随着医疗水平的进步和卫生服务的提高，全球人均预期寿命不断提高，老年人口不断增加，实现健康老龄化是一个巨大挑战[1]。神经系统疾病在所有年龄段死亡人数中占比最高，也是造成过去十年非传染性疾病中老年人死亡百分比变化最大的原因[2]。神经退行性疾病（neurodegenerative diseases，NDD）的特征是神经元之间的连接和通信中断以及中枢或周围神经系统的进行性功能丧失，导致运动和认知过程受损。NDD的主要类型包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和多发性硬化症（multiple sclerosis，MS），遗传易感性是这些具有离散形态学和病理生理学特征的NDD发生的主要危险因素之一，说明退行性病变和遗传因素有关[3]。目前NDD的治疗仅限于对症治疗，迫切需要能够阻止或减缓潜在神经退行性过程的治疗方法。
脂质在体内分布广泛，占细胞膜重量的50%，是血液代谢产物的重要组成部分[4]。脂质通常是疏水分子和组织的重要组成部分，在多种生物过程中发挥重要作用，比如信号传导、能量代谢、免疫反应等[5]。脂质代谢与机体的生理、病理密切相关，并且在基因组到表型组的遗传信息流动中，脂质组比转录组或蛋白质组更接近表型组。因此，脂质组学可以更好的为研究遗传相关的NDD提供基因层面上的信息和见解[6]。脂质代谢紊乱引起的各种特异性蛋白聚集和沉积是NDD发病的重要危险因素，并且长期影响NDD的发病、进展和严重程度[7]。对NDD患者和动物模型的脂质组学分析也揭示了多种脂质水平的改变，包括胆固醇、甘油磷脂、鞘脂等[8,9]。为了进一步了解脂质和NDD之间的相互作用，并提出早期治疗策略以改善和缓解相关疾病人群症状，有必要明确血浆脂质组与NDD之间的潜在因果关系。但是由于观察性研究存在混杂因素、反向因果、测量误差等局限性，无法提供因果联系的直接证据。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是一种用于因果推断的分析方法，用于流行病学病因学领域[10]。MR分析利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量（instrumental variable，IV），并依靠减数分裂过程中均匀、随机和独立分布的遗传变异，可以有效避免混杂因素和反向因果关系[11]。本研究基于大型全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）汇总数据进行一项双向两样本MR研究，探索不同血浆脂质体与主要NDD之间的因果关系，以期为临床加强筛查及防范提供新的依据。
1 资料与方法
1.1 暴露与结局数据
本研究利用MR分析方法，以179种脂质体为暴露因素，AD、PD、ALS和SM在内的4种主要NDD为结局指标，研究脂质体与NDD疾病之间的因果关系。179种脂质体的GWAS数据来自一项涉及7 174名欧洲参与者的研究[13]，详细数据可以从GWASCatalog网站下载获取。179种脂质体属于13个脂质类别，涵盖4个主要脂质类别：甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和甾醇。AD、PD和MS的GWAS数据来自FinnGen数据库，ALS的GWAS数据库来自IEU数据库（表1）。
表1
本研究数据来源
1.3 IV选择
在MR中IV需满足3个假设[12]：与暴露密切相关（相关性假设）、独立于研究中的潜在混杂因素（独立性假设）及仅通过暴露与结局相关（排他性假设）。本研究对IV的选择：① 以P<5×10−6，且连锁不平衡参数为r2<0.001，kb=10 000为阈值条件[14]从脂质体中筛选符合条件的SNP；② 将筛选出来的SNP与NDD的数据进行合并，删除两者等位基因频率不一致或者回文的SNP；③ 计算F统计量（设定F统计量>10时，SNP强度足够）以验证单个SNP的强度。为了避免弱工具偏差对因果推理的影响，我们使用了公式F=β2（暴露）/se2（暴露）计算IV的强度，并消除F<10的IV[15]。
1.4 统计分析
本研究采用双向两样本MR分析，采用逆方差加权法（IVW）进行分析，因为IVW在MR结局没有多效性的情况下是效果最稳健效果和最佳统计效能的MR分析方法[16]。同时，以MR-Egger回归、加权中位数法（weighted median estimator，WME）、加权众数法（weighted mode，WM）、简单众数法（simple mode，SM）作为IVW的补充方法。本研究利用Cochran’s Q检验来评估IVW和MR-Egger中SNPs的异质性，验证MR结果的稳健性[17]。采用MR-Egger和MR-PRESSO用来检验水平多效性，并利用留一法（leave-one-out）逐步剔除各SNP，计算并比较不同剩余SNP的合并效应，进行敏感性分析[18]。所有分析均采用R软件（版本4.2.1）TwoSampleMR和MR-PRESSO软件包进行[19]。
本研究利用MR-Steiger用于评估因果方向是否正确，暴露因素与结局之间是否存在反向因果，若P<0.05，则说明暴露与结局因果方向无误；反之亦然。同时，在此基础上以AD、PD、MS和ALS为暴露因素，相关脂质体为结局进行反向MR分析对MR-Steiger结果进行验证。
