棘球蚴病（又称“包虫病”）是由棘球绦虫感染所致的人兽共患病，主要分囊型和泡型。治疗以手术切除为主、药物为辅，手术难度高，药物副作用显著。切断传染源和改善卫生条件为主要防控手段。但棘球蚴病流行地区自然和社会环境复杂，其防控仍面临严峻挑战。疫苗是控制感染性疾病最经济和有效的手段。目前兽用囊型棘球蚴病疫苗（重组Eg95蛋白）在家畜中取得了较好的减囊效果，不仅减少了畜牧业经济损失和传染源，也为人用棘球蚴病疫苗的研发奠定了理论基础。优化兽用棘球蚴病疫苗和开发人用棘球蚴病疫苗，将推进棘球蚴病的防控与消除进程，提高人类健康水平。已报道的棘球蚴病候选疫苗类型包括虫体源蛋白、重组蛋白、核酸、合成表位和载体疫苗，通过诱导细胞因子、效应细胞和保护性抗体发挥免疫防御功能。为加快兽用棘球蚴病疫苗的优化和促进人用棘球蚴病疫苗的研发，现对目前国内外关于棘球蚴病疫苗的最新研究进展进行归纳总结及分析，以探讨棘球蚴病疫苗研发过程中面临的挑战及解决方案，为棘球蚴病的疫苗研发提供理论支持和实践指导。
引用本文： 顾焓霏, 牟军, 刘杰. 棘球蚴病的疫苗研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(10): 1170-1180. doi: 10.7507/1007-9424.202408103 复制
棘球蚴病（又称“包虫病”）是一种由棘球绦虫感染引起的人畜共患寄生虫病，主要分为囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）两种类型[1]。人因误食细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）或多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis，Em）虫卵而分别感染这两种疾病 [1]。误摄入虫卵内的六钩蚴在消化道内被孵化和激活，穿透肠黏膜屏障，通过血液（主要）和淋巴循环到达和定植于组织或器官[2]，其中70%定植于肝脏 [3-4]。人感染棘球绦虫后，CE在寄生器官内早期主要表现为肉芽肿，随着肉芽肿的生长，外层纤维囊壁不断纤维化增生，最终形成纤维结缔组织包被的囊肿；AE囊肿在寄生器官内浸润式生长，不断增殖产生新囊泡并深入组织，还可以通过淋巴管道和血管转移到远端组织，类似肿瘤的浸润和扩散[5]。棘球蚴囊肿破裂可引起过敏反应，甚至休克，因囊肿破裂后外漏的原头蚴随囊液流入破裂口周围而形成继发性棘球蚴囊肿 [6]。
全球估计有超过100万人受到棘球蚴病的影响，而仅CE相关的治疗费用及畜牧业损失每年高达30亿美元 [7]。在阿根廷、秘鲁、东非、中亚、中国等地区或国家，CE患病率高达5%～10% [8]。在中国2012–2016年棘球蚴病流行病学调查中，全国共有368个棘球蚴病流行县，人群患病率为0.28%，患病达166 098例 [9]。其中石渠县是流行较为严重的地区之一，2017年AE患病率高达8.72% [10]。切断传染源和改善卫生条件是当前全球公认的主要防控手段。但由于流行地区自然和社会环境复杂，棘球蚴病的防控仍面临严峻挑战。目前兽用CE疫苗（重组Eg95蛋白）在家畜中取得了较好的减囊效果，在一定程度上减缓了棘球蚴病的传播和流行，也为人用棘球蚴病疫苗的研发奠定了理论基础。为了加快兽用棘球蚴病疫苗的优化和促进人用棘球蚴病疫苗的研发，现对目前国内外棘球蚴病疫苗的最新研究进展进行归纳总结，探讨棘球蚴病疫苗研发过程中面临的挑战与解决方案，为棘球蚴病的疫苗研发提供理论支持和实践指导。
1 棘球蚴病疫苗开发的背景
近年来，棘球蚴病的诊疗水平有了逐步提高，治疗方式包括手术切除、药物联合治疗（苯并咪唑类化合物）和对症治疗 [11]。根据国内外学者共识，为最大限度地根治疾病、延长患者寿命及提高患者生命质量，CE以手术治疗为主，药物治疗为辅；AE的治疗包括手术、介入及药物联合治疗 [5]。然而治疗后的复发率较高，其中CE的复发率约为6.5% [7]，AE的复发率为2%～5% [12]。若未治疗、治疗不及时或治疗不当，CE患者10～15年病死率高达90% [13]。由于手术切除的复杂性和药物治疗的长期性，棘球蚴病的治疗费用昂贵，在治疗和管理方面均面临巨大挑战 [8]。因此，预防及早期诊断对于棘球蚴病的治疗、减轻病情和减少并发症具有重要意义。
棘球蚴病的临床诊断主要依据患者的流行病学史、临床表现、影像学检查及实验室检查包括病原学检查的综合应用。其中，影像学检查是棘球蚴病诊断的重要手段 [13]。但由于棘球蚴囊肿在人体内生长缓慢，早期较为隐匿，随病灶长大才显现出器官和邻近组织挤压相关的临床症状，患者就医晚或在体检中偶然发现 [11, 14]。以免疫学为基础的棘球蚴病快速诊断试剂盒不仅广泛应用于流行病学筛查，也作为确认影像检查结果的手段用于棘球蚴病的诊断和鉴别诊断，但当前血清学检测的灵敏性和特异性尚待提高。中国食品药品监督管理总局批准上市和使用的3种临床辅助诊断抗体检测试剂（新疆贝斯明、上海新吉而和珠海海泰）的灵敏度为90.8%～94.3%、特异性为75.7%～83.3% [15]。经手术确认的CE患者的血清学检测的灵敏度和特异性均约为60%～90% [13]。AE的血清学诊断可靠性较高，以Em2为抗原的ELISA检测灵敏度和特异性均可达90% [14]；此外，与其他寄生虫的交叉反应性限制了免疫学检测方法的准确度 [16-17]。因此，棘球蚴病免疫学诊断在特异性、敏感性和交叉反应性方面还面临挑战，诊断结果有待综合考虑和评估。
棘球绦虫的生活史复杂，涉及众多野生动物和家畜，加上早期诊断、药物治疗和外科手术在技术上的挑战，预防棘球蚴感染成为棘球蚴病防控的重要措施之一。自1995年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）成立棘球蚴病非正式工作小组以来，各个国家和地区一直在积极探讨预防和控制的措施 [7]。WHO还将棘球蚴病列为被忽视的热带病并设立了该疾病的消除目标 [18-20]。目前主要以“切断传播链和控制传染源”为核心，实施家犬驱虫、屠宰管制、家畜免疫预防等措施 [21]，这些防控措施虽然在一定程度上减少了棘球蚴病的传播和流行，但耗费大量人力、物力和财力，且效果有限 [22]。多房棘球绦虫除“野生动物—家畜”传播链外，还存在“野生动物―野生动物”野外传播链，仅在野外就可完成完整的生活史。散布于野外的虫卵对低温、干燥、化学药物的抵抗力强，在2 ℃的水中可以存活2年半以上，不仅能够被人偶然接触和误食，还会导致棘球绦虫在野生动物之间持续循环和传播，长时间威胁动物和人的健康 [2]。因此，距离实现彻底消除棘球蚴病这一目标还有一定距离，还需更加有力的干预措施 [19, 23]。
