引用本文： 刘双飞, 张熙冰, 焦凌峰, 冉江华. 钙离子/钙调蛋白/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信号通路在肝纤维化调控中作用的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(9): 1141-1146. doi: 10.7507/1007-9424.202404021 复制
肝纤维化是肝损伤后的创伤愈合发生的再生过程，在此过程中损伤因子持续存在，它可导致肝脏基质组织过量沉积和肝功能受损，至终末期时肝纤维化会发展为肝硬化。每年因肝硬化导致的肝功能失代偿和肝细胞癌中约有200万人死亡，占全球所有死亡人数的3.5%以上[1]。因此，对肝纤维化进行了解和干预意义重大。目前普遍认同肝纤维化是一个动态且可逆的过程[2]。鉴于此，避免肝纤维化进展为肝硬化，通过阻断或逆转肝纤维化的进程已成为治疗肝脏疾病（简称“肝病” ）纤维化的核心内容。目前临床上尽管已采用病因治疗、肝细胞保护、抗氧化治疗等对症处理对肝纤维化进行干预，但仍未发现特异有效的抗肝纤维化的方法，因此对其机制及相关通路进行进一步深入了解仍有必要。现有相关研究发现，钙离子（ionized free calcium，Ca2+）可通过钙调蛋白（calmodulin，CaM）依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaM dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）参与肝纤维化，它在肝纤维化中扮演重要角色[3]。现对Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化中的作用研究的成果进行归纳总结，旨在为通过对该信号通路的干预防治临床肝纤维化提供新思路。
1 肝纤维化及其机制
肝纤维化是脂肪性、病毒性、酒精性或非酒精性脂肪性等慢性肝病进展过程中的共同阶段，是肝硬化发展的阶段性病理表现，其病理特征为肝小叶中央区和汇管区有不同程度的纤维组织增生或纤维间隔形成，它主要涉及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的产生及降解失衡[4]以及促炎和抗炎失衡。最常见的纤维化肝病是非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝病，其中非酒精性脂肪性肝病常发展为非酒精性脂肪性肝炎[5]，在此过程中的主要病理学改变是肝小叶炎症和肝细胞气球样变，脂毒性、氧化还原失衡、内质网应激、炎症激活和细胞凋亡参与了此过程[6]；在病毒性肝病发展为病毒性肝炎过程中，非实质细胞在干扰素基因刺激因子作用下产生干扰素和促炎因子，从而启动免疫反应抑制病毒复制，同时导致结缔组织增生而造成肝细胞结构功能紊乱[7]，当受到病毒等病理因子刺激时肝脏发生免疫细胞聚集和炎症激活，以启动纤维化过程修复损伤，炎症进一步激活肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，从而分泌α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和肝细胞生长因子，加速肝纤维化形成[8-9]。当损伤为短期存在或自限性时，这一反应过程可被逆转，肝脏结构可恢复正常；但是像酒精性、脂质性等慢性损伤因子持续存在或反复时，肝脏发生促炎与抗炎失衡和ECM产生及降解失衡。ECM稳态失衡会导致肝实质内纤维瘢痕增多、正常肝小叶结构被破坏，从而发生纤维化；而炎症失衡则通过损伤肝功能而影响纤维化分期。
1.1 ECM产生及降解失衡
ECM稳态失衡是纤维化发生及发展中的重要状态。成纤维细胞是ECM合成分泌的主要来源，其中肌成纤维细胞是一种假定的成纤维细胞亚型，它是纤维化反应的关键效应细胞，而大部分肌成纤维细胞由肝星状细胞分化形成，肝星状细胞在肝纤维化的发生及发展中起重要作用[10]。肝星状细胞作为一种非实质细胞，在肝纤维化病理生理过程中能分泌ECM并参与胶原形成、合成基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs），促进ECM产生和降解稳态失衡；此外，它还能调节肝窦内微循环推进纤维化进程。