引用本文： 贺赛, 耿洁, 杨晓民, 王虎霞, 韩丕华, 侯艳妮, 范拥国, 陈楠. shRNA靶向沉默CNTN1表达对人乳腺癌细胞株MDA-MB-468裸鼠皮下移植瘤的抑制作用. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(11): 1371-1374. doi: 10.7507/1007-9424.202002056 复制
乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤第 1 位[1]。虽然以手术为主的综合治疗使乳腺癌的预后有了明显改善，但总体预后仍不理想[2-3]。有研究发现接触蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因作为癌基因在包括前列腺癌、肺癌及胃癌在内的多种肿瘤中异常表达与其发生及发展有关[4-7]，然而其在乳腺癌中的功能研究却鲜有报道。本课题组通过前期研究[8]发现沉默 CNTN1 基因表达可以显著降低乳腺癌细胞的增殖及克隆形成能力，为进一步探讨 CNTN1 基因在乳腺癌中的功能，本研究采用皮下注射乳腺癌细胞构建裸鼠人乳腺癌移植模型，进一步观察沉默 CNTN1 基因在体内环境中对乳腺癌移植瘤生长的影响，从而为乳腺癌的治疗发现新靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料
DMEM 细胞培养基和胎牛血清购自美国 Invitrogen 公司，兔抗人 CNTN1、Ki-67 单克隆一抗购自美国 Epitomics 公司，羊抗兔二抗、SP 兔 HRP 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验动物与细胞株
4 周龄雄性 BALB/c 裸鼠 18 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于 SPF 条件下。人乳腺癌细胞株 MDA-MB-468（空白对照组）、转染无义 shRNA 片段的 MDA-MB-468 细胞（空载体组）及转染 shRNA 载体片段的 MDA-MB-468 细胞（沉默组）均由本课题组前期构建并保存，置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，取生长状态良好的细胞进行实验。
1.3 裸鼠移植瘤模型的建立
18 只 BALB/c 裸鼠采用随机数字表法随机分为 3 组，DMEM 细胞培养每组 6 只。收集处于对数生长期的各组（空白对照组、空载体组和沉默组）细胞，细胞密度均调整至 5×106/mL，然后分别于裸鼠后背部皮下注射 0.2 mL 不同细胞，种植完成后，每天观察并记录肿块出现时间。肿瘤形成后继续观察，每 3 d 用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径后计算肿瘤体积（肿瘤体积=π/6×长径×短径2）并绘制肿瘤生长曲线。于肿块长至直径 1.5～2.0 cm 大小时，断颈处死裸鼠，摘取移植瘤并称其质量，然后计算抑瘤率，其公式为：抑瘤率（%）=（空白对照组瘤平均质量–沉默组瘤平均质量）/空白对照组瘤平均质量×100%。
1.4 移植瘤组织中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达检测
采用免疫组化法检测各组裸鼠移植瘤组织中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白的表达。将各组裸鼠移植瘤组织经 4% 多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片（ 4～6 μm 厚）。依次将载玻片放入二甲苯→二甲苯→100% 乙醇→100% 乙醇→95% 乙醇→90% 乙醇→80% 乙醇→70% 乙醇，每种试剂中放 10 min，清水冲洗，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，清水冲洗 2 次，后加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），冷却至室温，将柠檬酸缓冲液倒掉，清水冲洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中 5 min，擦干组织周围的 PBS，加血清，放入 37 ℃ 温箱 30 min，加一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存过夜。