疫苗接种在预防和控制疾病传播、保护易感人群、控制疫情、消灭和根除疾病方面发挥了重要作用，是最为安全、经济和高效的传染病防控手段[24]。棘球蚴病疫苗研发是彻底消除棘球蚴病的重点攻关课题。自2016年我国实施家畜接种重组Eg95蛋白疫苗预防CE以来，人类棘球蚴病年新增病例显著下降 [22]。兽用棘球蚴病疫苗在减轻人棘球蚴病负担和减少畜牧业经济损失中发挥了作用，为开发人用棘球蚴病疫苗和彻底消除棘球蚴病带来启示和希望，也在实践中证明了预防接种能够在机体建立长期和稳定的免疫屏障、减少棘球蚴感染和控制病情。过去的研究数据 [22, 25]表明，兽用重组Eg95蛋白疫苗虽能显著减少棘球蚴囊肿数量和减轻棘球蚴囊肿重量，但并不能完全阻止棘球蚴病的感染和传播。进一步提高兽用疫苗保护效率，开发人用棘球蚴病疫苗才能为彻底消除棘球蚴病提供有效的手段 [26]。
近年来，有大量的棘球蚴病候选疫苗被开发和报道。根据疫苗的发展阶段和组成，主要分为以下几类：早期棘球蚴病疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗和载体疫苗。随着疫苗研发的逐步推进，棘球蚴病疫苗在诱导免疫反应的能力方面得到了显著的改善和提升，并在动物实验中显现了更强的免疫保护效果。这些研究为人用疫苗的开发提供了重要的科学依据，展现出在未来消除棘球蚴病中的应用潜力。
2 棘球蚴病疫苗研究进展
2.1 早期的棘球蚴病疫苗研究
2.1.1 BCG（Bacillus Calmette-Guérin）疫苗
早在1978年，Reuben等 [27]探讨BCG疫苗接种对棉鼠抵抗多房棘球绦虫攻击的影响，是有记录以来最早的棘球蚴病疫苗探索。BCG疫苗是一种减毒牛型结核分枝杆菌活菌疫苗，用于结核病的免疫预防[28]。该疫苗能够同时诱导天然免疫反应和结核特异性的过继免疫反应，对其他细菌、病毒、寄生虫等非同源病原体感染也具有非特异性的保护作用[29]。Reuben等 [27]发现BCG疫苗在保护多房棘球蚴绦虫感染中展现了一定的保护潜力，提示免疫预防也是阻断棘球绦虫感染的一种途径。从此，更多的棘球蚴病疫苗研究被逐渐开展。
2.1.2 虫体源蛋白疫苗
21世纪以来，研究者从虫体组织提取蛋白以筛选保护性抗原。虫体源蛋白疫苗是直接从棘球蚴囊液、六钩蚴和原头蚴虫体中提取和纯化蛋白制成的疫苗，是早期棘球蚴病疫苗的主要研究对象 [30]（表1）。研究[31-38]结果表明，这些虫体源蛋白疫苗能够诱导宿主产生针对棘球绦虫抗原的特异性免疫反应，达到预防感染的目的。虫体源蛋白疫苗通常由多种已知和未知蛋白组成，成分复杂。当前来源于多房棘球绦虫的Em2 [39]（棘球蚴囊肿角质层蛋白）、E/S（原头蚴蛋白） [31]、SRF1（原头蚴糖蛋白） [32]的成分较为明确，组成相对单一。虫体源蛋白在鼠或犬等动物模型中应用具有较好的免疫原性，诱导一定的免疫保护效果。如在接受棘球绦虫攻击的AE实验中，接种SRF1的犬体内虫量较未接种SRF1的犬减少87.60% [32]，小鼠接种E/S抗原后获得91.70%的保护效率 [31]。但虫体源蛋白疫苗在实际应用中仍面临诸多挑战。一方面，虫体源蛋白疫苗组成成分复杂，有效成分不明确，毒副作用风险高，同时其稳定性难以保证；另一方面，生产和纯化虫体源蛋白疫苗过程中的技术复杂且成本高昂，需要大量的设备和专业技术人员；此外，依赖虫体样本作为原材料的生产方式面临供给不稳定的难题，如野外采集虫体样本既耗时费力，又存在生物安全隐患。因此，质量控制以及审批和监管方面的挑战限制了虫体源蛋白疫苗进一步的发展和应用，早期的BCG疫苗和虫体源蛋白疫苗并非理想的候选疫苗。
表1
虫体源蛋白疫苗的相关研究
2.2 重组蛋白疫苗
2.2.1 重组Eg95蛋白疫苗
2.2.1.1 重组Eg95蛋白疫苗的发现与应用
随着基因工程和重组蛋白表达技术的发展，重组棘球绦虫蛋白在动物实验中显示出了一定的免疫原性和保护效果。研究者们尝试从多种棘球绦虫抗原中筛选出具有更强免疫原性和更高保护效率的抗原。其中重组Eg95蛋白就是一种高效的保护性抗原，在动物临床实验中显现出有效的保护效果，并被成功商业化应用（表2）[25, 40-45]。1996年，Lightowlers等[25]从细粒棘球绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选出Eg95基因，其编码的Eg95蛋白具有良好的免疫原性，对细粒棘球绦虫虫卵攻击免疫绵羊具有96%的减囊效率。由于重组Eg95蛋白疫苗优良的安全性和有效性，重组Eg95蛋白疫苗在全球范围内进行了动物临床实验[26]，如澳大利亚的试验结果[46-47]显示，绵羊皮下接种与GST标记蛋白融合表达的重组GST-Eg95蛋白后，对虫卵感染的减囊效率高达96%～100%，棘球蚴囊肿抑制率高达99.3%；我国张壮志等 [48]于2008年开展了重组Eg95蛋白疫苗对新生绵羊作用研究的实验结果表明，在2次免疫接种后，人工感染的保护率达到82.2%以上。随后重组Eg95蛋白疫苗在全球多地被推广和应用，也为开发人用棘球蚴病疫苗带来启示。通过比较Eg95蛋白不同区域在诱导羊产生保护性免疫应答的能力差异，Lightowlers等团队发现重组Eg95蛋白疫苗诱导宿主免疫应答和保护性的抗原表位具有构象性 [49]。对兽用棘球蚴病疫苗免疫保护机制的深入探究，揭示它产生免疫保护的关键分子和机制，为指导重组Eg95蛋白疫苗的设计和优化以提升免疫保护效率提供了重要参考和依据。
表2
针对CE的重组Eg95蛋白疫苗在不同受试动物中的应用
2.2.1.2 重组Eg95蛋白疫苗的优化方向
由于重组Eg95蛋白疫苗在前期研究和应用中展现出的减囊效果，重组Eg95蛋白疫苗的改进和优化是当前备受关注的研究方向之一。现有上市重组Eg95蛋白疫苗是由大肠杆菌表达系统生产的GST-Eg95融合重组蛋白。GST-Eg95表达产物是不可溶的包涵体，需要经过繁琐的复性步骤才能重建Eg95蛋白构象，这样的表达和复性过程增加了重组蛋白制备工艺的难度和成本，制约了疫苗的产能。张艺琳[50]利用结构生物学和生物信息学技术分析了Eg95 DNA和蛋白氨基酸序列，通过截除N端信号肽和C端跨膜结构域的编码序列，构建优化的可溶性Eg95（Eg95s）表达系统，使Eg95 蛋白的主要抗原表位在大肠杆菌表达系统中实现可溶性表达。经皮下接种Eg95s蛋白1周后，小鼠血清中即可检测到大量的特异性抗体，与重组Eg95蛋白疫苗比较，Eg95s能够诱导更高水平的抗体且能够维持更长时间。Jazouli等 [51]也对Eg95蛋白的表达系统进行优化，构建了可溶性Eg95NC表达系统，并取得了更高的纯化效率。Eg95NC [25, 40]在绵羊免疫保护实验中展现出高达100%保护效率，具有巨大的应用潜力，有望在进一步的动物临床试验中取得良好的评估效果。重组蛋白疫苗具有安全性高、易于生产、稳定性好等优点，受到广泛关注。
2.2.2 其他重组蛋白疫苗
除Eg95重组蛋白疫苗外，还有大量棘球绦虫蛋白分子被报道作为棘球蚴病疫苗的候选抗原，它们在动物实验中的减囊效率或减虫效率达到了5.10%～100%（表3）[23, 35, 52-76]。其中，细粒棘球绦虫抗原EgVac [52]在犬中实现了对细粒棘球蚴成虫发育100%的抑制；EgM123 [53]在犬中对虫卵形成的抑制率也高达99.50%。此外，EgP29[54]、Eg14-3-3 [55-56]、EgGST1 [57]等候选疫苗在小鼠和羊模型中也达到95%以上的减囊效果。多房棘球绦虫抗原如Em14-3-3 [58]、TSP1[59]和Em95 [60-61]达到了75%以上的减囊效果。
