目的 總結(jié)異種移植的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展。方法 復(fù)習(xí)國(guó)內(nèi)外關(guān)于異種移植研究的相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行綜述。結(jié)果 超急性異種排斥反應(yīng)是異種移植面臨的巨大問題，器官或組織的供體經(jīng)過基因修飾后，在一定程度上可以減輕超急性異種排斥反應(yīng)。由于不同的器官具有不同的特性，目前異種器官移植移植物的存活時(shí)間存在較大差異。結(jié)論 通過對(duì)相關(guān)異種移植實(shí)驗(yàn)研究的分析，可以全面地了解異種移植的研究背景，為異種移植提供合適的研究方向。將經(jīng)基因修飾的動(dòng)物作為異種器官或組織的供體，有望使移植物避免或減輕超急性異種排斥反應(yīng)。
目的 建立生長(zhǎng)激素促分泌素受體(ghrelin receptor，GHS-R)基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）雜合子模型，為研究GHS-R基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法 用TK-neo置換原X-pPNT載體的PGK-neo構(gòu)建目標(biāo)載體。以小鼠基因組DNA為模板, 用PCR方法擴(kuò)增2條同源臂，將其按照一定方向裝入含有TK-neo的X-pPNT載體，并測(cè)序鑒定。載體線性化及純化后電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，用G418和更昔洛韋(Gancyclovir)對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染后的ES細(xì)胞進(jìn)行正、負(fù)篩選培養(yǎng)，得到雙藥抗性ES細(xì)胞，克隆后抽提基因組DNA，分別用PCR方法鑒定2條同源臂，并測(cè)序確定成功同源重組的ES細(xì)胞克隆。結(jié)果 改建X-pPNT載體成功，PCR獲得2條同源臂片段，測(cè)序正確，并按一定方向裝入打靶載體，ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)雙藥篩選得到328個(gè)陽性ES細(xì)胞克隆，PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)3個(gè)克隆發(fā)生同源重組。結(jié)論 本研究成功獲得了GHS-R(－/+)雜合子小鼠ES細(xì)胞克隆，為進(jìn)一步通過顯微注射及雜交育種獲得GHS-R基因敲除小鼠打下了基礎(chǔ)。
目的 探討在低血清胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）水平與正常IGF-1水平的小鼠乳腺癌模型中應(yīng)用血管生長(zhǎng)抑制劑人參皂甙（GS）Rg3后，IGF-1對(duì)血管生成的影響。方法 應(yīng)用7，12-二甲基苯蒽（DMBA）誘導(dǎo)肝臟特異性IGF-1基因敲除鼠（LID鼠）及對(duì)照鼠建立原發(fā)乳腺癌模型，應(yīng)用GS Rg3進(jìn)行干預(yù)治療，利用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和Ⅷ因子相關(guān)抗原（F8-RAg）表達(dá)水平，同時(shí)利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠乳腺癌及正常乳腺組織中相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果 LID鼠乳腺癌的發(fā)生率低于對(duì)照鼠(P＜0.05)； LID鼠乳腺癌組織中VEGF表達(dá)水平與微血管密度均低于對(duì)照組(P＜0.05)。LID鼠乳腺癌組織中IGF-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1基因較對(duì)照組上調(diào)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)-2、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)-A和PDGF-B基因較對(duì)照組下調(diào)； 應(yīng)用GS Rg3后，LID鼠乳腺癌組織中VEGFa、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、PDGF-A和FGFR-2基因較對(duì)照組上調(diào)，而IGF-1和TGF-β1基因較對(duì)照組下調(diào)。結(jié)論 IGF-1促進(jìn)小鼠乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，且與血管生長(zhǎng)密切相關(guān)。血管生長(zhǎng)抑制劑可能通過IGF-1及TGF-β1發(fā)揮抗腫瘤作用。
腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）與肝癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。然而這方面的研究大都是基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或小鼠移植瘤模型開展的。本文介紹一個(gè)運(yùn)用白蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) Cre（Alb-Cre）轉(zhuǎn)基因，通過基因重組技術(shù)成功構(gòu)建基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，肝臟特異表達(dá)的 Cre 重組酶在轉(zhuǎn)基因小鼠中實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟 AMPKα1 特異性高效敲除。肝臟 AMPKα1 敲除后不影響小鼠的生長(zhǎng)、繁殖及肝臟的結(jié)構(gòu)。肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型的成功構(gòu)建，為實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物整體水平對(duì) AMPK 與肝臟代謝或肝癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系等方面的研究提供了基礎(chǔ)。
