目的 人脫細(xì)胞羊膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）含膠原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板層體等多種成分，這些成分能為細(xì)胞增殖、分化提供豐富營(yíng)養(yǎng)。研究HAAM 與脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的生物相容性，探討HAAM 復(fù)合ADSCs 構(gòu)建真皮替代物修復(fù)全層皮膚缺損的可能性。 方法 取健康4 月齡SD 大鼠30 只，雌雄不限，體重250 ～ 300 g，于腹股溝處獲取脂肪行ADSCs 體外分離、培養(yǎng)和傳代；取第3 代細(xì)胞行HE 染色及CD44、CD49d、CD34 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。應(yīng)用物理和酶消化法處理自愿捐贈(zèng)的人羊膜獲得HAAM，行HE 染色觀察細(xì)胞是否脫除干凈，掃描電鏡觀察HAAM 結(jié)構(gòu)特征。將第3 代ADSCs 以2 × 105 個(gè)/cm2 密度接種于HAAM 上皮面，體外共培養(yǎng)1 ～ 5 d 后分別行掃描電鏡和MTT 檢測(cè)，不加材料組設(shè)為對(duì)照組。將大鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只，建立背部直徑為2 cm 的全層皮膚缺損模型。A 組創(chuàng)面植入復(fù)合ADSCs 的HAAM，B 組植入單純HAAM，C 組常規(guī)包扎。術(shù)后行大體觀察，于術(shù)后1、2、4 周計(jì)算創(chuàng)面愈合率，并取創(chuàng)面皮膚行HE 染色和細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）免疫組織化學(xué)染色觀察。 結(jié)果 HE 染色示第3 代ADSCs 呈梭形，胞核為橢圓形，位于細(xì)胞中央；免疫細(xì)胞化學(xué)染色示第3 代ADSCs 表達(dá)CD44 和CD49d，不表達(dá)CD34。HAAM 行HE 染色未見(jiàn)細(xì)胞殘留；掃描電鏡下見(jiàn)HAAM兩面具有不同的三維結(jié)構(gòu)，上皮面為較致密的網(wǎng)狀纖維；基質(zhì)面為較稀疏的膠原纖維，未見(jiàn)纖維發(fā)生融合、斷裂和降解。ADSCs-HAAM 復(fù)合培養(yǎng)3 d 后掃描電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體肥大呈梭形隆起，胞膜外絨毛致密略有彎曲，胞體下方形成豐富的偽足牢固黏附于HAAM 上；培養(yǎng)1 ～ 5 d，MTT 檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。移植術(shù)后1、2、4 周，A 組創(chuàng)面愈合率均高于B、C 組，B 組高于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。HE染色示A 組創(chuàng)面愈合速度快于B、C 組；A 組CK19 表達(dá)亦明顯高于B、C 組。 結(jié)論 HAAM 復(fù)合ADSCs 構(gòu)建真皮替代物對(duì)大鼠全層皮膚損具有良好的促愈合作用。
目的 探討應(yīng)用生長(zhǎng)分化因子5（growth differentiation factor 5，GDF-5）誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）成軟骨細(xì)胞分化的可能性及效果。 方法 3 月齡清潔級(jí)健康日本大耳白兔6 只，雌雄不限，體重2 ～ 3 kg。取兔皮下脂肪4 ～ 6 mL，采用膠原酶消化離心貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)ADSCs，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。波形蛋白免疫組織化學(xué)和CD44、CD49d、CD106 免疫熒光染色鑒定ADSCs。調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 106 個(gè)/mL，分別用普通細(xì)胞培養(yǎng)液以及含0、10 、100 ng/mL GDF-5 的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；RT-PCR 檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞Col Ⅱ和蛋白多糖mRNA 的表達(dá)；免疫組織化學(xué)、阿利新藍(lán)染色、甲苯胺藍(lán)染色和Western blot 法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞Col Ⅱ和蛋白多糖表達(dá)。 結(jié)果 ADSCs 呈小圓形、梭形、多角形分布，表面抗原標(biāo)志CD44、CD49d 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD106 和波形蛋白呈陰性表達(dá)。100 ng/mL GDF-5 誘導(dǎo)的ADSCs 呈圓形或類(lèi)圓形，且細(xì)胞增殖旺盛。普通培養(yǎng)液和0、10、100 ng/mL GDF-5 成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后7 d，Col Ⅱ、蛋白多糖 mRNA 表達(dá)均呈濃度依賴(lài)性增加，除0、10 ng/mL GDF-5 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；100 ng/ mL GDF-5 誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，Col Ⅱ、蛋白多糖mRNA 以及蛋白表達(dá)達(dá)高峰，阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)染色以及Col Ⅱ免疫組織化學(xué)染色均呈陽(yáng)性。 結(jié)論 經(jīng)一定濃度的GDF-5 誘導(dǎo)的ADSCs，Col Ⅱ和蛋白多糖表達(dá)明顯增加，具有軟骨細(xì)胞的部分生物學(xué)功能。