表3
重组蛋白疫苗在不同疾病的受试动物中的应用
2.2.3 多价联合重组蛋白疫苗
棘球绦虫的感染有多种蛋白质的参与和复杂的机制。寄生虫在不同发育阶段所表达的蛋白质存在质和量的差异。单个抗原的候选疫苗可能难以达到满意的保护效果。应对这一挑战，研究者们开始关注棘球绦虫感染过程中的多个关键抗原，并将这些抗原融合表达，设计出多价联用疫苗，如EgFABP-EgA31通用绦虫疫苗。EgFABP [77-78]基因能够从原头蚴cDNA中克隆，对应一类参与脂肪酸交换和运输的功能蛋白质；EgA31 [79]由细粒棘球绦虫成虫cDNA表达文库中筛选出，表达于原头蚴吸盘区域的皮层细胞。当原头蚴头节外翻时，吸盘上的EgA31 mRNA含量显著增加，具有良好的免疫原性，能诱导犬产生特异性抗体，也能被棘球蚴患者血清所识别 [80-81]。这些多价联用疫苗的设计覆盖多个靶点，能够增强疫苗的免疫保护效果。这一策略为棘球蚴病疫苗的研发提供了新的方向和可能性。
2.3 核酸疫苗
2.3.1 DNA疫苗
DNA疫苗是21世纪新兴的一种疫苗类型，在棘球蚴病疫苗的研究中备受关注。DNA疫苗的关键成分是一小段环状DNA，其中包含编码特定疫苗抗原的基因。接种入机体的DNA借助宿主细胞表达抗原表位，这些抗原表位会被呈递到宿主细胞表面，触发针对疫苗抗原的免疫应答 [82]。目前报道有Eg95 [83]、EgAgB8/2 [84]、EgP29 [85]和EgAgB [86]基因的DNA疫苗 [87-88]。与CE DNA相关研究约5项，其中仅EgP29和EgA31有保护性的评价，其减囊效率为50%～93%（表4）。尽管现有DNA疫苗的免疫原性较弱，但这类疫苗能激活CD4+和CD8+ T细胞，诱导体液和细胞免疫反应，这使得DNA疫苗在诱导免疫反应方面仍具有独特优势；它还具有高度的热稳定性，无需低温保存和冷链运输，储存和运输的成本低 [89]。因此，DNA疫苗在全球范围，尤其是在资源有限的发展中国家，具有极大的吸引力。DNA疫苗的优势为棘球蚴病疫苗的研发提供了新的方向，但针对棘球蚴病的DNA疫苗研究仍处于初级阶段 [85, 90]。DNA疫苗的有效性和安全性需要通过更多的临床试验来验证。例如，疫苗DNA片段在宿主体内的持续存在和整合到宿主基因组带来的安全性担忧。其次，DNA疫苗的设计还需要进一步优化，并开发高效的佐剂，以提高它在宿主中的表达效率和免疫原性 [89]。目前尚无针对AE的DNA疫苗研究报道，这为研究提供了广阔的探索空间。
表4
核酸DNA疫苗的应用
2.3.2 mRNA疫苗
除了DNA疫苗，近年来备受关注的mRNA疫苗也在疾病的防控中展现出了巨大的潜力。mRNA疫苗利用接种者细胞合成棘球绦虫抗原来激发机体的免疫反应，其独特的优势主要体现在以下几个方面：① mRNA疫苗制备不涉及感染性的病原体，避免了感染和致病的风险；② 通过引入转录后修饰，mRNA疫苗的有效性和稳定性高；③ 具备快速研发、扩大规模和快速生产的优势 [92-93]；④ mRNA疫苗具有良好的稳定性，如进入临床试验的mRNA狂犬疫苗CV7201可以于5～25 ℃环境下储存3年 [94-95]。因此，mRNA疫苗的安全性、快速性、稳定性、适应性等优势为棘球蚴病的防控提供了新的希望和选择。然而在棘球蚴病mRNA疫苗的研发尚处于启动中，其有效性、安全性、生产工艺、生产成本和市场价值需进一步评估和优化。
2.4 合成表位疫苗
借助于计算机模拟、数据分析，以及成熟的基因重组和高效表达的系统技术，反向设计和开发具有高免疫原性和高安全性的抗原疫苗也是当前疫苗研究的方向。
生物信息学的方法和技术被应用于抗原结构和理化参数的分析，预测T细胞和B细胞抗原表位。经过针对性地设计和改造蛋白质结构，能编码多个免疫优势表位，从而更精确地诱导持久的免疫应答，增强抗原诱导的免疫保护效果 [72]。如通过预测Eg95蛋白的T细胞和B细胞表位设计出了多表位抗原多肽，这一多表位抗原多肽与白细胞介素（interleukin，IL）-2组合，在小鼠体内诱导出与商用重组Eg95蛋白疫苗相当水平的体液免疫和更强的细胞免疫应答，表现在相当水平的Eg95特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgA、IgM抗体和较高水平的辅助T细胞1型（IL-2、IL-12p70、肿瘤坏死因子α和干扰素-γ）和辅助T细胞2型（IL-4、IL-5、IL-6和IL-13）细胞因子[83]。Yu等 [96]通过对蛋白质的理化参数、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构和T、B细胞表位的预测，利用分子对接技术优化细胞表位，构建了EgTeg和EgFABP1的多表位疫苗，这种多表位疫苗在小鼠实验中表现出良好的免疫原性，能显著减轻原头蚴腹腔注射感染小鼠的棘球蚴囊肿重量。此外，Eg14-3-3 [52]、EgP29 [97]、EgM9、Eg10196、EgA31、EgG1Y162 [98-99]等抗原也被用于预测T细胞和B细胞表位，但目前缺乏免疫原性和免疫保护效果评估的相关数据以支撑其应用的可行性。
计算机辅助设计可以开发具有高免疫原性和高安全性的疫苗，它能够为棘球蚴病防控提供新的策略和方法。但不同的软件可能使用不同的算法和数据源，导致表位预测结果的差异。因此，为了提高表位预测的准确性，使用多个软件同时进行预测并综合考虑预测结果是必要的。
2.5 载体疫苗
载体疫苗是一类利用DNA重组技术，通过细菌、真菌、病毒或纳米颗粒等载体将目标抗原基因或蛋白传递到机体免疫系统，诱导特异性免疫应答的疫苗。常见的载体有酵母、病毒、细菌、纳米颗粒等。目前已被文献报道的棘球蚴病疫苗载体包括：精氨酸纳米脂质颗粒 [83]、纳米细胞膜囊泡 [100]、牛痘病毒 [101]、沙门氏菌 [102]、BCG [103]、乳酸乳球菌 [104]、双歧杆菌 [105]、狂犬病毒 [106]等。细菌载体疫苗研究占比最多，但仅有少数研究评估了疫苗的免疫保护效率（表5） [64, 101, 103, 107-110]，其中以BCG为载体的疫苗对棘球蚴囊肿的抑制率最高（为92.46%） [103]。除了细菌载体疫苗，以纳米细胞膜囊泡为载体的T细胞和B细胞多表位疫苗（V-T/B） [100]首次展示了一种可以减轻多房棘球绦虫负担的纳米疫苗策略，该疫苗在小鼠实验中能够激活树突状细胞，并诱导特异性T/B细胞互馈回路，充分发挥细胞免疫和体液免疫在抵抗感染中的作用，最终显著抑制多房棘球蚴感染和棘球蚴囊肿生长。此外，这些载体疫苗的传递方式丰富多样，涵盖皮下接种、肌肉接种、呼吸道接种和消化道接种。经呼吸道和消化道接种为家畜和动物免疫提供了便捷的防疫方式，是这类疫苗的优势。未来载体疫苗在棘球蚴病防控中的应用前景广阔，但仍需要在安全性、稳定性、免疫原性等方面开展更多研究，需要进一步的临床试验数据支撑以促进其转化和应用。
表5
细菌载体疫苗的应用
3 疫苗研发面临的主要瓶颈和挑战