取出载玻片，放入 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加入二抗，37 ℃ 温箱中 30 min。后放入 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加入显色剂。将显色后的片子用清水冲洗，浸泡于苏木精中染色 1 min。依次将载玻片放入 70% 乙醇→80% 乙醇→90% 乙醇→95% 乙醇→100% 乙醇→100% 乙醇→二甲苯→二甲苯，每种试剂中放置 2 min，用中性树胶封片，以 PBS 代替一抗作阴性对照。胞质或胞核呈棕黄色染色为阳性，其中 CNTN1 蛋白阳性表达以胞质着色为主，Ki-67 蛋白阳性表达以胞核染色为主，每张切片随机取 5 个视野（×400），每个视野观察 200 个细胞，计算阳性细胞率。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学分析。对符合正态分布的计量数据以均数±标准差（
±s）表示，多个样本均数比较用单因素方差分析，两样本均数比较用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 沉默 CNTN1 基因表达对裸鼠皮下种植瘤生长的影响
裸鼠皮下分别接种各组细胞悬液后全部存活且于第 6 天有肿瘤形成，致瘤成功率 100%。各组种植瘤持续生长，未出现致瘤裸鼠死亡。至第 18 天时，肿瘤生长至 1.5～2.0 cm，拍照记录并处死裸鼠获取肿瘤（图 1a）。绘制肿瘤生长曲线（图 1b），可见沉默组种植瘤生长速度低于空白对照组（P<0.05）与空载体组（P<0.05），空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）；至第 18 天处死裸鼠时沉默组裸鼠皮下种植瘤的体积显著小于空白对照组（P<0.05）与空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）。处死裸鼠时获取的各组肿瘤质量见图 1c，种植瘤质量沉默组明显低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）。沉默组的抑瘤率为 51.72%。
图1
示各组裸鼠皮下种植瘤生长情况及 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达检测结果
a：各组移植瘤生长至第 18 天时的肿瘤情况及取出的肿瘤；b：各组裸鼠移植瘤生长曲线；c：各组裸鼠移植瘤质量；d、e：分别为各组种植瘤中 CNTN1 蛋白表达的定性（SP ×200）及半定量结果；f、g：分别为各组种植瘤中 Ki-67 蛋白表达的定性（SP ×200）及半定量结果。1：空白对照组；2：空载体组；3：沉默组。与空白对照组和空载体组比较，*
2.2 各组种植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达结果
结果见图 1d-1g。CNTN1 蛋白在肿瘤细胞中呈阳性棕黄色染色表达于细胞质（图 1d）；Ki-67 蛋白在肿瘤细胞中呈阳性棕黄色染色表达于细胞核（图 1f）。肿瘤细胞中 CNTN1 蛋白表达阳性率在沉默组低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1e；Ki-67 蛋白表达阳性率在沉默组明显低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1g。
3 讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[9]，预后欠佳并有年轻化趋势[10]。随着新的药物研发、手术方式的改进和多种治疗方法的介入，乳腺癌患者生存期显著提高，但综合治疗副作用较大，患者对治疗效果仍有较高预期[11-12]。近年来，随着遗传学和肿瘤分子生物学研究的深入，肿瘤的基因治疗作为一种新的治疗手段逐步应用于临床[13]，人们期待基因治疗在乳腺癌领域也能够发挥作用，但目前仍未能找到有效的乳腺癌治疗靶点[14]。
