。激素的用法为术中给予 10 mg/kg 静脉输入，术后第 1 天给予 100 mg，每天 20 mg 递减，5 d 后减至 8 mg 口服维持量；吗替麦考酚酯在术后 2～3 d 根据患者术后恢复情况加用 1 500 mg/d；术中和术后第4 天静脉各应用巴利昔单抗（舒莱）20 mg。
1.5 他克莫司血药浓度的测定
他克莫司于术后 1 d 开始口服，并规定服药时间在 6∶00 和 18∶00，餐前 1 h 服用，于清晨 5∶30、服用他克莫司前抽血测定血药谷浓度。根据服药剂量、患者体质量及血药谷浓度，分别计算肝移植术后 1、2、3 及 4 周时他克莫司的浓度/剂量比：浓度/剂量比=血药谷浓度（ng/mL）×当日患者体质量（kg）/每日服药剂量（mg）。
1.6 统计学方法
所有统计分析均通过 SPSS 17.0 统计软件完成。其中计量资料均采用均数±标准差（
±s）或中位数（M）表示，多组之间比较采用 Kruskal-Wallis H 检验，两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 供、受体 CYP3A5 基因分型结果
98 例肝移植患者及相应供体的 CYP3A5 基因分型（位点为 A6986G）结果见表 2，其中供受体 CYP3A5 基因型均以 GG 型最多，AA 型最少，且等位基因分布符合遗传规律，差异无统计学意义（P>0.05）。此外，3 种基因型供受体的性别、年龄及体质量比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表 2。
表2
98 例肝移植供受体的 CYP3A5 基因型
2.2 供、受体 CYP3A5 基因型与他克莫司浓度/剂量比值的关系
术后 1、2、3 及 4 周时，不管是在供体还是在受体中，3 种基因型组的他克莫司浓度/剂量比两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），具体为 GG>AG>AA，表明他克莫司浓度/剂量与供受体的 CYP3A5 基因型相关。见表 3。
表3
供受体 CYP3A5 基因分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
2.3 供受体 CYP3A5 基因联合分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
以上结果表明，CYP3A5 基因型中携带 A 等位基因患者的他克莫司浓度/剂量比低于仅携带 G 等位基因的患者，代谢较快，属于 CYP3A5 快代谢型；CYP3A5 GG 型个体的代谢较慢，属于 CYP3A5 慢代谢型。为进一步探索供受体 CYP3A5 基因型与肝移植患者他克莫司浓度/剂量比值的关系，本研究联合供受体 CYP3A5 基因型进行分组，进一步验证供受体基因型对他克莫司代谢的影响。将供受体分为 A*/A*（供体/受体：AA/AA、AA/AG、AG/AA 和 AG/AG）、A*/GG（供体/受体：AA/GG 和 AG/GG）、GG/A*（供体/受体：GG/AA 和 GG/AG）和 GG/GG（供体/受体）4 组，比较他克莫司浓度/剂量比值。结果显示，各时间点 4 组间他克莫司浓度/剂量比值两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表 4。
表4
供受体 CYP3A5 基因联合分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
3 讨论
他克莫司是一种脂溶性的大环内酯类免疫抑制剂，目前广泛应用于肝移植术后的抗排斥治疗，其经口服后主要在空肠和回肠中吸收，然后通过肠道和肝脏代谢清除[3-7]。细胞色素 P450（CYP）酶系是人类最重要的药物代谢酶，参与大部分药物在体内的代谢，其中 CYP3A 是最重要的 CYP 亚家族，主要分布在肝脏和小肠上皮上[8-14]。目前一些心、肺和肾移植研究表明，细胞色素 CYP3A5 代谢酶基因分型与他克莫司血药浓度存在明显的相关性[15-16]。在肝移植中，由于他克莫司的血药浓度要同时受到供、受体的基因遗传背景的双重影响，因此其影响他克莫司药物代谢的机制更为复杂。