3.1 致病和抵抗机制认知不足
目前，已了解棘球绦虫入侵和感染的途径及基本过程，但对棘球绦虫感染的致病机制和机体免疫防疫机制缺乏全面和系统的认识，特别是对寄生虫入侵和感染过程中在分子层面的认识，例如，尚不清楚参与棘球绦虫感染和在宿主体内发育过程中的关键分子及其生物学功能。深入探究宿主与棘球绦虫间相互作用的具体分子机制和免疫反应，将为优化和设计疫苗提供更多的线索和靶点。可以依托合适的动物感染模型，加强对六钩蚴入侵中间宿主及它在体内生长发育过程中的分子机制和免疫应答的研究，探寻棘球绦虫感染过程中直接和协助参与入侵宿主的关键抗原和靶点，以及棘球绦虫入侵宿主的关键环节。
3.2 实验用感染性材料的限制
感染动物模型是疫苗研发中不可或缺的环节，缺乏足够的感染性材料是棘球蚴病感染机制研究和疫苗开发中的挑战之一。棘球绦虫主要分布在畜牧业发达的牧区或半牧区，例如，细粒棘球绦虫的幼虫阶段主要寄生于偶蹄类动物，而成虫则寄生于犬科动物 [111]。这种生物学限制使得在实验室条件下持续获取、长期保存和人工扩增棘球绦虫在资源获取和技术上都面临诸多困难，导致实验依赖野外人工采集虫体样本。因此，加强国内和国际的合作，共享实验材料、技术平台及研究成果，减少重复性工作，将加速疫苗候选物的筛选与评估。鉴于获取感染性材料的困难，还可以考虑开发替代感染模型，如利用细胞系或模式动物模拟棘球绦虫感染过程。
3.3 有效性评价方式和指标的差异
棘球蚴病疫苗的研发面临多方面的瓶颈和挑战。无论是虫体源蛋白疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗还是载体疫苗，都面临如何找到具有更强免疫原性和更好免疫保护效果的抗原问题。比较各种抗原的免疫保护机制和效果有助于加速筛选出最优的疫苗抗原。但由于不同研究之间的接种方式、疫苗佐剂的选择、动物模型和攻毒方式、以及保护性评价指标存在差异，难以在临床前阶段通过文献报道的结果直接比较和评价不同候选疫苗间的保护效果。
3.3.1 接种方式与疫苗的保护效果
大多数研究通过皮下注射接种疫苗，而TSP3蛋白 [78]经呼吸道和皮下注射接种小鼠诱导的减囊效率分别为62.8%和81.9%，提示同种抗原采用不同的接种方式所诱导的免疫保护效果存在差异，表明探究疫苗的投递方式可能有助于进一步提升疫苗的免疫保护效果。近年来有文献 [112]报道，口服接种疫苗不仅可以诱导系统性的免疫应答，还可以增强消化道局部黏膜免疫应答，具有多重保护优势。如口服疫苗可以提高患者的依从性，降低注射带来的风险，简化给药过程，减少对医护人员的需求，以及降低职业暴露导致的伤害等 [113]。鉴于棘球蚴病“病从口入”及六钩蚴穿透肠黏膜的感染特点，口服接种疫苗和增强局部黏膜免疫反应，从理论上是一种有效的预防棘球蚴感染的方法。
3.3.2 佐剂选择与疫苗的保护效果
佐剂也是影响疫苗保护效果的重要因素之一。Heath等 [114]使用不同佐剂组合，比较了重组Eg95蛋白疫苗的保护效果，其中包括单独使用Eg95以及与TASGEL、SAPONIN、ISA70、M888_Drakeol、DEAE_Dextran、QuilA、ISA50、STM等佐剂搭配，结果显示，Eg95单独使用时的保护有效率为34%～87%，与上述佐剂分别组合后的保护有效率分别为38%～68%、93%～100%、95%～100%、–10%～95%、64%～100%、86%～100%、63%～99%和70%～100%，结果提示，佐剂的合理选择和搭配可以提升疫苗的免疫保护效果，对进一步探讨不同佐剂组合的优化策略提供了有力的依据。
3.3.3 动物模型与疫苗效果评价
不同动物模型与攻毒方式的差异限制了不同抗原的免疫原性和保护效果的直接比较。在棘球蚴病疫苗的保护效果评价中，攻毒方式主要包括口服虫卵和腹腔注射原头蚴两种感染模型，这两种攻毒模型的存在导致不同研究中不同抗原的免疫保护效果难以直接比较。六钩蚴穿透肠壁进入机体是自然感染发生的关键环节，而腹腔注射原头蚴感染小鼠动物模型仅模拟了原头蚴在宿主腹腔内定植和发育成为囊肿的发病过程 [111]。相比之下，建立经消化道虫卵自然感染的动物模型是评价疫苗保护效率的必要工具，在模拟感染过程和评估疫苗的有效性方面具有独特的优势。Dempster等 [115]报道DBA/2J小鼠经消化道感染Eg虫卵的有效率约为83.3%；由弘等 [116]报道昆明鼠口服Eg虫卵的感染有效率为81%。近年的棘球蚴病疫苗研发中腹腔注射原头蚴感染小鼠的模型约占44%，是评估疫苗保护效率的重要工具。为了更客观地评价疫苗的免疫保护效果，在疫苗研究中有必要选择和统一最接近自然感染的攻毒方式。
3.3.4 保护性评价指标
当前的疫苗研究缺乏统一的保护性评价指标。虽然大量重组蛋白疫苗研究已取得一定进展，但保护性评价的指标各异。如棘球蚴囊肿重量减轻率、棘球蚴囊肿数量减少率、成虫降低率、虫卵降低率、保护效率等都用作保护性评价的指标，导致各研究间评估结果的差异化和可比性差，阻碍了棘球蚴病保护性抗原有效性的直接评估和比较。因此，为了确保研究结果的可靠性和可比性，迫切需要在棘球蚴病疫苗研究领域建立统一的评估指标和标准化的实验方法，以便更有效地评估和比较不同实验室间的抗原保护效果，从而推动棘球蚴病疫苗的研发和应用进程。
3.4 野生动物的免疫预防
仅依靠对家畜免疫接种的措施不能解决物种间反复传播这一问题和消除环境中分布的虫卵，因此，预防野生动物感染也是控制和彻底消除棘球蚴病不可忽略的环节。但传统的动物接种方法无法直接复制和应用于野生动物。“可传播疫苗” [117]是一种载有来自病原体基因片段的动物病毒，具有个体间传播能力，通过接触感染在野生动物种群中传播，以诱导种群免疫反应，可能是打破棘球蚴病野外传播链的理想工具。2001年，为预防兔黏液瘤病，Torres等 [118]研制表达兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白的重组黏液瘤病毒活疫苗，在小岛上为少数野兔接种疫苗后，小岛上50%未接种疫苗的野兔也产生了抗原特异性抗体。提示可传播疫苗在预防人畜共患病方面存在巨大潜力。
4 总结及未来展望
过去几十年来，中国针对人类、牲畜和家犬的棘球蚴病防控工作取得了重要进展。在教育宣传、家畜屠宰管理、犬只管理、强制免疫、疫情监控等防控策略的实施下，2022年全国新增病例数量较2004年约下降了50% [22]。然而最新的热带病报告 [19]显示，全球每年仍有31个国家报告了棘球蚴病病例，棘球蚴病仍然为全人类健康带来了巨大的威胁和造成了严重的经济负担 [119-120]，完全消除棘球蚴病尚需全人类的共同和继续努力。
疫苗作为控制传染病的最有效和最经济的手段，其研发是一项极具挑战性的任务。尽管当前已有针对细粒棘球绦虫的兽用疫苗，但该疫苗的设计有待优化，免疫保护效果有待提升。构建的很多候选疫苗尚无充分的免疫保护性评价，约23%的棘球蚴病疫苗研究仅停留在实验室阶段，多数候选疫苗有待临床试验的评价，以促进其进一步推广和应用。若能克服棘球蚴病疫苗研发过程中面临的诸多挑战，必定会加速疫苗的研发和棘球蚴病防控的进程。