在静息状态下，肝星状细胞位于Disse间隙，主要分泌Ⅳ型胶原纤维，当病毒、乙醇、脂质等各种病理因子持续刺激，导致巨噬细胞激活释放细胞因子，在血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等细胞因子诱导下肝星状细胞被激活分化，同时发生迁移并移至损伤部位，增殖并转化为成纤维细胞，合成大量ECM和Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的胶原纤维，并且上调TIMPs表达导致ECM的降解减少[1, 11]，从而造成ECM的产生及降解失衡；同时肌成纤维细胞内含有肌丝使得它兼有收缩功能，在肝损伤修复后期，这种收缩作用和ECM的过量产生共同作用破坏肝小叶结构，导致假小叶形成，从而引起肝脏发生纤维化。
1.2 促炎和抗炎失衡
炎症是各种急慢性肝病进展的重要因素，炎症应答最初是为了阻断细菌、病毒等刺激，保护肝脏免受进一步损害，在这种应答过程中Kupffer细胞、肥大细胞等炎症应答细胞激活产生了一系列细胞因子，这类细胞因子在诱导免疫细胞聚集清除损伤因素的同时也对肝星状细胞产生造成一系列反应，从而加速或延缓肝纤维化的发生。Kupffer细胞是一种肝脏中特殊类型巨噬细胞，它在肝损伤时应答激活参与炎症调控，其他类型巨噬细胞如M1和M2型巨噬细胞，M1型细胞在干扰素γ、脂多糖激活下分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等促进炎症发生损伤肝细胞；而M2型细胞在IL-4、IL-13作用下分泌IL-10发挥抗炎作用，但同时它也分泌TGF-β1、PDGF等细胞因子诱导肝星状细胞活化促进肝纤维化进程[12]。TGF-β1和TNF-α作为多功能细胞因子，是肝纤维化刺激肝星状细胞从静止细胞活化为肌成纤维细胞的关键调节因子，它通过上调α-SMA介导肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞和刺激Ⅰ型胶原和其他基质表达[13-14]，而TNF-α可通过激活核因子-κB、Bcl-XL和p21诱导活化肝星状细胞抗凋亡，但它又能激活caspase-8产生促细胞凋亡[12]。此外，IL-17和IL-1是纤维化过程中两个较为重要的炎症因子，IL-17由另一种免疫应答细胞Th17细胞产生，它可诱导 Kupffer细胞和M1、M2型细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β1等细胞因子促进α-SMA和TGF-β1表达增加，从而作用于肝星状细胞而实现炎症反应和肝星状细胞激活之间串联[15-16]，IL-1则通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中的核心成员c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38通路上调MMP-13和TIMP表达参与纤维化进程。另一类在纤维化中发挥作用的炎性细胞是肥大细胞，它可通过抑制MMP和促进其抑制剂TIMP抑制ECM降解参与纤维化调控[17]。由此可见，炎症在肝纤维化中扮演了一个始动者作用，炎性细胞被激活后产生TNF-α、TGF-β、IL等细胞因子[18]，这些细胞因子在诱导肝星状细胞活化的同时，还激活肝细胞保护、程序性死亡等信号传导途径调节肝脏损伤后自我修复，当这种修复作用超出其自身调节能力则引起炎症失衡，进一步加重损伤并促进纤维化发展。
2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及它在肝纤维化过程中的作用
2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路概述
Ca2+ 是细胞内不可或缺的第二信使，参与控制多种功能。内质网内Ca2+ 浓度变化参与蛋白质合成及无机物代谢，线粒体内Ca2+ 浓度调节参与三磷酸腺苷合成、三羧酸循环[19]、细胞凋亡[20]等。Ca2+ 浓度平衡是胞内“钙库”摄取和释放钙、跨细胞膜钙离子转运共同作用的结果。肝细胞内Ca2+ 浓度变化参与胆汁酸分泌、物质能量代谢、蛋白质合成和分泌、细胞周期调控、细胞增殖和程序性死亡、溶酶体、其他囊泡运动等几乎所有肝细胞生理和病理过程[21-23]。
