目的 結合熒光蛋白標記技術和激光共聚焦顯微鏡三維重建技術觀察體外構建的組織工程骨及其體內移植情況，為篩選優(yōu)良的支架材料和三維構建方法提供技術支持。 方法 取2 歲齡青山羊（體重約25 kg）髂骨骨髓，利用密度梯度離心法結合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，并通過流式細胞技術檢測表面分子CD29、CD60L、CD45和CD44 表達情況。將質粒pLEGFP-N1 擴增、提取后酶切鑒定。用脂質體轉染的方法將質粒轉染到PT67 包裝細胞，G418 篩選后擴增，獲取病毒液。根據(jù)測定的滴度轉染BMSCs，獲得綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達的BMSCs，擴增后作為種子細胞，以脫鈣骨基質作為支架材料構建組織工程骨，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察種子細胞。將構建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，利用激光共聚焦顯微鏡觀察其存活和分布情況。 結果 獲得的細胞呈成纖維細胞狀，CD29 和CD44 呈陽性表達，CD60L 和CD45 呈陰性。質粒pLEGFP-N1 用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ內切酶酶切后，凝膠電泳可見其相對分子質量約6 900 bp。將pLEGFP-N1 轉染到PT67 包裝細胞擴增后獲取病毒液。根據(jù)測定的滴度（1.3 × 106 cfu/mL）轉染BMSCs，獲得GFP 表達陽性的BMSCs 克隆。激光共聚焦顯微鏡三維立體成像技術觀察到BMSCs 在組織工程骨支架上分布、增殖和遷移。將構建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，28 d 后激光共聚焦顯微鏡觀察到GFP 陽性細胞在移植區(qū)仍存在。 結論 熒光蛋白標記技術結合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術可很好地觀察支架上和移植體內的細胞，為組織工程產物三維培養(yǎng)的立體觀察提供了可行方法。
引用本文： 侯天勇,邊巴羅布,羅飛,吳雪暉,靳慧勇,姜恒,許建中. 綠色熒光蛋白標記結合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術觀測組織工程骨的構建和體內移植. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(7): 774-778. doi: 復制
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