2 结果
2.1 IV选择结果
本研究以179种脂质体作为暴露因素，多种NDD（包括AD、PD、ALS和MS）作为结局指标，在筛选IVs的过程中，满足相关参数条件，以确保所选SNP的合适性。MR结果中纳入分析的每个SNP的F统计量均超过10，表明IVs的稳健性，在结局中没有发现弱偏倚IVs，因此本研究的结论被认为是可靠的。阳性结果的SNP特征见附件表1～表4。
2.2 双向两样本MR结果
2.2.1 脂质体与AD
正向MR分析一共鉴定出16种脂质体与AD之间存在因果关系（图1）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，10种脂质体与AD之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），7种脂质体与AD之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有磷脂酰乙醇胺（PE）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］、磷脂酰胆碱（PC）［OR=0.92，95%CI（0.85，0.99），P=0.02］和磷脂酰肌醇（PI）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］三种脂质体与AD之间不存在反向因果。
图1
阿尔茨海默病正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.93～491.51之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），脂质体与AD之间的因果关系受异质性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影响的可能性较小。漏斗图结果显示，符合筛选标准所纳入的SNP大致数量相等的分布在IVW方法的两侧，所有SNP作为工具变量所得到的结果比较稳定，不受潜在因素影响而发生偏倚，见附件图1。留一图结果显示，按顺序删除每个SNP会导致剩余的SNP位于无效线的同一侧，这表明删除任何SNP都不会对结果产生重大影响，见附件图2。
表2
异质性和水平多效性检验
2.2.2 脂质体与PD
正向MR分析一共鉴定出4种脂质体与PD之间存在因果关系（图2）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，4种脂质体与PD之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），4种脂质体与PD之间不存在反向因果关系（P<0.05）。甾醇脂［OR=1.18，95%CI（1.04，1.34），P=0.01］、TG［OR=1.26，95%CI（1.02，1.56），P=0.03］、PE［OR=0.79，95%CI（0.64，0.98），P=0.03］和PC［OR=0.83，95%CI（0.69，0.98），P=0.03］四种脂质体与PD之间不存在反向因果。
图2
帕金森病的正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.97～160.74之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），MR结果没有异质性和水平多效性，说明脂质体与PD之间的因果关系比较稳健。同时，漏斗图（附件图3）和留一图结果显示（附件图4），MR结果比较稳定，不受潜在因素影响而发生偏倚，也不会因为删除任何SNP会对结果产生重大影响。
2.2.3 脂质体与MS
正向MR分析一共鉴定出8种脂质体与MS之间存在因果关系（图3）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，4种脂质体与MS之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），4种脂质体与MS之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有DAG［OR=1.24，95%CI（1.01，1.54），P=0.04］、SM［OR=1.31，95%CI（1.08，1.58），P=0.01］、PI［OR=0.77，95%CI（0.62，0.95），P=0.02］和PC［OR=0.74，95%CI（0.58，0.95），P=0.02］，4种脂质体与MS之间不存在反向因果。
图3
多发性硬化症正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.88～173.64之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表5），异质性和水平多效性不会对MR结果产生影响。漏斗图（附件图5）及留一图（附件图6）再次验证了MR结果的稳健性，不受单一SNP和潜在因素的影响。
2.2.4 脂质体与ALS