CaM是真核细胞内主要的Ca2+ 传感器，是哺乳动物中Ca2+ 信号的主要转导蛋白[24]，它在胞内无酶活性，通过作为Ca2+ 的转运体和结合激活CaMKⅡ而发挥作用。细胞内Ca2+ 浓度的升高既能促进细胞增殖[25]，也能诱导细胞凋亡[26]，因此，CaM作为细胞内Ca2+ 的转运体对细胞凋亡能发挥正向或负向的调节作用。CaM可能通过多种不同的机制调节细胞增殖，如CaM易位到细胞核并驱动血管平滑肌细胞的表型转换[27]，CaM可通过与caspase相互作用而诱导肝星状细胞凋亡[28]，CaM还能直接结合转录因子（CaM结合转录激活因子）参与多种组织中细胞的生长、分化调节[29]。
CaMK是Ca2+-CaM复合物调控的下游靶酶之一。CaMK是一个对多种细胞刺激产生反应的蛋白家族。多功能CaMK的成员包括CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ[29-30]，其中CaMKⅡ包含 α、β、γ、δ 4种亚基和17种同工酶，它在哺乳动物全身各组织中均有广泛表达，但在不同的组织中其表达量及亚基构成不一样，如γ亚基在肝脏组织中的比例较高[31]。CaMKⅡ具有自激活功能，由钙调素直接激活[32-33]。相关研究显示，CaMKⅡ是细胞中Ca2+/CaM信号通路的下游效应蛋白，而CaMKⅡγ是细胞凋亡和自噬的上游调节因子，与Ca2+/CaM/CaMKⅡ结合可缓解CaMKⅡ家族酶的羧化结构域的自抑制作用，CaMKⅡ多聚、导致自磷酸化和相互磷酸化，从而延长激酶活性，触发广泛的信号传导作用参与细胞凋亡[34-36]。大鼠肝移植缺血再灌注模型中，CaMKⅡγ与肝细胞肝酶异常、线粒体功能障碍和凋亡呈高度正相关[37]，这也证实了CaMKⅡγ可介导肝细胞发生凋亡和功能障碍。CaMKⅡ被广泛证实参与器官纤维化。在肾脏中，CaMKⅡ可通过诱导细胞外调节激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）激活参与急性和慢性肾纤维化，抑制其表达后肾脏纤维化标志物蛋白、Ⅰ型胶原、MMP2和α-SMA的表达均被显著抑制，肾脏纤维化明显缓解[38]。同样，在心脏纤维化研究中，抑制CaMKⅡ激活可延缓心肌不良重构并表现抗心律失常作用[39-40]。在肝纤维化中，CaMKⅡγ同样被证实参与肝纤维化调控，且鉴于其上游Ca2+ 对肝脏的双重调控作用，CaMKⅡγ对肝纤维化同样表现为正、负向双重调控。
2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化中的作用
肝纤维化是一个涉及多因素、多环节作用的、复杂的动态过程，肝星状细胞的激活是肝纤维化发生、发展过程中的共同中心事件和关键步骤[41]，激活的肝星状细胞通过增殖分泌大量ECM促进肝纤维化和通过细胞收缩而使肝窦内压升高导致肝硬化与门静脉高压[42]。现阶段关于肝纤维化发生机制的研究主要集中在TGF-β1信号转导通路、PDGF信号转导通路、Hippo信号通路、活性氧作用于肝星状细胞的激活等方面[43]，而Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路主要通过TGF-β1和PDGF相关通路参与肝纤维化调控，对其纤维化调控主要表现在促进或抑制肝星状细胞增殖和促进肝星状细胞凋亡。
2.2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在TGF-β1调控肝纤维化中的作用
TGF-β1是当前最强促纤维化因子之一，TGF-β1/Smad信号转导在纤维化中的作用已得到充分证实[44]。Smad蛋白家族是TGF-β1信号通路中下游的重要效应因子，其中Smad3和Smad4是促纤维化的，而Smad2和Smad7则负向调控肝纤维化。TGF-β1激活TGF-β受体Ⅰ型激酶，导致Smad2、Smad3磷酸化与Smad4复合物结合转导信号至细胞核发挥生物学效应[45]。Smad3过度表达能够抑制成纤维细胞中MMP-1活性而抑制ECM降解，Smad2和Smad7通过抑制Smad3信号对肝纤维化发挥负向作用[46-47]。此外，TGF-β1也能促进p65的磷酸化、甲硫氨酸腺苷转移酶2A的转录表达和随之而来的S-腺苷甲硫氨酸浓度降低来刺激肝星状细胞活化。TGF-β1可通过多种细胞内信号转导途径如MAPK通路等参与肝星状细胞的活化与增殖。ERK是MAPK家族一员，在TGF-β1诱导肝星状细胞增殖实验[48]中发现，ERK发生磷酸化呈现高表达状态，然而在抑制CaMKⅡ表达后，这种磷酸化被减弱，提示CaMKⅡ/ERK信号通路是TGF-β1诱导肝星状细胞增殖的重要调控信号通路。