目的 構建攜帶人肝細胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達hHGF 的BMSCs/hHGF 細胞。 方法 從含hHGF 基因的質(zhì)粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進行Age Ⅰ酶切，產(chǎn)物定向連接，轉化后行PCR 鑒定和測序，構建hHGF 慢病毒表達質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 介導慢病毒載體三質(zhì)粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉染293T細胞。收集病毒超濾離心濃縮，實時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達，確定最佳感染復數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細胞，流式細胞儀檢測感染效率，ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達。 結果 實驗成功構建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細胞儀檢測感染效率達98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達強烈的綠色熒光。細胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子，術后5 d 達高峰，達40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達。 結論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細胞，可獲得長期穩(wěn)定的表達，并持續(xù)分泌hHGF 因子。

引用本文： 朱金海,陳燕凌. 慢病毒介導人肝細胞生長因子基因感染BMSCs 的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(8): 972-976. doi: 復制