正向MR分析一共鉴定出10种脂质体与ALS之间存在因果关系（图4）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，3种脂质体与ALS之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），7种脂质体与ALS之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有TG［OR=1.03，95%CI（1.01，1.05），P=0.02］、PI［OR=0.98，95%CI（1.01，1.04），P=0.02］和PC［OR=0.77，95%CI（0.97，0.99），P=0.03］，3种脂质体与AD之间不存在反向因果。
图4
肌萎缩侧索硬化症正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.94～505.91之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），脂质体与ALS之间的因果关系受异质性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影响的可能性较小。漏斗图（附件图7）及留一图（附件图8）显示MR结果具有稳健性，不受单一SNP和潜在因素的影响。
3 讨论
本研究通过利用公开的GWAS数据集进行两样本双向MR分析，以此来探究179种脂质体与AD、PD、MS和ALS在内的多种NDD之间潜在的因果联系。MR结果显示，有一些脂质体可能与这些疾病存在因果联系，对疾病的进展或预防起到一定作用。
蛋白质沉积是许多淀粉样蛋白疾病的标志，包括AD和PD。PD与α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集有关[20]；在AD的情况下，淀粉样蛋白β（Aβ）肽和过度磷酸化的tau蛋白的异常聚集被认为介导了大脑额叶皮层神经元的顺序丧失[21]。PC是一种重要的脂质分子，广泛存在于细胞膜中，特别是神经细胞膜。Dmitry等[22]研究表明PC可以改变淀粉样蛋白的聚集率，抑制Aβ和α-Syn的聚集，并且可以降低淀粉样蛋白低聚物形成的原纤维的毒性，减轻淀粉样蛋白沉积对神经元的损伤，缓解AD和PD的病情进展，减轻AD和PD的发病风险。基底前脑的胆碱能神经元是早期AD发生病变所损伤的一种重要神经元，而PC对基底前脑灰质完整性发挥着重要作用[23]。PC可以预测基底前脑变性，并且可以通过减少炎症和增加自噬清除机制来减轻阿尔茨海默病模型中Aβ诱导的神经毒性，说明PC是AD的保护因素，提高PC水平可以减少AD的发病风险。AD的多种代谢途径存在缺陷，近年来对于异常脂质代谢在AD中的作用逐渐被人们所重视。Batra等[24]研究发现，PC和PE的异常周转构成了AD中最突出的脑代谢缺陷。P磁共振波谱研究显示，AD患者的甘油磷酸胆碱（GPC）和甘油磷酸乙醇胺（GPE）浓度会升高[25,26]，而GPC和GPE伴随着多种PC和PE分子物种的丰度降低，说明AD患者中的PC和PE在加速代谢和分解，因此提高PC和PE的浓度可能会对AD的预防和治疗起到一定的保护作用。相关研究表明，AD的病理机制和神经元炎症和氧化应激也密切相关。PI是体内一类重要的磷脂，并且可以转化为多种衍生物，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等。PI可以增加抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶等）的表达和活性，也可以与NADPH氧化酶亚基（p47phox）结合，抑制NADPH氧化酶的活性，从而减少活性氧的产生，从而有效清除自由基和氧化物质，降低氧化应激水平，减轻氧化应激对细胞的伤害[27]。磷脂酰肌醇通过抑制炎症相关的信号通路，如核因子κB（NF-κB）信号通路，降低炎症因子的表达水平，减少炎症反应的强度。此外，磷脂酰肌醇还能够调节炎症细胞的迁移和调控白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症促进因子的合成，进一步发挥抗炎作用[28]。这些抗炎和抗氧化的作用有助于保护神经元免受损害，减缓AD的进展。
PD的病理特征包括黑质中多巴胺能神经元进行性死亡和路易体的形成，这与神经元中α-Syn异常聚集密切相关。相关研究表明，胆固醇在脑中的过度累积不仅会阻碍突触可塑性，还会引发细胞凋亡神经元死亡，促进PD等退行性疾病的发展[29]。高水平的脑胆固醇似乎是帕金森病发展的重要因素。Raju等人发现外源性胆固醇在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）（一种帕金森神经毒素）后，通过增加线粒体膜电位的去极化，加速多巴胺能神经元的死亡[30]。Galvagnion等[31]研究发现，主要存在于突触前末端的α-Syn可以与特定的脂质家族（如鞘脂、脂肪酸和甾醇）结合并形成α螺旋脂质-蛋白质复合物。这些复合物会增加α-突触核蛋白形成不溶性细胞内斑块的倾向，从而引起神经元损伤，甾醇脂作为甾醇的一种也具有这样的功能，可以增加PD的发病风险。相关研究表明，PE对线虫α-Syn诱导的多巴胺能神经元变性有显著保护作用[32]。一项影像学研究发现，与健康对照组相比，PD患者中脑和脑脊液中的磷酸乙醇胺水平显著降低，说明提高PE水平可能对PD患者发挥治疗作用[33]。