另一研究[49]结果显示，TGF-β1可以诱导肝星状细胞活化增殖，分别用低、中、高浓度CaMKⅡ抑制剂处理后，TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖呈逐步下降趋势且肝星状细胞凋亡率逐步增高，同时内质网应激途径蛋白caspase-12高表达，这提示CaMKⅡ不仅可以通过促进肝星状细胞增殖，还可以通过介导内质网应激诱导肝星状细胞凋亡参与肝纤维化调控。与此同时，在体外肝星状细胞诱导中，增加细胞内Ca2+ 浓度后，肝星状细胞出现不同程度凋亡，且内质网应激途径标志蛋白葡萄糖调节蛋白-78和caspase-12表达明显上调[26]，这提示Ca2+ 可能通过增加内质网应激诱导肝星状细胞凋亡。由此可见，Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路通过在TGF-β1/MAPK活化肝星状细胞过程中发挥作用而参与肝纤维化调控。
2.2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在PDGF调控肝纤维化中的作用
PDGF被认为是最有效的促有丝分裂原之一，是肝纤维化最有效的增殖因子，它激活细胞内信号，Ca2+ 信号参与了PDGF通路，而Ca2+/CaMKⅡ对人类肝星状细胞的增殖至关重要。外源性PDGF可以激活MAPK信号通路，该信号通路的3个核心成员ERK1/2、JNK和p38均参与了对肝星状细胞活化、增殖、凋亡的调控而参与肝纤维化的形成[50-52]。有研究[53]显示，在PDGF诱导肝星状细胞活化模型中，酸敏感离子通道1α被激活并迁移到细胞膜上，导致细胞外Ca2+ 内流使细胞内Ca2+ 增加，它又可以诱发内质网应激，从而促进肝纤维化进展，并且该过程是PDGF由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路激活酸敏感离子通道1α介导，进一步论证，抑制内质网应激后，磷酸化Akt、酸敏感离子通道1α、α-SMA和纤维化标志物Ⅰ型胶原的表达均被降低。在An等[54]的研究中发现，CaMKⅡ对PDGF诱导的肝星状细胞增殖起正向作用，干扰、抑制CaMKⅡα表达后肝星状细胞的增殖被显著抑制，细胞周期抑制调节因子p53和p21表达增加，ERK磷酸化减弱，而对JNK磷酸化无影响，认为CaMKⅡ可通过ERK对PDGF诱导的肝星状细胞增殖起正向调控作用。在另外研究[55]中，用CaMKⅡ特异性抑制剂KN93下调CaMKⅡ后，体内肝组织和体外培养肝星状细胞中CaM、CaMKⅡ以及纤维化标志物Ⅰ型胶原、α-SMA和酸敏感离子通道1α的表达均降低，而过表达CaMKⅡ后可促进肝星状细胞T6细胞的增殖，而沉默CaMKⅡ后则出现相反结果，提示了CaMKⅡ可能对肝星状细胞增殖起促进作用。总之，在PDGF诱导肝星状细胞增殖过程中，Ca2+介导了内质网应激的细胞凋亡，CaMKⅡ则可能是通过ERK1/2参与PDGF信号转导过程而对肝星状细胞增殖起正向调控作用，CaMKⅡ有可能成为肝纤维化的治疗靶点。
3 总结与展望
肝星状细胞的激活与增殖在肝纤维化过程中扮演着核心角色，它受多种因素和信号通路的共同影响，如Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路通过协同TGF-β1和PDGF相关途径，对肝星状细胞的增殖和凋亡调节起到关键作用，Ca2+ 促进肝星状细胞凋亡；CaMKⅡ对肝星状细胞双向调控，既能促进肝星状细胞增殖，又能诱导其凋亡，它是通过ERK通路促进肝星状细胞增殖，而它对凋亡的促进作用则通过影响细胞内Ca2+ 的稳态实现。无论是通过TGF-β1还是PDGF途径，肝星状细胞的增殖促进作用均可通过CaMKⅡ/ERK通路实现，而且在此过程中，Ca2+ 均可通过介导内质网应激增加肝星状细胞的凋亡，在通过PDGF途径调控过程中Ca2+ 诱导肝星状细胞凋亡可能是通过PI3K/Akt通路发挥作用，然而通过TGF-β1途径调控过程中Ca2+ 诱导凋亡的具体途径还需进一步研究。鉴于终末期肝纤维化或肝硬化给患者及其家庭带来的严重负担，且目前对Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化进程中作用研究较少，相关认识仍存在不足，未来研究应聚焦于该信号通路在肝纤维化中的作用机制研究，特别是其上游基因或下游靶标蛋白，这将有助于制定出针对性强、效果显著的治疗策略，以期实现肝纤维化甚至肝硬化的逆转，从而为患者提供更有效的治疗选择。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：刘双飞负责文章撰写及文献检索；冉江华负责文章评审及写作指导；张熙冰对论文选题及修改给予指导；焦凌峰参与文献检索和资料收集。
