目的 建立能穩(wěn)定分泌人內(nèi)皮抑素(hES)的基因工程細(xì)胞系，觀察內(nèi)皮抑素（ES）蛋白和hES的表達(dá)。方法 以hES重組質(zhì)粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增獲得hES基因片段，且在基因前加信號肽序列，將其定向插入真核表達(dá)載體綠色熒光蛋白（pEGFP-N1)）質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES；利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染到人胚胎腎細(xì)胞(HeK-293)細(xì)胞中, G418 篩選后得到陽性克隆hES/293，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中ES蛋白的表達(dá)；用海澡酸鈉殼聚糖(ACA)微囊包裹hES/293細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，Western blot法檢測包裹后培養(yǎng)液上清中hES的表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES經(jīng)限制性核對內(nèi)切酶HindⅢ和限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ雙酶切得到4700堿基對(bp)和600 bp 2條帶；PCR擴(kuò)增出600 bp條帶；測序結(jié)果與NCBI上序列比對軟件（BLAST）比對，同源性達(dá)到100%。pEGFP-N1-ES轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞，經(jīng)G418 篩選后獲得陽性克隆，選取篩選的10株單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行Western blot分析，在相對分子質(zhì)量為20 times;103 處出現(xiàn)蛋白條帶。在ACA微囊內(nèi)hES/293細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞團(tuán)逐漸長大，充滿整個(gè)囊內(nèi)空間。培養(yǎng)3、7、21、35 d時(shí)，在相對分子質(zhì)量為20 times;103處出現(xiàn)蛋白條帶。結(jié)論 重組pEGFP-N1-ES真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞后可有效的表達(dá)hES蛋白，并能分泌到細(xì)胞外；微囊化hES/293細(xì)胞產(chǎn)生的ES蛋白可以自由擴(kuò)散出微囊膜外，并呈持續(xù)性表達(dá)。
引用本文： 蔡善君,詹文芳,劉銳,謝兵,李紅,宿罡. 分泌人內(nèi)皮抑素的微囊化基因工程細(xì)胞系的構(gòu)建. 中華眼底病雜志, 2010, 26(4): 367-371. doi: 復(fù)制