本研究通过术前检测 98 例肝移植供受体的 CYP3A5 基因型，并记录术后 1、2、3 及 4 周他克莫司的血药浓度，然后分析肝移植供受体双方 CYP3A5 基因分型与他克莫司浓度/剂量比的关系，结果发现，供受体 CYP3A5 基因型与他克莫司代谢存在明显的相关性。3 种基因型肝移植供受体术后他克莫司浓度/剂量比的顺序为：GG>AG>AA；为排除供受体 CYP3A5 基因型不同对研究的影响，本研究进一步进行了分组分析，更加全面地探讨了供受体 CYP3A5 基因分型与他克莫司药物浓度/剂量两者的关系。根据供受体基因型进行联合分组，分为供受体 A*/A*、A*/GG、GG/A*和 GG/GG 4 组，并分析各组基因分型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系。结果表明，各时点均是 A*/A*组的血药浓度/剂量比最小，GG/GG 组的血药浓度/剂量比最高。
由此表明，肝移植供受体的 CYP3A5 基因分型共同影响着术后他克莫司的代谢，AA 和 AG 型代谢较快，GG 型代谢较慢。对肝移植术后早期患者，供受体双方只要有一个属于快代谢，该患者对于他克莫司就为快代谢患者，因此供受体为双快代谢者需要更高的他克莫司剂量，才能达到治疗效果；对于供受体为双慢代谢者，需要较小的剂量就能达到较高的血药浓度，因此在加药量时需要更加小心谨慎。在对肝移植术后早期患者制定他克莫司个体化用药方案时既要充分考虑患者身高、体质量等非遗传因素的影响，同时也要根据供受体 CYP3A5 基因型组合调整他克莫司的用量，调整方案应按照 A*/A*>A*/GG>GG/A*>GG/GG 来制定。
综上所述，本研究结果表明，供受体 CYP3A5 基因型与他克莫司的浓度/剂量比存在明显相关性。因此，探索药物代谢基因的遗传背景，了解患者不同基因分型的药物代谢特点，对于调整他克莫司的临床使用剂量具有重要参考价值。也就是说，供受体 CYP3A5 基因型的测定，可以为肝移植术后他克莫司的个体化用药提供积极有效的参考，帮助我们建立个体化的临床治疗方案[17-25]。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：杨兵，实施研究、采集数据、起草文章和统计分析；郭庆军，分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅；田大治、李俊杰、陈池义和蒋文涛，对文章的知识性内容作批评性审阅；张骊，对文章的知识性内容作批评性审阅并获取研究经费；谢炎，酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性审阅。
伦理声明：本研究已通过天津市第一中心医院伦理委员会的审核批准。
患者肝移植术后免疫抑制剂不足或过量均可导致不良预后，个体化免疫抑制治疗是主要解决措施[1]。他克莫司是肝移植术后免疫抑制治疗的基础用药，但其治疗窗狭窄，药代动力学个体差异大，临床上很难建立经验用药的方案[2-3]。本研究通过测定肝移植供受体的 CYP3A5 基因分型，从而探讨不同个体间药物代谢基因的差异对他克莫司代谢的影响。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
纳入标准：① 年龄在 18 到 70 岁之间；② 首次行同种异体原位肝移植术；③ 无严重心、肺、肾等疾病；④ 术后均采用相同的免疫抑制治疗方案（他克莫司+吗替麦考酚酯+注射用甲泼尼龙琥珀酸钠）。排除标准：① 临床及术后随访资料不全；② 多器官联合移植；③ 患者术后早期肝功能延迟恢复；④ 依从性差且结果准确性差（如服药或抽血时间不规律）的患者；⑤ 患者术后应用影响 CYP3A4 和 CYP3A5 酶活性的药物（如伏立康唑、伊曲康唑和雷帕霉素），或氨基糖苷类、两性霉素 B、环孢素等可能会增加他克莫司副反应的药物；⑥ 术后胃肠道功能长期不能恢复（如严重腹泻、呕吐等），影响他克莫司吸收的患者；⑦ 存在严重贫血、重度感染或电解质紊乱等严重影响预后的疾病。
1.2 临床资料