肝纤维化是肝损伤后的创伤愈合发生的再生过程，在此过程中损伤因子持续存在，它可导致肝脏基质组织过量沉积和肝功能受损，至终末期时肝纤维化会发展为肝硬化。每年因肝硬化导致的肝功能失代偿和肝细胞癌中约有200万人死亡，占全球所有死亡人数的3.5%以上[1]。因此，对肝纤维化进行了解和干预意义重大。目前普遍认同肝纤维化是一个动态且可逆的过程[2]。鉴于此，避免肝纤维化进展为肝硬化，通过阻断或逆转肝纤维化的进程已成为治疗肝脏疾病（简称“肝病” ）纤维化的核心内容。目前临床上尽管已采用病因治疗、肝细胞保护、抗氧化治疗等对症处理对肝纤维化进行干预，但仍未发现特异有效的抗肝纤维化的方法，因此对其机制及相关通路进行进一步深入了解仍有必要。现有相关研究发现，钙离子（ionized free calcium，Ca2+）可通过钙调蛋白（calmodulin，CaM）依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaM dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）参与肝纤维化，它在肝纤维化中扮演重要角色[3]。现对Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化中的作用研究的成果进行归纳总结，旨在为通过对该信号通路的干预防治临床肝纤维化提供新思路。
1 肝纤维化及其机制
肝纤维化是脂肪性、病毒性、酒精性或非酒精性脂肪性等慢性肝病进展过程中的共同阶段，是肝硬化发展的阶段性病理表现，其病理特征为肝小叶中央区和汇管区有不同程度的纤维组织增生或纤维间隔形成，它主要涉及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的产生及降解失衡[4]以及促炎和抗炎失衡。最常见的纤维化肝病是非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝病，其中非酒精性脂肪性肝病常发展为非酒精性脂肪性肝炎[5]，在此过程中的主要病理学改变是肝小叶炎症和肝细胞气球样变，脂毒性、氧化还原失衡、内质网应激、炎症激活和细胞凋亡参与了此过程[6]；在病毒性肝病发展为病毒性肝炎过程中，非实质细胞在干扰素基因刺激因子作用下产生干扰素和促炎因子，从而启动免疫反应抑制病毒复制，同时导致结缔组织增生而造成肝细胞结构功能紊乱[7]，当受到病毒等病理因子刺激时肝脏发生免疫细胞聚集和炎症激活，以启动纤维化过程修复损伤，炎症进一步激活肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，从而分泌α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和肝细胞生长因子，加速肝纤维化形成[8-9]。当损伤为短期存在或自限性时，这一反应过程可被逆转，肝脏结构可恢复正常；但是像酒精性、脂质性等慢性损伤因子持续存在或反复时，肝脏发生促炎与抗炎失衡和ECM产生及降解失衡。ECM稳态失衡会导致肝实质内纤维瘢痕增多、正常肝小叶结构被破坏，从而发生纤维化；而炎症失衡则通过损伤肝功能而影响纤维化分期。
1.1 ECM产生及降解失衡
ECM稳态失衡是纤维化发生及发展中的重要状态。成纤维细胞是ECM合成分泌的主要来源，其中肌成纤维细胞是一种假定的成纤维细胞亚型，它是纤维化反应的关键效应细胞，而大部分肌成纤维细胞由肝星状细胞分化形成，肝星状细胞在肝纤维化的发生及发展中起重要作用[10]。肝星状细胞作为一种非实质细胞，在肝纤维化病理生理过程中能分泌ECM并参与胶原形成、合成基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs），促进ECM产生和降解稳态失衡；此外，它还能调节肝窦内微循环推进纤维化进程。在静息状态下，肝星状细胞位于Disse间隙，主要分泌Ⅳ型胶原纤维，当病毒、乙醇、脂质等各种病理因子持续刺激，导致巨噬细胞激活释放细胞因子，在血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等细胞因子诱导下肝星状细胞被激活分化，同时发生迁移并移至损伤部位，增殖并转化为成纤维细胞，合成大量ECM和Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的胶原纤维，并且上调TIMPs表达导致ECM的降解减少[1, 11]，从而造成ECM的产生及降解失衡；同时肌成纤维细胞内含有肌丝使得它兼有收缩功能，在肝损伤修复后期，这种收缩作用和ECM的过量产生共同作用破坏肝小叶结构，导致假小叶形成，从而引起肝脏发生纤维化。