总之，棘球蚴病的防控虽然面临致病和抵抗机制、疫苗研发技术、野生动物传播等诸多挑战，但通过对疾病感染和免疫防疫机制的深入研究以及创新技术的运用，有望开发出更多安全有效的棘球蚴病疫苗，以控制棘球蚴病的流行。特别是对于经济欠发达的地区，棘球蚴病防控带来的收益远不止保障当地农牧民的健康，还能帮助当地农牧民实现生计改善，完成“全国所有流行县基本控制棘球蚴病流行”和“健康中国2030”的目标和任务，真正实现在全球消灭棘球蚴病。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：顾焓霏查询文献、整理数据和撰写论文初稿；牟军查询文献与整理数据；刘杰整体规划与监管及审阅与修订论文。
棘球蚴病（又称“包虫病”）是一种由棘球绦虫感染引起的人畜共患寄生虫病，主要分为囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）两种类型[1]。人因误食细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）或多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis，Em）虫卵而分别感染这两种疾病 [1]。误摄入虫卵内的六钩蚴在消化道内被孵化和激活，穿透肠黏膜屏障，通过血液（主要）和淋巴循环到达和定植于组织或器官[2]，其中70%定植于肝脏 [3-4]。人感染棘球绦虫后，CE在寄生器官内早期主要表现为肉芽肿，随着肉芽肿的生长，外层纤维囊壁不断纤维化增生，最终形成纤维结缔组织包被的囊肿；AE囊肿在寄生器官内浸润式生长，不断增殖产生新囊泡并深入组织，还可以通过淋巴管道和血管转移到远端组织，类似肿瘤的浸润和扩散[5]。棘球蚴囊肿破裂可引起过敏反应，甚至休克，因囊肿破裂后外漏的原头蚴随囊液流入破裂口周围而形成继发性棘球蚴囊肿 [6]。
全球估计有超过100万人受到棘球蚴病的影响，而仅CE相关的治疗费用及畜牧业损失每年高达30亿美元 [7]。在阿根廷、秘鲁、东非、中亚、中国等地区或国家，CE患病率高达5%～10% [8]。在中国2012–2016年棘球蚴病流行病学调查中，全国共有368个棘球蚴病流行县，人群患病率为0.28%，患病达166 098例 [9]。其中石渠县是流行较为严重的地区之一，2017年AE患病率高达8.72% [10]。切断传染源和改善卫生条件是当前全球公认的主要防控手段。但由于流行地区自然和社会环境复杂，棘球蚴病的防控仍面临严峻挑战。目前兽用CE疫苗（重组Eg95蛋白）在家畜中取得了较好的减囊效果，在一定程度上减缓了棘球蚴病的传播和流行，也为人用棘球蚴病疫苗的研发奠定了理论基础。为了加快兽用棘球蚴病疫苗的优化和促进人用棘球蚴病疫苗的研发，现对目前国内外棘球蚴病疫苗的最新研究进展进行归纳总结，探讨棘球蚴病疫苗研发过程中面临的挑战与解决方案，为棘球蚴病的疫苗研发提供理论支持和实践指导。
1 棘球蚴病疫苗开发的背景
近年来，棘球蚴病的诊疗水平有了逐步提高，治疗方式包括手术切除、药物联合治疗（苯并咪唑类化合物）和对症治疗 [11]。根据国内外学者共识，为最大限度地根治疾病、延长患者寿命及提高患者生命质量，CE以手术治疗为主，药物治疗为辅；AE的治疗包括手术、介入及药物联合治疗 [5]。然而治疗后的复发率较高，其中CE的复发率约为6.5% [7]，AE的复发率为2%～5% [12]。若未治疗、治疗不及时或治疗不当，CE患者10～15年病死率高达90% [13]。由于手术切除的复杂性和药物治疗的长期性，棘球蚴病的治疗费用昂贵，在治疗和管理方面均面临巨大挑战 [8]。因此，预防及早期诊断对于棘球蚴病的治疗、减轻病情和减少并发症具有重要意义。
棘球蚴病的临床诊断主要依据患者的流行病学史、临床表现、影像学检查及实验室检查包括病原学检查的综合应用。其中，影像学检查是棘球蚴病诊断的重要手段 [13]。但由于棘球蚴囊肿在人体内生长缓慢，早期较为隐匿，随病灶长大才显现出器官和邻近组织挤压相关的临床症状，患者就医晚或在体检中偶然发现 [11, 14]。以免疫学为基础的棘球蚴病快速诊断试剂盒不仅广泛应用于流行病学筛查，也作为确认影像检查结果的手段用于棘球蚴病的诊断和鉴别诊断，但当前血清学检测的灵敏性和特异性尚待提高。中国食品药品监督管理总局批准上市和使用的3种临床辅助诊断抗体检测试剂（新疆贝斯明、上海新吉而和珠海海泰）的灵敏度为90.8%～94.3%、特异性为75.7%～83.3% [15]。经手术确认的CE患者的血清学检测的灵敏度和特异性均约为60%～90% [13]。AE的血清学诊断可靠性较高，以Em2为抗原的ELISA检测灵敏度和特异性均可达90% [14]；此外，与其他寄生虫的交叉反应性限制了免疫学检测方法的准确度 [16-17]。因此，棘球蚴病免疫学诊断在特异性、敏感性和交叉反应性方面还面临挑战，诊断结果有待综合考虑和评估。
棘球绦虫的生活史复杂，涉及众多野生动物和家畜，加上早期诊断、药物治疗和外科手术在技术上的挑战，预防棘球蚴感染成为棘球蚴病防控的重要措施之一。自1995年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）成立棘球蚴病非正式工作小组以来，各个国家和地区一直在积极探讨预防和控制的措施 [7]。WHO还将棘球蚴病列为被忽视的热带病并设立了该疾病的消除目标 [18-20]。目前主要以“切断传播链和控制传染源”为核心，实施家犬驱虫、屠宰管制、家畜免疫预防等措施 [21]，这些防控措施虽然在一定程度上减少了棘球蚴病的传播和流行，但耗费大量人力、物力和财力，且效果有限 [22]。多房棘球绦虫除“野生动物—家畜”传播链外，还存在“野生动物―野生动物”野外传播链，仅在野外就可完成完整的生活史。散布于野外的虫卵对低温、干燥、化学药物的抵抗力强，在2 ℃的水中可以存活2年半以上，不仅能够被人偶然接触和误食，还会导致棘球绦虫在野生动物之间持续循环和传播，长时间威胁动物和人的健康 [2]。因此，距离实现彻底消除棘球蚴病这一目标还有一定距离，还需更加有力的干预措施 [19, 23]。
疫苗接种在预防和控制疾病传播、保护易感人群、控制疫情、消灭和根除疾病方面发挥了重要作用，是最为安全、经济和高效的传染病防控手段[24]。棘球蚴病疫苗研发是彻底消除棘球蚴病的重点攻关课题。自2016年我国实施家畜接种重组Eg95蛋白疫苗预防CE以来，人类棘球蚴病年新增病例显著下降 [22]。兽用棘球蚴病疫苗在减轻人棘球蚴病负担和减少畜牧业经济损失中发挥了作用，为开发人用棘球蚴病疫苗和彻底消除棘球蚴病带来启示和希望，也在实践中证明了预防接种能够在机体建立长期和稳定的免疫屏障、减少棘球蚴感染和控制病情。过去的研究数据 [22, 25]表明，兽用重组Eg95蛋白疫苗虽能显著减少棘球蚴囊肿数量和减轻棘球蚴囊肿重量，但并不能完全阻止棘球蚴病的感染和传播。进一步提高兽用疫苗保护效率，开发人用棘球蚴病疫苗才能为彻底消除棘球蚴病提供有效的手段 [26]。