MS以神经炎症和神经退行性变为特征，Seyed等人对MS患者的血浆样本进行分析，结果显示DAG的水平显著增高，说明MS患者体内DAG含量异常增长，DAG可能增加MS的发病风险[34]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠是多发性硬化症（MS）的最佳动物模型，Cui等人在动物实验中发现，大鼠EAE诱导早期DAG的积累，也说明DAG升高与MS的发病密切相关[35]。Silke等[36]通过EAE大鼠动物实验发现，如果用阿米替林，即鞘磷脂水解酶的功能抑制剂治疗小鼠，可以防止EAE的发展，并显着减弱特征性的有害神经炎症反应，说明高水平的鞘磷脂被水解之后会产生神经炎症，损伤神经元，最终可能导致MS，是MS的危险因素。神经血管单位（NVU）由神经元、神经胶质细胞和血管细胞组成，确保血脑屏障（BBB）的正确稳态，并间接确保中枢神经系统的功能。PC可以调节NVU细胞的生理功能，起到保护作用，防止NVU的损伤。同时，如果PC缺乏，会导报包括MS在内的多种神经退行性疾病的发展[37]。PI是细胞膜磷脂的一种，在体内的作用主要通过其磷酸化产物如磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）发挥作用，同时PI也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的底物。PIP3是Akt激酶的活化子，是PI通过PI3K信号通路生成的。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的主要免疫细胞，负责多发性硬化症（MS）的病理性炎症脱髓鞘。相关研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的小胶质细胞自噬激活，可以抑制小胶质细胞的炎症反应，减轻EAE的症状[38]。
ALS是一组以运动神经元损伤和各种肌肉功能丧失为特征的异质性进行性神经退行性疾病，血脂异常常见于ALS。一项队列研究表明，经过长期的随访，较高水平的TG与ALS发病风险增加有关[39]。Katherine等[40]对ALS患者血清的脂质组学进行分析，发现与健康组相比，TG的富集程度显著升高，并且随着ALS疾病的进展，容易发生脂质过氧化，增加有毒脂质产物的形成。Wagey等[41]研究发现，与健康对照组相比，死于ALS的患者脊髓组织颗粒部分中PI3K的活性和蛋白水平升高。相关研究表明，VAPB/ALS8蛋白突变可引起ALS，通过减少与VAPB相关的PI4P增加，可以减缓多种ALS中的运动神经元缺陷、神经退行性变或神经突延伸减少[42]。Arima等[43]通过动物实验，分析ALS小鼠模型发现，ALS小鼠的脊髓中PC水平显著降低，反映了运动神经元的损害与丧失。ALS中存在Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）的基因突变，Ikeda等[44]发现，对ALS小鼠注射PC结合的Cu/ZnSOD减缓了运动功能障碍的进展，防止了去神经支配肌肉萎缩，并延缓了小鼠脊髓运动神经元的退化，其作用机制与氧化应激有关。
由于全球人口老龄化导致NDD发病率和死亡率的不断升高，近年来对于NDD的治疗一直是医疗领域的热点问题。BBB作为血液和脑组织之间的动态界面，选择性地限制包括治疗剂在内的物质的通过，这导致病变区域的药物浓度较低，对有效治疗脑部疾病提出了挑战。相关研究表明，用各种配体修饰的脂质体在穿透血脑屏障和靶向与不同疾病相关的病变方面表现出显著优势[45,46]。配体修饰的脂质体作为载体递送在治疗多种NDD中发挥着至关重要的作用，如阿尔茨海默病、帕金森等[47]。本研究的双向MR结果显示，一些脂质体可以作为NDD治疗的载体，将治疗药物封装在其中，不仅可以提高药物浓度，而且能够穿越BBB的阻碍，并最终实现疾病的有效治疗[48]。当然对于NDD来说，由于发病机制尚不明确，病变区域的结构和功能复杂，脂质体递送系统在实现靶向大脑方面面临挑战，需要更深入的研究才能有效治疗[49]。
本研究的优点是通过双向两样本MR分析来研究179种脂质体与多种NDD之间的因果关系，这是对脂质体与NDD之间相关性的最全面的研究。MR分析利用SNPs作为IVs来推断因果关系，可以有效克服反向因果关系和混杂引起的偏差。同时，为了保证MR分析的准确性，我们进行了敏感性检验。我们选取的暴露因素和结局的数据来源于不同国家的欧洲人群，以避免不必要的偏倚。当然，这项研究的局限性也不容忽视。首先，尽管我们采取了控制措施，但工具变量可能仍然具有无法衡量的混淆并影响结果。其次，MR建立在暴露与结局间线性关系成立的假设下，不讨论一切非线性关系，故不普遍适用；同时，由于缺乏按年龄和性别分类的汇总级数据，本研究无法基于这些因素对不同NDD进行分层分析；最后，本研究纳入了欧洲血统的人群，可能会限制研究结果在其他族裔人群中的应用。
综上所述，本研究对179种和多种NDD之间进行了双向MR分析，结果显示甾醇酯、胆固醇、PC、PE、PI、DAG、SM、TG和不同的NDD之间存在因果联系，然而该结果还需要进一步的实验验证，并在此基础上开展深入的分子机制挖掘，为NDD的早期筛查与可能的药物靶点发现提供了基础。
