目的 構(gòu)建nesprin蛋白siRNA慢病毒載體（LV-siNesprin），感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），觀察nesprin蛋白對(duì)MSCs的影響。 方法 針對(duì)nesprin靶基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)miRNA oligo，并將4對(duì)oligo退火成雙鏈DNA，測(cè)序鑒定。將4種miRNA干擾質(zhì)粒（SR-1、SR-2、SR-3、SR-4）轉(zhuǎn)入大鼠血管平滑肌細(xì)胞，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測(cè)干擾效應(yīng)，篩選最佳干擾序列；將最佳干擾序列和pDONR221載體進(jìn)行重組反應(yīng)，獲得含干擾序列的入門載體，再將入門載體和慢病毒表達(dá)的目的載體pLenti6/V5-DEST進(jìn)行重組反應(yīng)獲得含干擾序列的LV-siNesprin＋綠色熒光蛋白（GFP），包裝慢病毒，測(cè)定病毒滴度。LV-siNesprin＋GFP轉(zhuǎn)染MSCs，Western blotting鑒定比較nesprin蛋白表達(dá)情況（分為L(zhǎng)V-siNesprin＋GFP組、GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組），用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況（分為L(zhǎng)V-siNesprin＋GFP組、GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組）?！〗Y(jié)果 測(cè)序證實(shí)合成的4對(duì)miRNA oligo正確，RT-PCR和Western blotting篩選出最佳干擾miRNA質(zhì)粒SR-3，成功構(gòu)建LV-siNesprin，包裝慢病毒，病毒懸液的活性滴度為1×106 ifu/ml。LV-siNesprin轉(zhuǎn)染MSCs后，nesprin蛋白表達(dá)明顯下降，出現(xiàn)細(xì)胞核融合、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測(cè)顯示，LV-siNesprin＋GFP組MSCs增殖速度較GFP對(duì)照組和正常細(xì)胞組減慢。 結(jié)論 Nesprin蛋白對(duì)MSCs核膜穩(wěn)定維持核膜空間結(jié)構(gòu)起作用，并利于細(xì)胞增殖更新。
引用本文： 楊文鋼,薛松,連鋒,汪永義,胡振雷,朱洪生. Nesprin蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響. 中國(guó)胸心血管外科臨床雜志, 2012, 19(4): 408-413. doi: 復(fù)制
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