回顾性收集天津市第一中心医院 2018 年 7 月至 2019 年 6 月期间符合标准的肝移植患者及其对应供体的临床资料。所有研究对象在术前检测了 CYP3A5 基因型。同时采集供受体的姓名、性别、年龄、住院号、联系方式、原发病、手术日期、血型、体质量等一般资料。所有患者术后均采用相同的抗排斥治疗方案，均未出现严重感染、排斥反应或药物肾毒性，并检测术后 1、2、3 及 4 周时他克莫司的血药浓度。最终根据纳入和排除标准纳入肝移植患者及其对应供体各 98 例，其临床资料见表 1。
表1
98 例供受体的临床资料
1.3 CYP3A5 基因分型测定
术前应用 EDTA 抗凝管采集供体和受体外周血，送到指定实验室检测。提取样本 DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测 CYP3A5 基因型，其中 PCR 扩增引物：正引物为 5′-GAAGCAAGTGGGAGAAAG-3′，负引物为 5′-TGATGAAGGGTAATGTGG-3′。PCR 反应条件为：94 ℃ 预变性 4 min；变性、退火及延伸条件分别为 94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s 和 72 ℃ 30 s，共 35 个循环。PCR 扩增产物经 2% 琼脂糖电泳后行溴化乙啶染色，再放入凝胶成像系统仪内观察结果，测序分析基因序列。之后将测序结果与人 CYP3A5 基因序列进行比对，判断目标位点的基因型。
1.4 免疫抑制治疗方案
患者术后均采用他克莫司（华东制药有限公司）+吗替麦考酚酯+甲泼尼龙琥珀酸钠三联抗排斥治疗方案。根据患者的临床指标和体质量设定他克莫司的口服初始剂量，同时根据患者的临床生化指标、血药浓度、药物反应及联合用药情况调整给药剂量，使药物浓度维持在治疗水平（6～9 ng/mL）。激素的用法为术中给予 10 mg/kg 静脉输入，术后第 1 天给予 100 mg，每天 20 mg 递减，5 d 后减至 8 mg 口服维持量；吗替麦考酚酯在术后 2～3 d 根据患者术后恢复情况加用 1 500 mg/d；术中和术后第4 天静脉各应用巴利昔单抗（舒莱）20 mg。
1.5 他克莫司血药浓度的测定
他克莫司于术后 1 d 开始口服，并规定服药时间在 6∶00 和 18∶00，餐前 1 h 服用，于清晨 5∶30、服用他克莫司前抽血测定血药谷浓度。根据服药剂量、患者体质量及血药谷浓度，分别计算肝移植术后 1、2、3 及 4 周时他克莫司的浓度/剂量比：浓度/剂量比=血药谷浓度（ng/mL）×当日患者体质量（kg）/每日服药剂量（mg）。
1.6 统计学方法
所有统计分析均通过 SPSS 17.0 统计软件完成。其中计量资料均采用均数±标准差（±s）或中位数（M）表示，多组之间比较采用 Kruskal-Wallis H 检验，两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 供、受体 CYP3A5 基因分型结果
98 例肝移植患者及相应供体的 CYP3A5 基因分型（位点为 A6986G）结果见表 2，其中供受体 CYP3A5 基因型均以 GG 型最多，AA 型最少，且等位基因分布符合遗传规律，差异无统计学意义（P>0.05）。此外，3 种基因型供受体的性别、年龄及体质量比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表 2。
表2
98 例肝移植供受体的 CYP3A5 基因型
2.2 供、受体 CYP3A5 基因型与他克莫司浓度/剂量比值的关系
术后 1、2、3 及 4 周时，不管是在供体还是在受体中，3 种基因型组的他克莫司浓度/剂量比两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），具体为 GG>AG>AA，表明他克莫司浓度/剂量与供受体的 CYP3A5 基因型相关。见表 3。
表3
供受体 CYP3A5 基因分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
2.3 供受体 CYP3A5 基因联合分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