恶性肿瘤的发生及发展与基因的异常表达密切相关[15]。随着对肿瘤相关基因研究的深入，CNTN1 作为一种神经接触分子渐渐开始被研究者关注[16]，其参与介导了神经系统的生长发育和多种神经细胞的功能[17]，它的异常表达与肿瘤的发生发展、迁移侵袭、转移甚至预后关系密切[18-20]。Su 等[21]通过基因芯片技术，首次发现 CNTN1 基因是影响肺癌细胞侵袭能力的重要基因之一。Wu 等[22]发现 CNTN1 的表达与口腔鳞状细胞癌的淋巴道转移相关。Liu 等[23]在一项研究 CNTN1 与食管鳞状细胞癌关系的实验中发现，CNTN1 基因和其受体促进了肿瘤的血管和淋巴管生成，并且发现 VEGF-C 是通过调控 CNTN1 的表达，从而促进食管鳞状细胞癌细胞系的侵袭能力。亦有研究[24]显示，CNTN1 在胃癌原发灶中异常表达，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基础，影响胃癌淋巴道的转移，对胃癌的诊断、治疗及预后有一定的指导价值。目前针对 CNTN1 在乳腺肿瘤中的研究相对较少[25]，在乳腺癌中的功能仍尚不明确，因此，本课题组拟通过系列研究阐明 CNTN1 在乳腺癌中的功能并进一步明确其影响乳腺癌发生及发展的可能机制。
在前期工作中，本课题组已成功获得沉默 CNTN1 基因表达的人乳腺癌细胞株 MDA-MB-468，发现沉默乳腺癌细胞系中 CNTN1 的表达可抑制乳腺癌细胞系的增殖、克隆形成以及迁移侵袭能力。为进一步明确 CNTN1 在乳腺癌中的作用，本实验拟在体内实验通过沉默乳腺癌细胞中 CNTN1 的表达，研究其与裸鼠皮下移植瘤生长的关系。结果显示，沉默组肿瘤生长速度、体积及质量均显著慢或小或轻于空白对照组，提示沉默 CNTN1 的表达能抑制 MDA-MB-468 移植瘤的生长。此外，通过免疫组化法检测移植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 的表达情况，结果显示，沉默组种植瘤中 CNTN1 蛋白表达阳性率明显低于空白对照组，这是 CNTN1 基因被沉默表达的结果；同时该组中增殖细胞核抗原 Ki-67 的蛋白表达阳性率明显低于空白对照组，基于 Ki-67 体现的是肿瘤增殖活性，这与沉默组肿瘤生长被抑制结果相符。
本实验结果初步证明沉默 CNTN1 表达可有效抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的生长，提示 CNTN1 在乳腺癌的发病中可能起重要作用，为后续研究 CNTN1 基因在乳腺癌中的作用奠定了基础，同时为乳腺癌的治疗发现新靶点提供初步的理论依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：贺赛参与实验设计及部分实验研究；陈楠参与分析、解释数据及统计分析；耿洁、杨晓民、王虎霞、韩丕华参与部分实验研究及采集数据；侯艳妮、范拥国参与对文章的知识性内容作批评性审阅及起草文章。
伦理声明：本研究已通过陕西省肿瘤医院伦理委员会的审核批准。
乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤第 1 位[1]。虽然以手术为主的综合治疗使乳腺癌的预后有了明显改善，但总体预后仍不理想[2-3]。有研究发现接触蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因作为癌基因在包括前列腺癌、肺癌及胃癌在内的多种肿瘤中异常表达与其发生及发展有关[4-7]，然而其在乳腺癌中的功能研究却鲜有报道。本课题组通过前期研究[8]发现沉默 CNTN1 基因表达可以显著降低乳腺癌细胞的增殖及克隆形成能力，为进一步探讨 CNTN1 基因在乳腺癌中的功能，本研究采用皮下注射乳腺癌细胞构建裸鼠人乳腺癌移植模型，进一步观察沉默 CNTN1 基因在体内环境中对乳腺癌移植瘤生长的影响，从而为乳腺癌的治疗发现新靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料
DMEM 细胞培养基和胎牛血清购自美国 Invitrogen 公司，兔抗人 CNTN1、Ki-67 单克隆一抗购自美国 Epitomics 公司，羊抗兔二抗、SP 兔 HRP 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验动物与细胞株
4 周龄雄性 BALB/c 裸鼠 18 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于 SPF 条件下。人乳腺癌细胞株 MDA-MB-468（空白对照组）、转染无义 shRNA 片段的 MDA-MB-468 细胞（空载体组）及转染 shRNA 载体片段的 MDA-MB-468 细胞（沉默组）均由本课题组前期构建并保存，置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，取生长状态良好的细胞进行实验。
1.3 裸鼠移植瘤模型的建立
