目的通過對半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）大、小亞基的重組，構(gòu)建pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達質(zhì)粒,并探討rCaspase3基因誘導細胞凋亡的可能性，以尋求腫瘤基因治療的新途徑。方法采用分子生物學方法克隆Caspase3的大、小亞基，并在體外進行重新排列組合，使大、小亞基原來的排序顛倒，構(gòu)建出pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達質(zhì)粒； 脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞PCⅡ,RTPCR檢測rCaspase3 mRNA的表達； 流式細胞技術(shù)（FCM）檢測轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞凋亡狀況。結(jié)果Caspase3的大、小亞基被完整克隆，pcDNA3.1(+)/rCaspase3真核表達質(zhì)粒測序結(jié)果證實小亞基位于大亞基之前； RTPCR擴增出894 bp大小片段，流式細胞檢測可見明顯的凋亡峰出現(xiàn)。結(jié)論構(gòu)建的rCaspase3其mRNA可在胰腺癌細胞中表達并自催化誘導細胞凋亡，可作為胰腺癌基因治療的目的基因。
目的 構(gòu)建肝細胞肝癌特異性表達反向半胱氨酸蛋白酶3（r-Caspase-3）重組腺病毒，為肝細胞肝癌的基因治療提供新策略。方法 構(gòu)建甲胎蛋白（AFP）增強子和白蛋白 (ALB) 啟動子腺病毒載體（pAdTrack-EAFP-PALB），然后將目的基因r-Caspase-3亞克隆到載體pAdTrack-EAFP-PALB上， 獲得重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后與pAdEasy-1同源重組，獲得重組腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3； 鑒定正確的pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293 細胞進行包裝、擴增，獲得病毒。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)監(jiān)測病毒滴度和感染效率； RT-PCR和Western blot 法檢測r-Caspase-3在HepG2細胞中的表達； SRB染色法評估重組腺病毒對HepG2細胞的抑制作用，初步觀察HepG2細胞凋亡狀況。結(jié)果 穿梭載體pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、測序正確。穿梭載體、pAdEasy-1載體同源重組后PCR 及PacⅠ酶切鑒定結(jié)果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重組成功； 經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 轉(zhuǎn)染AD293 細胞即可觀察到GFP 的表達； 回收病毒可重復感染AD293 細胞，RT-PCR和Western blot 均可檢測到r-Caspase-3的表達，證實Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒顆粒包裝成功； SRB染色檢測發(fā)現(xiàn)Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡誘導特異性。結(jié)論 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重組腺病毒構(gòu)建成功，并具有凋亡誘導靶向性，為進一步研究靶向性r-Caspase-3基因治療肝細胞肝癌及其生物學功能奠定了基礎(chǔ)。