1.2 促炎和抗炎失衡
炎症是各种急慢性肝病进展的重要因素，炎症应答最初是为了阻断细菌、病毒等刺激，保护肝脏免受进一步损害，在这种应答过程中Kupffer细胞、肥大细胞等炎症应答细胞激活产生了一系列细胞因子，这类细胞因子在诱导免疫细胞聚集清除损伤因素的同时也对肝星状细胞产生造成一系列反应，从而加速或延缓肝纤维化的发生。Kupffer细胞是一种肝脏中特殊类型巨噬细胞，它在肝损伤时应答激活参与炎症调控，其他类型巨噬细胞如M1和M2型巨噬细胞，M1型细胞在干扰素γ、脂多糖激活下分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等促进炎症发生损伤肝细胞；而M2型细胞在IL-4、IL-13作用下分泌IL-10发挥抗炎作用，但同时它也分泌TGF-β1、PDGF等细胞因子诱导肝星状细胞活化促进肝纤维化进程[12]。TGF-β1和TNF-α作为多功能细胞因子，是肝纤维化刺激肝星状细胞从静止细胞活化为肌成纤维细胞的关键调节因子，它通过上调α-SMA介导肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞和刺激Ⅰ型胶原和其他基质表达[13-14]，而TNF-α可通过激活核因子-κB、Bcl-XL和p21诱导活化肝星状细胞抗凋亡，但它又能激活caspase-8产生促细胞凋亡[12]。此外，IL-17和IL-1是纤维化过程中两个较为重要的炎症因子，IL-17由另一种免疫应答细胞Th17细胞产生，它可诱导 Kupffer细胞和M1、M2型细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β1等细胞因子促进α-SMA和TGF-β1表达增加，从而作用于肝星状细胞而实现炎症反应和肝星状细胞激活之间串联[15-16]，IL-1则通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中的核心成员c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38通路上调MMP-13和TIMP表达参与纤维化进程。另一类在纤维化中发挥作用的炎性细胞是肥大细胞，它可通过抑制MMP和促进其抑制剂TIMP抑制ECM降解参与纤维化调控[17]。由此可见，炎症在肝纤维化中扮演了一个始动者作用，炎性细胞被激活后产生TNF-α、TGF-β、IL等细胞因子[18]，这些细胞因子在诱导肝星状细胞活化的同时，还激活肝细胞保护、程序性死亡等信号传导途径调节肝脏损伤后自我修复，当这种修复作用超出其自身调节能力则引起炎症失衡，进一步加重损伤并促进纤维化发展。
2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及它在肝纤维化过程中的作用
2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路概述
Ca2+ 是细胞内不可或缺的第二信使，参与控制多种功能。内质网内Ca2+ 浓度变化参与蛋白质合成及无机物代谢，线粒体内Ca2+ 浓度调节参与三磷酸腺苷合成、三羧酸循环[19]、细胞凋亡[20]等。Ca2+ 浓度平衡是胞内“钙库”摄取和释放钙、跨细胞膜钙离子转运共同作用的结果。肝细胞内Ca2+ 浓度变化参与胆汁酸分泌、物质能量代谢、蛋白质合成和分泌、细胞周期调控、细胞增殖和程序性死亡、溶酶体、其他囊泡运动等几乎所有肝细胞生理和病理过程[21-23]。
CaM是真核细胞内主要的Ca2+ 传感器，是哺乳动物中Ca2+ 信号的主要转导蛋白[24]，它在胞内无酶活性，通过作为Ca2+ 的转运体和结合激活CaMKⅡ而发挥作用。细胞内Ca2+ 浓度的升高既能促进细胞增殖[25]，也能诱导细胞凋亡[26]，因此，CaM作为细胞内Ca2+ 的转运体对细胞凋亡能发挥正向或负向的调节作用。CaM可能通过多种不同的机制调节细胞增殖，如CaM易位到细胞核并驱动血管平滑肌细胞的表型转换[27]，CaM可通过与caspase相互作用而诱导肝星状细胞凋亡[28]，CaM还能直接结合转录因子（CaM结合转录激活因子）参与多种组织中细胞的生长、分化调节[29]。