18 只 BALB/c 裸鼠采用随机数字表法随机分为 3 组，DMEM 细胞培养每组 6 只。收集处于对数生长期的各组（空白对照组、空载体组和沉默组）细胞，细胞密度均调整至 5×106/mL，然后分别于裸鼠后背部皮下注射 0.2 mL 不同细胞，种植完成后，每天观察并记录肿块出现时间。肿瘤形成后继续观察，每 3 d 用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径后计算肿瘤体积（肿瘤体积=π/6×长径×短径2）并绘制肿瘤生长曲线。于肿块长至直径 1.5～2.0 cm 大小时，断颈处死裸鼠，摘取移植瘤并称其质量，然后计算抑瘤率，其公式为：抑瘤率（%）=（空白对照组瘤平均质量–沉默组瘤平均质量）/空白对照组瘤平均质量×100%。
1.4 移植瘤组织中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达检测
采用免疫组化法检测各组裸鼠移植瘤组织中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白的表达。将各组裸鼠移植瘤组织经 4% 多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片（ 4～6 μm 厚）。依次将载玻片放入二甲苯→二甲苯→100% 乙醇→100% 乙醇→95% 乙醇→90% 乙醇→80% 乙醇→70% 乙醇，每种试剂中放 10 min，清水冲洗，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，清水冲洗 2 次，后加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），冷却至室温，将柠檬酸缓冲液倒掉，清水冲洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中 5 min，擦干组织周围的 PBS，加血清，放入 37 ℃ 温箱 30 min，加一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存过夜。取出载玻片，放入 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加入二抗，37 ℃ 温箱中 30 min。后放入 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加入显色剂。将显色后的片子用清水冲洗，浸泡于苏木精中染色 1 min。依次将载玻片放入 70% 乙醇→80% 乙醇→90% 乙醇→95% 乙醇→100% 乙醇→100% 乙醇→二甲苯→二甲苯，每种试剂中放置 2 min，用中性树胶封片，以 PBS 代替一抗作阴性对照。胞质或胞核呈棕黄色染色为阳性，其中 CNTN1 蛋白阳性表达以胞质着色为主，Ki-67 蛋白阳性表达以胞核染色为主，每张切片随机取 5 个视野（×400），每个视野观察 200 个细胞，计算阳性细胞率。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学分析。对符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数比较用单因素方差分析，两样本均数比较用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 沉默 CNTN1 基因表达对裸鼠皮下种植瘤生长的影响
裸鼠皮下分别接种各组细胞悬液后全部存活且于第 6 天有肿瘤形成，致瘤成功率 100%。各组种植瘤持续生长，未出现致瘤裸鼠死亡。至第 18 天时，肿瘤生长至 1.5～2.0 cm，拍照记录并处死裸鼠获取肿瘤（图 1a）。绘制肿瘤生长曲线（图 1b），可见沉默组种植瘤生长速度低于空白对照组（P<0.05）与空载体组（P<0.05），空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）；至第 18 天处死裸鼠时沉默组裸鼠皮下种植瘤的体积显著小于空白对照组（P<0.05）与空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）。处死裸鼠时获取的各组肿瘤质量见图 1c，种植瘤质量沉默组明显低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组比较差异无统计学意义（P>0.05）。沉默组的抑瘤率为 51.72%。
图1
示各组裸鼠皮下种植瘤生长情况及 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达检测结果