随着医疗水平的进步和卫生服务的提高，全球人均预期寿命不断提高，老年人口不断增加，实现健康老龄化是一个巨大挑战[1]。神经系统疾病在所有年龄段死亡人数中占比最高，也是造成过去十年非传染性疾病中老年人死亡百分比变化最大的原因[2]。神经退行性疾病（neurodegenerative diseases，NDD）的特征是神经元之间的连接和通信中断以及中枢或周围神经系统的进行性功能丧失，导致运动和认知过程受损。NDD的主要类型包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和多发性硬化症（multiple sclerosis，MS），遗传易感性是这些具有离散形态学和病理生理学特征的NDD发生的主要危险因素之一，说明退行性病变和遗传因素有关[3]。目前NDD的治疗仅限于对症治疗，迫切需要能够阻止或减缓潜在神经退行性过程的治疗方法。
脂质在体内分布广泛，占细胞膜重量的50%，是血液代谢产物的重要组成部分[4]。脂质通常是疏水分子和组织的重要组成部分，在多种生物过程中发挥重要作用，比如信号传导、能量代谢、免疫反应等[5]。脂质代谢与机体的生理、病理密切相关，并且在基因组到表型组的遗传信息流动中，脂质组比转录组或蛋白质组更接近表型组。因此，脂质组学可以更好的为研究遗传相关的NDD提供基因层面上的信息和见解[6]。脂质代谢紊乱引起的各种特异性蛋白聚集和沉积是NDD发病的重要危险因素，并且长期影响NDD的发病、进展和严重程度[7]。对NDD患者和动物模型的脂质组学分析也揭示了多种脂质水平的改变，包括胆固醇、甘油磷脂、鞘脂等[8,9]。为了进一步了解脂质和NDD之间的相互作用，并提出早期治疗策略以改善和缓解相关疾病人群症状，有必要明确血浆脂质组与NDD之间的潜在因果关系。但是由于观察性研究存在混杂因素、反向因果、测量误差等局限性，无法提供因果联系的直接证据。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是一种用于因果推断的分析方法，用于流行病学病因学领域[10]。MR分析利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量（instrumental variable，IV），并依靠减数分裂过程中均匀、随机和独立分布的遗传变异，可以有效避免混杂因素和反向因果关系[11]。本研究基于大型全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）汇总数据进行一项双向两样本MR研究，探索不同血浆脂质体与主要NDD之间的因果关系，以期为临床加强筛查及防范提供新的依据。
1 资料与方法
1.1 暴露与结局数据
本研究利用MR分析方法，以179种脂质体为暴露因素，AD、PD、ALS和SM在内的4种主要NDD为结局指标，研究脂质体与NDD疾病之间的因果关系。179种脂质体的GWAS数据来自一项涉及7 174名欧洲参与者的研究[13]，详细数据可以从GWASCatalog网站下载获取。179种脂质体属于13个脂质类别，涵盖4个主要脂质类别：甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和甾醇。AD、PD和MS的GWAS数据来自FinnGen数据库，ALS的GWAS数据库来自IEU数据库（表1）。
表1
本研究数据来源
1.3 IV选择
在MR中IV需满足3个假设[12]：与暴露密切相关（相关性假设）、独立于研究中的潜在混杂因素（独立性假设）及仅通过暴露与结局相关（排他性假设）。本研究对IV的选择：① 以P<5×10−6，且连锁不平衡参数为r2<0.001，kb=10 000为阈值条件[14]从脂质体中筛选符合条件的SNP；② 将筛选出来的SNP与NDD的数据进行合并，删除两者等位基因频率不一致或者回文的SNP；③ 计算F统计量（设定F统计量>10时，SNP强度足够）以验证单个SNP的强度。为了避免弱工具偏差对因果推理的影响，我们使用了公式F=β2（暴露）/se2（暴露）计算IV的强度，并消除F<10的IV[15]。
1.4 统计分析
本研究采用双向两样本MR分析，采用逆方差加权法（IVW）进行分析，因为IVW在MR结局没有多效性的情况下是效果最稳健效果和最佳统计效能的MR分析方法[16]。同时，以MR-Egger回归、加权中位数法（weighted median estimator，WME）、加权众数法（weighted mode，WM）、简单众数法（simple mode，SM）作为IVW的补充方法。本研究利用Cochran’s Q检验来评估IVW和MR-Egger中SNPs的异质性，验证MR结果的稳健性[17]。采用MR-Egger和MR-PRESSO用来检验水平多效性，并利用留一法（leave-one-out）逐步剔除各SNP，计算并比较不同剩余SNP的合并效应，进行敏感性分析[18]。所有分析均采用R软件（版本4.2.1）TwoSampleMR和MR-PRESSO软件包进行[19]。