近年来，有大量的棘球蚴病候选疫苗被开发和报道。根据疫苗的发展阶段和组成，主要分为以下几类：早期棘球蚴病疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗和载体疫苗。随着疫苗研发的逐步推进，棘球蚴病疫苗在诱导免疫反应的能力方面得到了显著的改善和提升，并在动物实验中显现了更强的免疫保护效果。这些研究为人用疫苗的开发提供了重要的科学依据，展现出在未来消除棘球蚴病中的应用潜力。
2 棘球蚴病疫苗研究进展
2.1 早期的棘球蚴病疫苗研究
2.1.1 BCG（Bacillus Calmette-Guérin）疫苗
早在1978年，Reuben等 [27]探讨BCG疫苗接种对棉鼠抵抗多房棘球绦虫攻击的影响，是有记录以来最早的棘球蚴病疫苗探索。BCG疫苗是一种减毒牛型结核分枝杆菌活菌疫苗，用于结核病的免疫预防[28]。该疫苗能够同时诱导天然免疫反应和结核特异性的过继免疫反应，对其他细菌、病毒、寄生虫等非同源病原体感染也具有非特异性的保护作用[29]。Reuben等 [27]发现BCG疫苗在保护多房棘球蚴绦虫感染中展现了一定的保护潜力，提示免疫预防也是阻断棘球绦虫感染的一种途径。从此，更多的棘球蚴病疫苗研究被逐渐开展。
2.1.2 虫体源蛋白疫苗
21世纪以来，研究者从虫体组织提取蛋白以筛选保护性抗原。虫体源蛋白疫苗是直接从棘球蚴囊液、六钩蚴和原头蚴虫体中提取和纯化蛋白制成的疫苗，是早期棘球蚴病疫苗的主要研究对象 [30]（表1）。研究[31-38]结果表明，这些虫体源蛋白疫苗能够诱导宿主产生针对棘球绦虫抗原的特异性免疫反应，达到预防感染的目的。虫体源蛋白疫苗通常由多种已知和未知蛋白组成，成分复杂。当前来源于多房棘球绦虫的Em2 [39]（棘球蚴囊肿角质层蛋白）、E/S（原头蚴蛋白） [31]、SRF1（原头蚴糖蛋白） [32]的成分较为明确，组成相对单一。虫体源蛋白在鼠或犬等动物模型中应用具有较好的免疫原性，诱导一定的免疫保护效果。如在接受棘球绦虫攻击的AE实验中，接种SRF1的犬体内虫量较未接种SRF1的犬减少87.60% [32]，小鼠接种E/S抗原后获得91.70%的保护效率 [31]。但虫体源蛋白疫苗在实际应用中仍面临诸多挑战。一方面，虫体源蛋白疫苗组成成分复杂，有效成分不明确，毒副作用风险高，同时其稳定性难以保证；另一方面，生产和纯化虫体源蛋白疫苗过程中的技术复杂且成本高昂，需要大量的设备和专业技术人员；此外，依赖虫体样本作为原材料的生产方式面临供给不稳定的难题，如野外采集虫体样本既耗时费力，又存在生物安全隐患。因此，质量控制以及审批和监管方面的挑战限制了虫体源蛋白疫苗进一步的发展和应用，早期的BCG疫苗和虫体源蛋白疫苗并非理想的候选疫苗。
表1
虫体源蛋白疫苗的相关研究
2.2 重组蛋白疫苗
2.2.1 重组Eg95蛋白疫苗
2.2.1.1 重组Eg95蛋白疫苗的发现与应用
随着基因工程和重组蛋白表达技术的发展，重组棘球绦虫蛋白在动物实验中显示出了一定的免疫原性和保护效果。研究者们尝试从多种棘球绦虫抗原中筛选出具有更强免疫原性和更高保护效率的抗原。其中重组Eg95蛋白就是一种高效的保护性抗原，在动物临床实验中显现出有效的保护效果，并被成功商业化应用（表2）[25, 40-45]。1996年，Lightowlers等[25]从细粒棘球绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选出Eg95基因，其编码的Eg95蛋白具有良好的免疫原性，对细粒棘球绦虫虫卵攻击免疫绵羊具有96%的减囊效率。由于重组Eg95蛋白疫苗优良的安全性和有效性，重组Eg95蛋白疫苗在全球范围内进行了动物临床实验[26]，如澳大利亚的试验结果[46-47]显示，绵羊皮下接种与GST标记蛋白融合表达的重组GST-Eg95蛋白后，对虫卵感染的减囊效率高达96%～100%，棘球蚴囊肿抑制率高达99.3%；我国张壮志等 [48]于2008年开展了重组Eg95蛋白疫苗对新生绵羊作用研究的实验结果表明，在2次免疫接种后，人工感染的保护率达到82.2%以上。随后重组Eg95蛋白疫苗在全球多地被推广和应用，也为开发人用棘球蚴病疫苗带来启示。通过比较Eg95蛋白不同区域在诱导羊产生保护性免疫应答的能力差异，Lightowlers等团队发现重组Eg95蛋白疫苗诱导宿主免疫应答和保护性的抗原表位具有构象性 [49]。对兽用棘球蚴病疫苗免疫保护机制的深入探究，揭示它产生免疫保护的关键分子和机制，为指导重组Eg95蛋白疫苗的设计和优化以提升免疫保护效率提供了重要参考和依据。
表2
针对CE的重组Eg95蛋白疫苗在不同受试动物中的应用
2.2.1.2 重组Eg95蛋白疫苗的优化方向
由于重组Eg95蛋白疫苗在前期研究和应用中展现出的减囊效果，重组Eg95蛋白疫苗的改进和优化是当前备受关注的研究方向之一。现有上市重组Eg95蛋白疫苗是由大肠杆菌表达系统生产的GST-Eg95融合重组蛋白。GST-Eg95表达产物是不可溶的包涵体，需要经过繁琐的复性步骤才能重建Eg95蛋白构象，这样的表达和复性过程增加了重组蛋白制备工艺的难度和成本，制约了疫苗的产能。张艺琳[50]利用结构生物学和生物信息学技术分析了Eg95 DNA和蛋白氨基酸序列，通过截除N端信号肽和C端跨膜结构域的编码序列，构建优化的可溶性Eg95（Eg95s）表达系统，使Eg95 蛋白的主要抗原表位在大肠杆菌表达系统中实现可溶性表达。经皮下接种Eg95s蛋白1周后，小鼠血清中即可检测到大量的特异性抗体，与重组Eg95蛋白疫苗比较，Eg95s能够诱导更高水平的抗体且能够维持更长时间。Jazouli等 [51]也对Eg95蛋白的表达系统进行优化，构建了可溶性Eg95NC表达系统，并取得了更高的纯化效率。Eg95NC [25, 40]在绵羊免疫保护实验中展现出高达100%保护效率，具有巨大的应用潜力，有望在进一步的动物临床试验中取得良好的评估效果。重组蛋白疫苗具有安全性高、易于生产、稳定性好等优点，受到广泛关注。
2.2.2 其他重组蛋白疫苗
除Eg95重组蛋白疫苗外，还有大量棘球绦虫蛋白分子被报道作为棘球蚴病疫苗的候选抗原，它们在动物实验中的减囊效率或减虫效率达到了5.10%～100%（表3）[23, 35, 52-76]。其中，细粒棘球绦虫抗原EgVac [52]在犬中实现了对细粒棘球蚴成虫发育100%的抑制；EgM123 [53]在犬中对虫卵形成的抑制率也高达99.50%。此外，EgP29[54]、Eg14-3-3 [55-56]、EgGST1 [57]等候选疫苗在小鼠和羊模型中也达到95%以上的减囊效果。多房棘球绦虫抗原如Em14-3-3 [58]、TSP1[59]和Em95 [60-61]达到了75%以上的减囊效果。
表3
重组蛋白疫苗在不同疾病的受试动物中的应用
2.2.3 多价联合重组蛋白疫苗