a：各组移植瘤生长至第 18 天时的肿瘤情况及取出的肿瘤；b：各组裸鼠移植瘤生长曲线；c：各组裸鼠移植瘤质量；d、e：分别为各组种植瘤中 CNTN1 蛋白表达的定性（SP ×200）及半定量结果；f、g：分别为各组种植瘤中 Ki-67 蛋白表达的定性（SP ×200）及半定量结果。1：空白对照组；2：空载体组；3：沉默组。与空白对照组和空载体组比较，*
2.2 各组种植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表达结果
结果见图 1d-1g。CNTN1 蛋白在肿瘤细胞中呈阳性棕黄色染色表达于细胞质（图 1d）；Ki-67 蛋白在肿瘤细胞中呈阳性棕黄色染色表达于细胞核（图 1f）。肿瘤细胞中 CNTN1 蛋白表达阳性率在沉默组低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1e；Ki-67 蛋白表达阳性率在沉默组明显低于空白对照组（P<0.05）及空载体组（P<0.05），而空白对照组与空载体组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1g。
3 讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[9]，预后欠佳并有年轻化趋势[10]。随着新的药物研发、手术方式的改进和多种治疗方法的介入，乳腺癌患者生存期显著提高，但综合治疗副作用较大，患者对治疗效果仍有较高预期[11-12]。近年来，随着遗传学和肿瘤分子生物学研究的深入，肿瘤的基因治疗作为一种新的治疗手段逐步应用于临床[13]，人们期待基因治疗在乳腺癌领域也能够发挥作用，但目前仍未能找到有效的乳腺癌治疗靶点[14]。
恶性肿瘤的发生及发展与基因的异常表达密切相关[15]。随着对肿瘤相关基因研究的深入，CNTN1 作为一种神经接触分子渐渐开始被研究者关注[16]，其参与介导了神经系统的生长发育和多种神经细胞的功能[17]，它的异常表达与肿瘤的发生发展、迁移侵袭、转移甚至预后关系密切[18-20]。Su 等[21]通过基因芯片技术，首次发现 CNTN1 基因是影响肺癌细胞侵袭能力的重要基因之一。Wu 等[22]发现 CNTN1 的表达与口腔鳞状细胞癌的淋巴道转移相关。Liu 等[23]在一项研究 CNTN1 与食管鳞状细胞癌关系的实验中发现，CNTN1 基因和其受体促进了肿瘤的血管和淋巴管生成，并且发现 VEGF-C 是通过调控 CNTN1 的表达，从而促进食管鳞状细胞癌细胞系的侵袭能力。亦有研究[24]显示，CNTN1 在胃癌原发灶中异常表达，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基础，影响胃癌淋巴道的转移，对胃癌的诊断、治疗及预后有一定的指导价值。目前针对 CNTN1 在乳腺肿瘤中的研究相对较少[25]，在乳腺癌中的功能仍尚不明确，因此，本课题组拟通过系列研究阐明 CNTN1 在乳腺癌中的功能并进一步明确其影响乳腺癌发生及发展的可能机制。
在前期工作中，本课题组已成功获得沉默 CNTN1 基因表达的人乳腺癌细胞株 MDA-MB-468，发现沉默乳腺癌细胞系中 CNTN1 的表达可抑制乳腺癌细胞系的增殖、克隆形成以及迁移侵袭能力。为进一步明确 CNTN1 在乳腺癌中的作用，本实验拟在体内实验通过沉默乳腺癌细胞中 CNTN1 的表达，研究其与裸鼠皮下移植瘤生长的关系。结果显示，沉默组肿瘤生长速度、体积及质量均显著慢或小或轻于空白对照组，提示沉默 CNTN1 的表达能抑制 MDA-MB-468 移植瘤的生长。此外，通过免疫组化法检测移植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 的表达情况，结果显示，沉默组种植瘤中 CNTN1 蛋白表达阳性率明显低于空白对照组，这是 CNTN1 基因被沉默表达的结果；同时该组中增殖细胞核抗原 Ki-67 的蛋白表达阳性率明显低于空白对照组，基于 Ki-67 体现的是肿瘤增殖活性，这与沉默组肿瘤生长被抑制结果相符。
本实验结果初步证明沉默 CNTN1 表达可有效抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的生长，提示 CNTN1 在乳腺癌的发病中可能起重要作用，为后续研究 CNTN1 基因在乳腺癌中的作用奠定了基础，同时为乳腺癌的治疗发现新靶点提供初步的理论依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：贺赛参与实验设计及部分实验研究；陈楠参与分析、解释数据及统计分析；耿洁、杨晓民、王虎霞、韩丕华参与部分实验研究及采集数据；侯艳妮、范拥国参与对文章的知识性内容作批评性审阅及起草文章。
伦理声明：本研究已通过陕西省肿瘤医院伦理委员会的审核批准。