本研究利用MR-Steiger用于评估因果方向是否正确，暴露因素与结局之间是否存在反向因果，若P<0.05，则说明暴露与结局因果方向无误；反之亦然。同时，在此基础上以AD、PD、MS和ALS为暴露因素，相关脂质体为结局进行反向MR分析对MR-Steiger结果进行验证。
2 结果
2.1 IV选择结果
本研究以179种脂质体作为暴露因素，多种NDD（包括AD、PD、ALS和MS）作为结局指标，在筛选IVs的过程中，满足相关参数条件，以确保所选SNP的合适性。MR结果中纳入分析的每个SNP的F统计量均超过10，表明IVs的稳健性，在结局中没有发现弱偏倚IVs，因此本研究的结论被认为是可靠的。阳性结果的SNP特征见附件表1～表4。
2.2 双向两样本MR结果
2.2.1 脂质体与AD
正向MR分析一共鉴定出16种脂质体与AD之间存在因果关系（图1）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，10种脂质体与AD之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），7种脂质体与AD之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有磷脂酰乙醇胺（PE）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］、磷脂酰胆碱（PC）［OR=0.92，95%CI（0.85，0.99），P=0.02］和磷脂酰肌醇（PI）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］三种脂质体与AD之间不存在反向因果。
图1
阿尔茨海默病正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.93～491.51之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），脂质体与AD之间的因果关系受异质性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影响的可能性较小。漏斗图结果显示，符合筛选标准所纳入的SNP大致数量相等的分布在IVW方法的两侧，所有SNP作为工具变量所得到的结果比较稳定，不受潜在因素影响而发生偏倚，见附件图1。留一图结果显示，按顺序删除每个SNP会导致剩余的SNP位于无效线的同一侧，这表明删除任何SNP都不会对结果产生重大影响，见附件图2。
表2
异质性和水平多效性检验
2.2.2 脂质体与PD
正向MR分析一共鉴定出4种脂质体与PD之间存在因果关系（图2）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，4种脂质体与PD之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），4种脂质体与PD之间不存在反向因果关系（P<0.05）。甾醇脂［OR=1.18，95%CI（1.04，1.34），P=0.01］、TG［OR=1.26，95%CI（1.02，1.56），P=0.03］、PE［OR=0.79，95%CI（0.64，0.98），P=0.03］和PC［OR=0.83，95%CI（0.69，0.98），P=0.03］四种脂质体与PD之间不存在反向因果。
图2
帕金森病的正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.97～160.74之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），MR结果没有异质性和水平多效性，说明脂质体与PD之间的因果关系比较稳健。同时，漏斗图（附件图3）和留一图结果显示（附件图4），MR结果比较稳定，不受潜在因素影响而发生偏倚，也不会因为删除任何SNP会对结果产生重大影响。
2.2.3 脂质体与MS
正向MR分析一共鉴定出8种脂质体与MS之间存在因果关系（图3）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，4种脂质体与MS之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），4种脂质体与MS之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有DAG［OR=1.24，95%CI（1.01，1.54），P=0.04］、SM［OR=1.31，95%CI（1.08，1.58），P=0.01］、PI［OR=0.77，95%CI（0.62，0.95），P=0.02］和PC［OR=0.74，95%CI（0.58，0.95），P=0.02］，4种脂质体与MS之间不存在反向因果。
图3
多发性硬化症正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.88～173.64之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表5），异质性和水平多效性不会对MR结果产生影响。漏斗图（附件图5）及留一图（附件图6）再次验证了MR结果的稳健性，不受单一SNP和潜在因素的影响。
2.2.4 脂质体与ALS