棘球绦虫的感染有多种蛋白质的参与和复杂的机制。寄生虫在不同发育阶段所表达的蛋白质存在质和量的差异。单个抗原的候选疫苗可能难以达到满意的保护效果。应对这一挑战，研究者们开始关注棘球绦虫感染过程中的多个关键抗原，并将这些抗原融合表达，设计出多价联用疫苗，如EgFABP-EgA31通用绦虫疫苗。EgFABP [77-78]基因能够从原头蚴cDNA中克隆，对应一类参与脂肪酸交换和运输的功能蛋白质；EgA31 [79]由细粒棘球绦虫成虫cDNA表达文库中筛选出，表达于原头蚴吸盘区域的皮层细胞。当原头蚴头节外翻时，吸盘上的EgA31 mRNA含量显著增加，具有良好的免疫原性，能诱导犬产生特异性抗体，也能被棘球蚴患者血清所识别 [80-81]。这些多价联用疫苗的设计覆盖多个靶点，能够增强疫苗的免疫保护效果。这一策略为棘球蚴病疫苗的研发提供了新的方向和可能性。
2.3 核酸疫苗
2.3.1 DNA疫苗
DNA疫苗是21世纪新兴的一种疫苗类型，在棘球蚴病疫苗的研究中备受关注。DNA疫苗的关键成分是一小段环状DNA，其中包含编码特定疫苗抗原的基因。接种入机体的DNA借助宿主细胞表达抗原表位，这些抗原表位会被呈递到宿主细胞表面，触发针对疫苗抗原的免疫应答 [82]。目前报道有Eg95 [83]、EgAgB8/2 [84]、EgP29 [85]和EgAgB [86]基因的DNA疫苗 [87-88]。与CE DNA相关研究约5项，其中仅EgP29和EgA31有保护性的评价，其减囊效率为50%～93%（表4）。尽管现有DNA疫苗的免疫原性较弱，但这类疫苗能激活CD4+和CD8+ T细胞，诱导体液和细胞免疫反应，这使得DNA疫苗在诱导免疫反应方面仍具有独特优势；它还具有高度的热稳定性，无需低温保存和冷链运输，储存和运输的成本低 [89]。因此，DNA疫苗在全球范围，尤其是在资源有限的发展中国家，具有极大的吸引力。DNA疫苗的优势为棘球蚴病疫苗的研发提供了新的方向，但针对棘球蚴病的DNA疫苗研究仍处于初级阶段 [85, 90]。DNA疫苗的有效性和安全性需要通过更多的临床试验来验证。例如，疫苗DNA片段在宿主体内的持续存在和整合到宿主基因组带来的安全性担忧。其次，DNA疫苗的设计还需要进一步优化，并开发高效的佐剂，以提高它在宿主中的表达效率和免疫原性 [89]。目前尚无针对AE的DNA疫苗研究报道，这为研究提供了广阔的探索空间。
表4
核酸DNA疫苗的应用
2.3.2 mRNA疫苗
除了DNA疫苗，近年来备受关注的mRNA疫苗也在疾病的防控中展现出了巨大的潜力。mRNA疫苗利用接种者细胞合成棘球绦虫抗原来激发机体的免疫反应，其独特的优势主要体现在以下几个方面：① mRNA疫苗制备不涉及感染性的病原体，避免了感染和致病的风险；② 通过引入转录后修饰，mRNA疫苗的有效性和稳定性高；③ 具备快速研发、扩大规模和快速生产的优势 [92-93]；④ mRNA疫苗具有良好的稳定性，如进入临床试验的mRNA狂犬疫苗CV7201可以于5～25 ℃环境下储存3年 [94-95]。因此，mRNA疫苗的安全性、快速性、稳定性、适应性等优势为棘球蚴病的防控提供了新的希望和选择。然而在棘球蚴病mRNA疫苗的研发尚处于启动中，其有效性、安全性、生产工艺、生产成本和市场价值需进一步评估和优化。
2.4 合成表位疫苗
借助于计算机模拟、数据分析，以及成熟的基因重组和高效表达的系统技术，反向设计和开发具有高免疫原性和高安全性的抗原疫苗也是当前疫苗研究的方向。
生物信息学的方法和技术被应用于抗原结构和理化参数的分析，预测T细胞和B细胞抗原表位。经过针对性地设计和改造蛋白质结构，能编码多个免疫优势表位，从而更精确地诱导持久的免疫应答，增强抗原诱导的免疫保护效果 [72]。如通过预测Eg95蛋白的T细胞和B细胞表位设计出了多表位抗原多肽，这一多表位抗原多肽与白细胞介素（interleukin，IL）-2组合，在小鼠体内诱导出与商用重组Eg95蛋白疫苗相当水平的体液免疫和更强的细胞免疫应答，表现在相当水平的Eg95特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgA、IgM抗体和较高水平的辅助T细胞1型（IL-2、IL-12p70、肿瘤坏死因子α和干扰素-γ）和辅助T细胞2型（IL-4、IL-5、IL-6和IL-13）细胞因子[83]。Yu等 [96]通过对蛋白质的理化参数、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构和T、B细胞表位的预测，利用分子对接技术优化细胞表位，构建了EgTeg和EgFABP1的多表位疫苗，这种多表位疫苗在小鼠实验中表现出良好的免疫原性，能显著减轻原头蚴腹腔注射感染小鼠的棘球蚴囊肿重量。此外，Eg14-3-3 [52]、EgP29 [97]、EgM9、Eg10196、EgA31、EgG1Y162 [98-99]等抗原也被用于预测T细胞和B细胞表位，但目前缺乏免疫原性和免疫保护效果评估的相关数据以支撑其应用的可行性。
计算机辅助设计可以开发具有高免疫原性和高安全性的疫苗，它能够为棘球蚴病防控提供新的策略和方法。但不同的软件可能使用不同的算法和数据源，导致表位预测结果的差异。因此，为了提高表位预测的准确性，使用多个软件同时进行预测并综合考虑预测结果是必要的。
2.5 载体疫苗
载体疫苗是一类利用DNA重组技术，通过细菌、真菌、病毒或纳米颗粒等载体将目标抗原基因或蛋白传递到机体免疫系统，诱导特异性免疫应答的疫苗。常见的载体有酵母、病毒、细菌、纳米颗粒等。目前已被文献报道的棘球蚴病疫苗载体包括：精氨酸纳米脂质颗粒 [83]、纳米细胞膜囊泡 [100]、牛痘病毒 [101]、沙门氏菌 [102]、BCG [103]、乳酸乳球菌 [104]、双歧杆菌 [105]、狂犬病毒 [106]等。细菌载体疫苗研究占比最多，但仅有少数研究评估了疫苗的免疫保护效率（表5） [64, 101, 103, 107-110]，其中以BCG为载体的疫苗对棘球蚴囊肿的抑制率最高（为92.46%） [103]。除了细菌载体疫苗，以纳米细胞膜囊泡为载体的T细胞和B细胞多表位疫苗（V-T/B） [100]首次展示了一种可以减轻多房棘球绦虫负担的纳米疫苗策略，该疫苗在小鼠实验中能够激活树突状细胞，并诱导特异性T/B细胞互馈回路，充分发挥细胞免疫和体液免疫在抵抗感染中的作用，最终显著抑制多房棘球蚴感染和棘球蚴囊肿生长。此外，这些载体疫苗的传递方式丰富多样，涵盖皮下接种、肌肉接种、呼吸道接种和消化道接种。经呼吸道和消化道接种为家畜和动物免疫提供了便捷的防疫方式，是这类疫苗的优势。未来载体疫苗在棘球蚴病防控中的应用前景广阔，但仍需要在安全性、稳定性、免疫原性等方面开展更多研究，需要进一步的临床试验数据支撑以促进其转化和应用。
表5
细菌载体疫苗的应用
3 疫苗研发面临的主要瓶颈和挑战
3.1 致病和抵抗机制认知不足
目前，已了解棘球绦虫入侵和感染的途径及基本过程，但对棘球绦虫感染的致病机制和机体免疫防疫机制缺乏全面和系统的认识，特别是对寄生虫入侵和感染过程中在分子层面的认识，例如，尚不清楚参与棘球绦虫感染和在宿主体内发育过程中的关键分子及其生物学功能。深入探究宿主与棘球绦虫间相互作用的具体分子机制和免疫反应，将为优化和设计疫苗提供更多的线索和靶点。可以依托合适的动物感染模型，加强对六钩蚴入侵中间宿主及它在体内生长发育过程中的分子机制和免疫应答的研究，探寻棘球绦虫感染过程中直接和协助参与入侵宿主的关键抗原和靶点，以及棘球绦虫入侵宿主的关键环节。