CaMK是Ca2+-CaM复合物调控的下游靶酶之一。CaMK是一个对多种细胞刺激产生反应的蛋白家族。多功能CaMK的成员包括CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ[29-30]，其中CaMKⅡ包含 α、β、γ、δ 4种亚基和17种同工酶，它在哺乳动物全身各组织中均有广泛表达，但在不同的组织中其表达量及亚基构成不一样，如γ亚基在肝脏组织中的比例较高[31]。CaMKⅡ具有自激活功能，由钙调素直接激活[32-33]。相关研究显示，CaMKⅡ是细胞中Ca2+/CaM信号通路的下游效应蛋白，而CaMKⅡγ是细胞凋亡和自噬的上游调节因子，与Ca2+/CaM/CaMKⅡ结合可缓解CaMKⅡ家族酶的羧化结构域的自抑制作用，CaMKⅡ多聚、导致自磷酸化和相互磷酸化，从而延长激酶活性，触发广泛的信号传导作用参与细胞凋亡[34-36]。大鼠肝移植缺血再灌注模型中，CaMKⅡγ与肝细胞肝酶异常、线粒体功能障碍和凋亡呈高度正相关[37]，这也证实了CaMKⅡγ可介导肝细胞发生凋亡和功能障碍。CaMKⅡ被广泛证实参与器官纤维化。在肾脏中，CaMKⅡ可通过诱导细胞外调节激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）激活参与急性和慢性肾纤维化，抑制其表达后肾脏纤维化标志物蛋白、Ⅰ型胶原、MMP2和α-SMA的表达均被显著抑制，肾脏纤维化明显缓解[38]。同样，在心脏纤维化研究中，抑制CaMKⅡ激活可延缓心肌不良重构并表现抗心律失常作用[39-40]。在肝纤维化中，CaMKⅡγ同样被证实参与肝纤维化调控，且鉴于其上游Ca2+ 对肝脏的双重调控作用，CaMKⅡγ对肝纤维化同样表现为正、负向双重调控。
2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化中的作用
肝纤维化是一个涉及多因素、多环节作用的、复杂的动态过程，肝星状细胞的激活是肝纤维化发生、发展过程中的共同中心事件和关键步骤[41]，激活的肝星状细胞通过增殖分泌大量ECM促进肝纤维化和通过细胞收缩而使肝窦内压升高导致肝硬化与门静脉高压[42]。现阶段关于肝纤维化发生机制的研究主要集中在TGF-β1信号转导通路、PDGF信号转导通路、Hippo信号通路、活性氧作用于肝星状细胞的激活等方面[43]，而Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路主要通过TGF-β1和PDGF相关通路参与肝纤维化调控，对其纤维化调控主要表现在促进或抑制肝星状细胞增殖和促进肝星状细胞凋亡。
2.2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在TGF-β1调控肝纤维化中的作用
TGF-β1是当前最强促纤维化因子之一，TGF-β1/Smad信号转导在纤维化中的作用已得到充分证实[44]。Smad蛋白家族是TGF-β1信号通路中下游的重要效应因子，其中Smad3和Smad4是促纤维化的，而Smad2和Smad7则负向调控肝纤维化。TGF-β1激活TGF-β受体Ⅰ型激酶，导致Smad2、Smad3磷酸化与Smad4复合物结合转导信号至细胞核发挥生物学效应[45]。Smad3过度表达能够抑制成纤维细胞中MMP-1活性而抑制ECM降解，Smad2和Smad7通过抑制Smad3信号对肝纤维化发挥负向作用[46-47]。此外，TGF-β1也能促进p65的磷酸化、甲硫氨酸腺苷转移酶2A的转录表达和随之而来的S-腺苷甲硫氨酸浓度降低来刺激肝星状细胞活化。TGF-β1可通过多种细胞内信号转导途径如MAPK通路等参与肝星状细胞的活化与增殖。ERK是MAPK家族一员，在TGF-β1诱导肝星状细胞增殖实验[48]中发现，ERK发生磷酸化呈现高表达状态，然而在抑制CaMKⅡ表达后，这种磷酸化被减弱，提示CaMKⅡ/ERK信号通路是TGF-β1诱导肝星状细胞增殖的重要调控信号通路。