正向MR分析一共鉴定出10种脂质体与ALS之间存在因果关系（图4）。MR Steiger方向性检验（附件表5）结果表明，3种脂质体与ALS之间正相关趋势一致（TRUE）。反向MR-IVW结果表明（附件表6），7种脂质体与ALS之间存在反向因果关系（P<0.05）。只有TG［OR=1.03，95%CI（1.01，1.05），P=0.02］、PI［OR=0.98，95%CI（1.01，1.04），P=0.02］和PC［OR=0.77，95%CI（0.97，0.99），P=0.03］，3种脂质体与AD之间不存在反向因果。
图4
肌萎缩侧索硬化症正向MR分析图
两样本MR筛选出的SNP的F统计量范围在20.94～505.91之间，表明SNP没有弱IVs，MR结果受弱IV偏倚影响的可能性小；Cochran’s Q统计量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验提示（表2），脂质体与ALS之间的因果关系受异质性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影响的可能性较小。漏斗图（附件图7）及留一图（附件图8）显示MR结果具有稳健性，不受单一SNP和潜在因素的影响。
3 讨论
本研究通过利用公开的GWAS数据集进行两样本双向MR分析，以此来探究179种脂质体与AD、PD、MS和ALS在内的多种NDD之间潜在的因果联系。MR结果显示，有一些脂质体可能与这些疾病存在因果联系，对疾病的进展或预防起到一定作用。
蛋白质沉积是许多淀粉样蛋白疾病的标志，包括AD和PD。PD与α-突触核蛋白（α-Syn）的聚集有关[20]；在AD的情况下，淀粉样蛋白β（Aβ）肽和过度磷酸化的tau蛋白的异常聚集被认为介导了大脑额叶皮层神经元的顺序丧失[21]。PC是一种重要的脂质分子，广泛存在于细胞膜中，特别是神经细胞膜。Dmitry等[22]研究表明PC可以改变淀粉样蛋白的聚集率，抑制Aβ和α-Syn的聚集，并且可以降低淀粉样蛋白低聚物形成的原纤维的毒性，减轻淀粉样蛋白沉积对神经元的损伤，缓解AD和PD的病情进展，减轻AD和PD的发病风险。基底前脑的胆碱能神经元是早期AD发生病变所损伤的一种重要神经元，而PC对基底前脑灰质完整性发挥着重要作用[23]。PC可以预测基底前脑变性，并且可以通过减少炎症和增加自噬清除机制来减轻阿尔茨海默病模型中Aβ诱导的神经毒性，说明PC是AD的保护因素，提高PC水平可以减少AD的发病风险。AD的多种代谢途径存在缺陷，近年来对于异常脂质代谢在AD中的作用逐渐被人们所重视。Batra等[24]研究发现，PC和PE的异常周转构成了AD中最突出的脑代谢缺陷。P磁共振波谱研究显示，AD患者的甘油磷酸胆碱（GPC）和甘油磷酸乙醇胺（GPE）浓度会升高[25,26]，而GPC和GPE伴随着多种PC和PE分子物种的丰度降低，说明AD患者中的PC和PE在加速代谢和分解，因此提高PC和PE的浓度可能会对AD的预防和治疗起到一定的保护作用。相关研究表明，AD的病理机制和神经元炎症和氧化应激也密切相关。PI是体内一类重要的磷脂，并且可以转化为多种衍生物，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等。PI可以增加抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶等）的表达和活性，也可以与NADPH氧化酶亚基（p47phox）结合，抑制NADPH氧化酶的活性，从而减少活性氧的产生，从而有效清除自由基和氧化物质，降低氧化应激水平，减轻氧化应激对细胞的伤害[27]。磷脂酰肌醇通过抑制炎症相关的信号通路，如核因子κB（NF-κB）信号通路，降低炎症因子的表达水平，减少炎症反应的强度。此外，磷脂酰肌醇还能够调节炎症细胞的迁移和调控白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症促进因子的合成，进一步发挥抗炎作用[28]。这些抗炎和抗氧化的作用有助于保护神经元免受损害，减缓AD的进展。
PD的病理特征包括黑质中多巴胺能神经元进行性死亡和路易体的形成，这与神经元中α-Syn异常聚集密切相关。相关研究表明，胆固醇在脑中的过度累积不仅会阻碍突触可塑性，还会引发细胞凋亡神经元死亡，促进PD等退行性疾病的发展[29]。高水平的脑胆固醇似乎是帕金森病发展的重要因素。Raju等人发现外源性胆固醇在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）（一种帕金森神经毒素）后，通过增加线粒体膜电位的去极化，加速多巴胺能神经元的死亡[30]。Galvagnion等[31]研究发现，主要存在于突触前末端的α-Syn可以与特定的脂质家族（如鞘脂、脂肪酸和甾醇）结合并形成α螺旋脂质-蛋白质复合物。这些复合物会增加α-突触核蛋白形成不溶性细胞内斑块的倾向，从而引起神经元损伤，甾醇脂作为甾醇的一种也具有这样的功能，可以增加PD的发病风险。相关研究表明，PE对线虫α-Syn诱导的多巴胺能神经元变性有显著保护作用[32]。一项影像学研究发现，与健康对照组相比，PD患者中脑和脑脊液中的磷酸乙醇胺水平显著降低，说明提高PE水平可能对PD患者发挥治疗作用[33]。