3.2 实验用感染性材料的限制
感染动物模型是疫苗研发中不可或缺的环节，缺乏足够的感染性材料是棘球蚴病感染机制研究和疫苗开发中的挑战之一。棘球绦虫主要分布在畜牧业发达的牧区或半牧区，例如，细粒棘球绦虫的幼虫阶段主要寄生于偶蹄类动物，而成虫则寄生于犬科动物 [111]。这种生物学限制使得在实验室条件下持续获取、长期保存和人工扩增棘球绦虫在资源获取和技术上都面临诸多困难，导致实验依赖野外人工采集虫体样本。因此，加强国内和国际的合作，共享实验材料、技术平台及研究成果，减少重复性工作，将加速疫苗候选物的筛选与评估。鉴于获取感染性材料的困难，还可以考虑开发替代感染模型，如利用细胞系或模式动物模拟棘球绦虫感染过程。
3.3 有效性评价方式和指标的差异
棘球蚴病疫苗的研发面临多方面的瓶颈和挑战。无论是虫体源蛋白疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、合成表位疫苗还是载体疫苗，都面临如何找到具有更强免疫原性和更好免疫保护效果的抗原问题。比较各种抗原的免疫保护机制和效果有助于加速筛选出最优的疫苗抗原。但由于不同研究之间的接种方式、疫苗佐剂的选择、动物模型和攻毒方式、以及保护性评价指标存在差异，难以在临床前阶段通过文献报道的结果直接比较和评价不同候选疫苗间的保护效果。
3.3.1 接种方式与疫苗的保护效果
大多数研究通过皮下注射接种疫苗，而TSP3蛋白 [78]经呼吸道和皮下注射接种小鼠诱导的减囊效率分别为62.8%和81.9%，提示同种抗原采用不同的接种方式所诱导的免疫保护效果存在差异，表明探究疫苗的投递方式可能有助于进一步提升疫苗的免疫保护效果。近年来有文献 [112]报道，口服接种疫苗不仅可以诱导系统性的免疫应答，还可以增强消化道局部黏膜免疫应答，具有多重保护优势。如口服疫苗可以提高患者的依从性，降低注射带来的风险，简化给药过程，减少对医护人员的需求，以及降低职业暴露导致的伤害等 [113]。鉴于棘球蚴病“病从口入”及六钩蚴穿透肠黏膜的感染特点，口服接种疫苗和增强局部黏膜免疫反应，从理论上是一种有效的预防棘球蚴感染的方法。
3.3.2 佐剂选择与疫苗的保护效果
佐剂也是影响疫苗保护效果的重要因素之一。Heath等 [114]使用不同佐剂组合，比较了重组Eg95蛋白疫苗的保护效果，其中包括单独使用Eg95以及与TASGEL、SAPONIN、ISA70、M888_Drakeol、DEAE_Dextran、QuilA、ISA50、STM等佐剂搭配，结果显示，Eg95单独使用时的保护有效率为34%～87%，与上述佐剂分别组合后的保护有效率分别为38%～68%、93%～100%、95%～100%、–10%～95%、64%～100%、86%～100%、63%～99%和70%～100%，结果提示，佐剂的合理选择和搭配可以提升疫苗的免疫保护效果，对进一步探讨不同佐剂组合的优化策略提供了有力的依据。
3.3.3 动物模型与疫苗效果评价
不同动物模型与攻毒方式的差异限制了不同抗原的免疫原性和保护效果的直接比较。在棘球蚴病疫苗的保护效果评价中，攻毒方式主要包括口服虫卵和腹腔注射原头蚴两种感染模型，这两种攻毒模型的存在导致不同研究中不同抗原的免疫保护效果难以直接比较。六钩蚴穿透肠壁进入机体是自然感染发生的关键环节，而腹腔注射原头蚴感染小鼠动物模型仅模拟了原头蚴在宿主腹腔内定植和发育成为囊肿的发病过程 [111]。相比之下，建立经消化道虫卵自然感染的动物模型是评价疫苗保护效率的必要工具，在模拟感染过程和评估疫苗的有效性方面具有独特的优势。Dempster等 [115]报道DBA/2J小鼠经消化道感染Eg虫卵的有效率约为83.3%；由弘等 [116]报道昆明鼠口服Eg虫卵的感染有效率为81%。近年的棘球蚴病疫苗研发中腹腔注射原头蚴感染小鼠的模型约占44%，是评估疫苗保护效率的重要工具。为了更客观地评价疫苗的免疫保护效果，在疫苗研究中有必要选择和统一最接近自然感染的攻毒方式。
3.3.4 保护性评价指标
当前的疫苗研究缺乏统一的保护性评价指标。虽然大量重组蛋白疫苗研究已取得一定进展，但保护性评价的指标各异。如棘球蚴囊肿重量减轻率、棘球蚴囊肿数量减少率、成虫降低率、虫卵降低率、保护效率等都用作保护性评价的指标，导致各研究间评估结果的差异化和可比性差，阻碍了棘球蚴病保护性抗原有效性的直接评估和比较。因此，为了确保研究结果的可靠性和可比性，迫切需要在棘球蚴病疫苗研究领域建立统一的评估指标和标准化的实验方法，以便更有效地评估和比较不同实验室间的抗原保护效果，从而推动棘球蚴病疫苗的研发和应用进程。
3.4 野生动物的免疫预防
仅依靠对家畜免疫接种的措施不能解决物种间反复传播这一问题和消除环境中分布的虫卵，因此，预防野生动物感染也是控制和彻底消除棘球蚴病不可忽略的环节。但传统的动物接种方法无法直接复制和应用于野生动物。“可传播疫苗” [117]是一种载有来自病原体基因片段的动物病毒，具有个体间传播能力，通过接触感染在野生动物种群中传播，以诱导种群免疫反应，可能是打破棘球蚴病野外传播链的理想工具。2001年，为预防兔黏液瘤病，Torres等 [118]研制表达兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白的重组黏液瘤病毒活疫苗，在小岛上为少数野兔接种疫苗后，小岛上50%未接种疫苗的野兔也产生了抗原特异性抗体。提示可传播疫苗在预防人畜共患病方面存在巨大潜力。
4 总结及未来展望
过去几十年来，中国针对人类、牲畜和家犬的棘球蚴病防控工作取得了重要进展。在教育宣传、家畜屠宰管理、犬只管理、强制免疫、疫情监控等防控策略的实施下，2022年全国新增病例数量较2004年约下降了50% [22]。然而最新的热带病报告 [19]显示，全球每年仍有31个国家报告了棘球蚴病病例，棘球蚴病仍然为全人类健康带来了巨大的威胁和造成了严重的经济负担 [119-120]，完全消除棘球蚴病尚需全人类的共同和继续努力。
疫苗作为控制传染病的最有效和最经济的手段，其研发是一项极具挑战性的任务。尽管当前已有针对细粒棘球绦虫的兽用疫苗，但该疫苗的设计有待优化，免疫保护效果有待提升。构建的很多候选疫苗尚无充分的免疫保护性评价，约23%的棘球蚴病疫苗研究仅停留在实验室阶段，多数候选疫苗有待临床试验的评价，以促进其进一步推广和应用。若能克服棘球蚴病疫苗研发过程中面临的诸多挑战，必定会加速疫苗的研发和棘球蚴病防控的进程。
总之，棘球蚴病的防控虽然面临致病和抵抗机制、疫苗研发技术、野生动物传播等诸多挑战，但通过对疾病感染和免疫防疫机制的深入研究以及创新技术的运用，有望开发出更多安全有效的棘球蚴病疫苗，以控制棘球蚴病的流行。特别是对于经济欠发达的地区，棘球蚴病防控带来的收益远不止保障当地农牧民的健康，还能帮助当地农牧民实现生计改善，完成“全国所有流行县基本控制棘球蚴病流行”和“健康中国2030”的目标和任务，真正实现在全球消灭棘球蚴病。
重要声明
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