目的觀察視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞條件性基因敲除血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變（OIR）小鼠的影響。方法應(yīng)用Cre-Loxp重組酶技術(shù)建立Müller細(xì)胞條件性基因敲除VEGF小鼠。Cre陽性為敲除VEGF（CKO）小鼠，Cre陰性為未敲除VEGF（NKO）小鼠。CKO小鼠（CKO組）、NKO小鼠（NKO組）各取20只建立OIR模型，觀察兩組小鼠在建模過程中的死亡率。小鼠17日齡時(shí)，行熒光血管造影視網(wǎng)膜鋪片觀察小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)，計(jì)算無血管區(qū)面積占全視網(wǎng)膜面積的百分比；行視網(wǎng)膜石蠟切片蘇木精伊紅染色計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)；免疫熒光組織化學(xué)染色觀察小鼠視網(wǎng)膜中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)。結(jié)果OIR建模過程中，CKO組、NKO組小鼠總死亡率分別為65.00%、30.00%；兩組小鼠總死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=4.912，P=0.027）。CKO組小鼠視網(wǎng)膜正常血管化推遲，可見大片無血管區(qū)，新生血管叢少見，整個(gè)視網(wǎng)膜單薄、無層次感；NKO組小鼠視網(wǎng)膜正常血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可見范圍較大，血管密度較高，新生血管叢多見，熒光素滲漏較明顯。CKO組、NKO組小鼠視網(wǎng)膜無血管區(qū)面積占全視網(wǎng)膜面積的百分比分別為（28.31±11.15）%、（16.82±7.23）%；兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.734，P=0.014）。CKO組、NKO組小鼠平均每張切片突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)分別為（26.10±6.37）、（28.80±7.59）個(gè)；兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.437，P=0.016）。CKO組、NKO組小鼠視網(wǎng)膜均可見HIF-1α呈陽性表達(dá)，主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和光感受器細(xì)胞層；CKO組小鼠視網(wǎng)膜HIF-1α陽性表達(dá)強(qiáng)于NKO組。結(jié)論Müller細(xì)胞條件性基因敲除VEGF明顯減弱新生小鼠在OIR環(huán)境中的生存能力，抑制部分視網(wǎng)膜新生血管的同時(shí)推遲了視網(wǎng)膜正常血管化。
目的 利用 Red 同源重組的方法構(gòu)建大腸桿菌外膜蛋白 A （outer membrane protein-A，OmpA）基因缺失株，為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。 方法 以已知大腸桿菌 OmpA 為靶點(diǎn)在其兩端設(shè)計(jì)同源臂引物，以質(zhì)粒 pKD3 為模板利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增出氯霉素篩選標(biāo)記序列，然后采用 Red 重組技術(shù)利用質(zhì)粒 pKD46 誘導(dǎo)表達(dá)的重組酶通過電擊的方法把外源構(gòu)建打靶片段導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建大腸桿菌 OmpA 基因缺失突變株。以菌落 PCR 方法檢測(cè)基因大小，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，以重組菌株培養(yǎng)過程的吸光度（A600 ）值來反映重組子的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了大腸桿菌 OmpA 基因缺失突變株，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定，發(fā)現(xiàn) OmpA 基因成功完全丟失，突變株的生長(zhǎng)曲線與野生型的差異不顯著。 結(jié)論 OmpA 基因缺失對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)無顯著影響，為進(jìn)一步研究疫苗活載體提供了一定基礎(chǔ)。
規(guī)律性短重復(fù)回文序列簇（CRISPR）和 CRISPR 輔助蛋白 9（Cas9）構(gòu)成的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)快速推進(jìn)了基因修飾豬作為醫(yī)學(xué)研究模式動(dòng)物的廣泛應(yīng)用。而高效的靶基因單鏈向?qū)?RNA（sgRNA）是利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因編輯成功的關(guān)鍵，對(duì)于豬等繁殖周期較長(zhǎng)的大動(dòng)物，則需要在實(shí)施動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，在體外篩選出高效的 sgRNA 以避免時(shí)間和資源成本浪費(fèi)。另外，如何高效獲得陽性基因編輯單克隆細(xì)胞是目前尚待解決的難題。本研究建立了靶向豬基因組的 sgRNA 快速篩選方法，利用熒光載體富集基因編輯細(xì)胞，同時(shí)探索利用圖案微陣列培養(yǎng)技術(shù)快速獲得單克隆細(xì)胞的方法，在此基礎(chǔ)上高效獲得延胡索酰乙酰乙酸酶（Fah）基因編輯細(xì)胞，為后續(xù)生產(chǎn)作為人類肝細(xì)胞生物反應(yīng)器的Fah基因敲除豬奠定基礎(chǔ)。
目的探索 GGTA1 基因敲除豬胰島細(xì)胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果。方法本研究采用 GGTA1 基因敲除新生豬胰島細(xì)胞開展了 3 例豬-猴異種胰島移植實(shí)驗(yàn)。結(jié)果3 只獼猴成功進(jìn)行胰島細(xì)胞移植治療，術(shù)后生命體征平穩(wěn)，未發(fā)生靜脈栓塞癥狀。移植后血糖和外源胰島素用量均顯著降低，能檢測(cè)到特異性豬 C 肽。移植后 3 只獼猴均發(fā)生了酮癥酸中毒癥狀，1 只獼猴發(fā)生傷口感染，經(jīng)對(duì)癥處理后均健康存活達(dá) 16 周。結(jié)論GGTA1 基因敲除新生豬胰島細(xì)胞經(jīng)肝門靜脈移植治療 1 型糖尿病的方法是有效的。