以上结果表明，CYP3A5 基因型中携带 A 等位基因患者的他克莫司浓度/剂量比低于仅携带 G 等位基因的患者，代谢较快，属于 CYP3A5 快代谢型；CYP3A5 GG 型个体的代谢较慢，属于 CYP3A5 慢代谢型。为进一步探索供受体 CYP3A5 基因型与肝移植患者他克莫司浓度/剂量比值的关系，本研究联合供受体 CYP3A5 基因型进行分组，进一步验证供受体基因型对他克莫司代谢的影响。将供受体分为 A*/A*（供体/受体：AA/AA、AA/AG、AG/AA 和 AG/AG）、A*/GG（供体/受体：AA/GG 和 AG/GG）、GG/A*（供体/受体：GG/AA 和 GG/AG）和 GG/GG（供体/受体）4 组，比较他克莫司浓度/剂量比值。结果显示，各时间点 4 组间他克莫司浓度/剂量比值两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表 4。
表4
供受体 CYP3A5 基因联合分型和术后他克莫司浓度/剂量比的关系
3 讨论
他克莫司是一种脂溶性的大环内酯类免疫抑制剂，目前广泛应用于肝移植术后的抗排斥治疗，其经口服后主要在空肠和回肠中吸收，然后通过肠道和肝脏代谢清除[3-7]。细胞色素 P450（CYP）酶系是人类最重要的药物代谢酶，参与大部分药物在体内的代谢，其中 CYP3A 是最重要的 CYP 亚家族，主要分布在肝脏和小肠上皮上[8-14]。目前一些心、肺和肾移植研究表明，细胞色素 CYP3A5 代谢酶基因分型与他克莫司血药浓度存在明显的相关性[15-16]。在肝移植中，由于他克莫司的血药浓度要同时受到供、受体的基因遗传背景的双重影响，因此其影响他克莫司药物代谢的机制更为复杂。
本研究通过术前检测 98 例肝移植供受体的 CYP3A5 基因型，并记录术后 1、2、3 及 4 周他克莫司的血药浓度，然后分析肝移植供受体双方 CYP3A5 基因分型与他克莫司浓度/剂量比的关系，结果发现，供受体 CYP3A5 基因型与他克莫司代谢存在明显的相关性。3 种基因型肝移植供受体术后他克莫司浓度/剂量比的顺序为：GG>AG>AA；为排除供受体 CYP3A5 基因型不同对研究的影响，本研究进一步进行了分组分析，更加全面地探讨了供受体 CYP3A5 基因分型与他克莫司药物浓度/剂量两者的关系。根据供受体基因型进行联合分组，分为供受体 A*/A*、A*/GG、GG/A*和 GG/GG 4 组，并分析各组基因分型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系。结果表明，各时点均是 A*/A*组的血药浓度/剂量比最小，GG/GG 组的血药浓度/剂量比最高。
由此表明，肝移植供受体的 CYP3A5 基因分型共同影响着术后他克莫司的代谢，AA 和 AG 型代谢较快，GG 型代谢较慢。对肝移植术后早期患者，供受体双方只要有一个属于快代谢，该患者对于他克莫司就为快代谢患者，因此供受体为双快代谢者需要更高的他克莫司剂量，才能达到治疗效果；对于供受体为双慢代谢者，需要较小的剂量就能达到较高的血药浓度，因此在加药量时需要更加小心谨慎。在对肝移植术后早期患者制定他克莫司个体化用药方案时既要充分考虑患者身高、体质量等非遗传因素的影响，同时也要根据供受体 CYP3A5 基因型组合调整他克莫司的用量，调整方案应按照 A*/A*>A*/GG>GG/A*>GG/GG 来制定。
综上所述，本研究结果表明，供受体 CYP3A5 基因型与他克莫司的浓度/剂量比存在明显相关性。因此，探索药物代谢基因的遗传背景，了解患者不同基因分型的药物代谢特点，对于调整他克莫司的临床使用剂量具有重要参考价值。也就是说，供受体 CYP3A5 基因型的测定，可以为肝移植术后他克莫司的个体化用药提供积极有效的参考，帮助我们建立个体化的临床治疗方案[17-25]。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：杨兵，实施研究、采集数据、起草文章和统计分析；郭庆军，分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅；田大治、李俊杰、陈池义和蒋文涛，对文章的知识性内容作批评性审阅；张骊，对文章的知识性内容作批评性审阅并获取研究经费；谢炎，酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性审阅。
伦理声明：本研究已通过天津市第一中心医院伦理委员会的审核批准。