另一研究[49]结果显示，TGF-β1可以诱导肝星状细胞活化增殖，分别用低、中、高浓度CaMKⅡ抑制剂处理后，TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖呈逐步下降趋势且肝星状细胞凋亡率逐步增高，同时内质网应激途径蛋白caspase-12高表达，这提示CaMKⅡ不仅可以通过促进肝星状细胞增殖，还可以通过介导内质网应激诱导肝星状细胞凋亡参与肝纤维化调控。与此同时，在体外肝星状细胞诱导中，增加细胞内Ca2+ 浓度后，肝星状细胞出现不同程度凋亡，且内质网应激途径标志蛋白葡萄糖调节蛋白-78和caspase-12表达明显上调[26]，这提示Ca2+ 可能通过增加内质网应激诱导肝星状细胞凋亡。由此可见，Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路通过在TGF-β1/MAPK活化肝星状细胞过程中发挥作用而参与肝纤维化调控。
2.2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在PDGF调控肝纤维化中的作用
PDGF被认为是最有效的促有丝分裂原之一，是肝纤维化最有效的增殖因子，它激活细胞内信号，Ca2+ 信号参与了PDGF通路，而Ca2+/CaMKⅡ对人类肝星状细胞的增殖至关重要。外源性PDGF可以激活MAPK信号通路，该信号通路的3个核心成员ERK1/2、JNK和p38均参与了对肝星状细胞活化、增殖、凋亡的调控而参与肝纤维化的形成[50-52]。有研究[53]显示，在PDGF诱导肝星状细胞活化模型中，酸敏感离子通道1α被激活并迁移到细胞膜上，导致细胞外Ca2+ 内流使细胞内Ca2+ 增加，它又可以诱发内质网应激，从而促进肝纤维化进展，并且该过程是PDGF由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路激活酸敏感离子通道1α介导，进一步论证，抑制内质网应激后，磷酸化Akt、酸敏感离子通道1α、α-SMA和纤维化标志物Ⅰ型胶原的表达均被降低。在An等[54]的研究中发现，CaMKⅡ对PDGF诱导的肝星状细胞增殖起正向作用，干扰、抑制CaMKⅡα表达后肝星状细胞的增殖被显著抑制，细胞周期抑制调节因子p53和p21表达增加，ERK磷酸化减弱，而对JNK磷酸化无影响，认为CaMKⅡ可通过ERK对PDGF诱导的肝星状细胞增殖起正向调控作用。在另外研究[55]中，用CaMKⅡ特异性抑制剂KN93下调CaMKⅡ后，体内肝组织和体外培养肝星状细胞中CaM、CaMKⅡ以及纤维化标志物Ⅰ型胶原、α-SMA和酸敏感离子通道1α的表达均降低，而过表达CaMKⅡ后可促进肝星状细胞T6细胞的增殖，而沉默CaMKⅡ后则出现相反结果，提示了CaMKⅡ可能对肝星状细胞增殖起促进作用。总之，在PDGF诱导肝星状细胞增殖过程中，Ca2+介导了内质网应激的细胞凋亡，CaMKⅡ则可能是通过ERK1/2参与PDGF信号转导过程而对肝星状细胞增殖起正向调控作用，CaMKⅡ有可能成为肝纤维化的治疗靶点。
3 总结与展望
肝星状细胞的激活与增殖在肝纤维化过程中扮演着核心角色，它受多种因素和信号通路的共同影响，如Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路通过协同TGF-β1和PDGF相关途径，对肝星状细胞的增殖和凋亡调节起到关键作用，Ca2+ 促进肝星状细胞凋亡；CaMKⅡ对肝星状细胞双向调控，既能促进肝星状细胞增殖，又能诱导其凋亡，它是通过ERK通路促进肝星状细胞增殖，而它对凋亡的促进作用则通过影响细胞内Ca2+ 的稳态实现。无论是通过TGF-β1还是PDGF途径，肝星状细胞的增殖促进作用均可通过CaMKⅡ/ERK通路实现，而且在此过程中，Ca2+ 均可通过介导内质网应激增加肝星状细胞的凋亡，在通过PDGF途径调控过程中Ca2+ 诱导肝星状细胞凋亡可能是通过PI3K/Akt通路发挥作用，然而通过TGF-β1途径调控过程中Ca2+ 诱导凋亡的具体途径还需进一步研究。鉴于终末期肝纤维化或肝硬化给患者及其家庭带来的严重负担，且目前对Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在肝纤维化进程中作用研究较少，相关认识仍存在不足，未来研究应聚焦于该信号通路在肝纤维化中的作用机制研究，特别是其上游基因或下游靶标蛋白，这将有助于制定出针对性强、效果显著的治疗策略，以期实现肝纤维化甚至肝硬化的逆转，从而为患者提供更有效的治疗选择。
重要声明
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