MS以神经炎症和神经退行性变为特征，Seyed等人对MS患者的血浆样本进行分析，结果显示DAG的水平显著增高，说明MS患者体内DAG含量异常增长，DAG可能增加MS的发病风险[34]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠是多发性硬化症（MS）的最佳动物模型，Cui等人在动物实验中发现，大鼠EAE诱导早期DAG的积累，也说明DAG升高与MS的发病密切相关[35]。Silke等[36]通过EAE大鼠动物实验发现，如果用阿米替林，即鞘磷脂水解酶的功能抑制剂治疗小鼠，可以防止EAE的发展，并显着减弱特征性的有害神经炎症反应，说明高水平的鞘磷脂被水解之后会产生神经炎症，损伤神经元，最终可能导致MS，是MS的危险因素。神经血管单位（NVU）由神经元、神经胶质细胞和血管细胞组成，确保血脑屏障（BBB）的正确稳态，并间接确保中枢神经系统的功能。PC可以调节NVU细胞的生理功能，起到保护作用，防止NVU的损伤。同时，如果PC缺乏，会导报包括MS在内的多种神经退行性疾病的发展[37]。PI是细胞膜磷脂的一种，在体内的作用主要通过其磷酸化产物如磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）发挥作用，同时PI也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的底物。PIP3是Akt激酶的活化子，是PI通过PI3K信号通路生成的。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的主要免疫细胞，负责多发性硬化症（MS）的病理性炎症脱髓鞘。相关研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的小胶质细胞自噬激活，可以抑制小胶质细胞的炎症反应，减轻EAE的症状[38]。
ALS是一组以运动神经元损伤和各种肌肉功能丧失为特征的异质性进行性神经退行性疾病，血脂异常常见于ALS。一项队列研究表明，经过长期的随访，较高水平的TG与ALS发病风险增加有关[39]。Katherine等[40]对ALS患者血清的脂质组学进行分析，发现与健康组相比，TG的富集程度显著升高，并且随着ALS疾病的进展，容易发生脂质过氧化，增加有毒脂质产物的形成。Wagey等[41]研究发现，与健康对照组相比，死于ALS的患者脊髓组织颗粒部分中PI3K的活性和蛋白水平升高。相关研究表明，VAPB/ALS8蛋白突变可引起ALS，通过减少与VAPB相关的PI4P增加，可以减缓多种ALS中的运动神经元缺陷、神经退行性变或神经突延伸减少[42]。Arima等[43]通过动物实验，分析ALS小鼠模型发现，ALS小鼠的脊髓中PC水平显著降低，反映了运动神经元的损害与丧失。ALS中存在Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）的基因突变，Ikeda等[44]发现，对ALS小鼠注射PC结合的Cu/ZnSOD减缓了运动功能障碍的进展，防止了去神经支配肌肉萎缩，并延缓了小鼠脊髓运动神经元的退化，其作用机制与氧化应激有关。
由于全球人口老龄化导致NDD发病率和死亡率的不断升高，近年来对于NDD的治疗一直是医疗领域的热点问题。BBB作为血液和脑组织之间的动态界面，选择性地限制包括治疗剂在内的物质的通过，这导致病变区域的药物浓度较低，对有效治疗脑部疾病提出了挑战。相关研究表明，用各种配体修饰的脂质体在穿透血脑屏障和靶向与不同疾病相关的病变方面表现出显著优势[45,46]。配体修饰的脂质体作为载体递送在治疗多种NDD中发挥着至关重要的作用，如阿尔茨海默病、帕金森等[47]。本研究的双向MR结果显示，一些脂质体可以作为NDD治疗的载体，将治疗药物封装在其中，不仅可以提高药物浓度，而且能够穿越BBB的阻碍，并最终实现疾病的有效治疗[48]。当然对于NDD来说，由于发病机制尚不明确，病变区域的结构和功能复杂，脂质体递送系统在实现靶向大脑方面面临挑战，需要更深入的研究才能有效治疗[49]。
本研究的优点是通过双向两样本MR分析来研究179种脂质体与多种NDD之间的因果关系，这是对脂质体与NDD之间相关性的最全面的研究。MR分析利用SNPs作为IVs来推断因果关系，可以有效克服反向因果关系和混杂引起的偏差。同时，为了保证MR分析的准确性，我们进行了敏感性检验。我们选取的暴露因素和结局的数据来源于不同国家的欧洲人群，以避免不必要的偏倚。当然，这项研究的局限性也不容忽视。首先，尽管我们采取了控制措施，但工具变量可能仍然具有无法衡量的混淆并影响结果。其次，MR建立在暴露与结局间线性关系成立的假设下，不讨论一切非线性关系，故不普遍适用；同时，由于缺乏按年龄和性别分类的汇总级数据，本研究无法基于这些因素对不同NDD进行分层分析；最后，本研究纳入了欧洲血统的人群，可能会限制研究结果在其他族裔人群中的应用。
综上所述，本研究对179种和多种NDD之间进行了双向MR分析，结果显示甾醇酯、胆固醇、PC、PE、PI、DAG、SM、TG和不同的NDD之间存在因果联系，然而该结果还需要进一步的实验验证，并在此基础上开展深入的分子机制挖掘，为NDD的早期筛查与可能的药物靶点发现提供了基础。
