目的 通過體外實驗探討hVEGF165 和hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adenoassociated virus，rAAV）體外生物學(xué)活性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別采用rAAVhVEGF165-內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實驗組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的rAAV-IRES-GFP（對照組）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，于轉(zhuǎn)染后1、2、3、7 及14 d 應(yīng)用ELISA 法及轉(zhuǎn)染后14 d 應(yīng)用Western blot 法鑒定兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)；轉(zhuǎn)染后14 d 行細(xì)胞免疫熒光染色觀察hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)一致性。應(yīng)用第3 代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）管狀血管形成實驗檢測hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行誘導(dǎo)成骨實驗，Gomori 鈣鈷法ALP 染色及茜素紅法鈣鹽染色檢測hBMP-7 蛋白活性。 結(jié)果 ELISA 檢測示隨轉(zhuǎn)染時間延長，兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)逐漸升高；實驗組各時間點hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)量均明顯高于對照組（P lt; 0.05）。Western blot 檢測示實驗組可見hVEGF165 和hBMP-7表達(dá)，對照組未見陽性表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色觀察示實驗組hVEGF165 和hBMP-7 染色呈陽性，表達(dá)部位和強度具有較好一致性；對照組未見陽性表達(dá)。HUVEC 管狀血管形成實驗示實驗組HUVEC 拉長變形、出芽且相互交聯(lián)成管狀樣結(jié)構(gòu)；與對照組相比，管狀血管數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。ALP 染色見實驗組細(xì)胞出現(xiàn)深染顆粒，對照組細(xì)胞內(nèi)淺著色；與對照組相比，礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7體外具有良好的生物學(xué)活性。
引用本文： 時志斌,樊立宏,強輝,唐一侖,王坤正,黨曉謙. hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體的體外生物學(xué)活性研究. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2010, 24(4): 415-419. doi: 復(fù)制