目的 探討玻璃化凍存組織工程肌腱植入大鼠體內(nèi)修復(fù)跟腱缺損后不同時(shí)期,大鼠的免疫排斥反應(yīng)及對(duì)肝、腎、心血管功能的影響。 方法 抽取1 周齡SD 大鼠尾腱,采用組織塊法培養(yǎng)肌腱細(xì)胞。取第2 ~ 4 代肌腱細(xì)胞,以5 × 106 個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種至長1.5 cm 生物衍生肌腱材料,復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程肌腱。采用21%DMSO 作為玻璃化凍存保護(hù)液,Eurocollins solution 作為4℃條件下預(yù)冷液和洗脫液的基礎(chǔ)液體,按自制的玻璃化凍存方法凍存。健康SD大鼠72 只,雌雄不限,體重210 ~ 230 g。隨機(jī)分成A(n=32)、B(n=32)、C(n=8)3 組。A、B 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于跟腱中段制備長約0.5 cm 肌腱缺損模型,分別將玻璃化凍存后及未凍存的組織工程肌腱移植修復(fù)缺損肌腱;C 組大鼠未手術(shù),為正常對(duì)照。術(shù)后2、4、6、8 周,行大體觀察、肝、腎及心血管功能檢測;術(shù)后2、4、6 周行血清免疫學(xué)檢測。 結(jié) 果 A、B 組植入部位均未見組織壞死、積液及化膿感染;術(shù)后2 周,A、B 組均出現(xiàn)粘連現(xiàn)象,4 ~ 6 周逐漸好轉(zhuǎn),8 周未見明顯粘連,新生組織連續(xù)性完整,肌腱橋接部已愈合,與正常肌腱類似。術(shù)后2、4、6 周,血清中IgG 和IgM 含量A、B、C 組組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。肝功能檢測:A 組術(shù)后4 周,B 組術(shù)后4、6 周,谷草轉(zhuǎn)氨酶均低于C 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);其余各時(shí)間點(diǎn)A、B 組谷草轉(zhuǎn)氨酶與C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。各時(shí)間點(diǎn)A、B 組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、ALP、直接膽紅素和總膽紅素與C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。腎功能檢測:術(shù)后2 周,A 組血清白蛋白和B 組肌酐明顯下降,與C 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);術(shù)后4、6、8 周,A、B 組各指標(biāo)濃度與C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。心血管功能檢測:A 組各時(shí)間點(diǎn)血糖、甘油三酯、膽固醇與C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);B 組術(shù)后8 周甘油三酯與C 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 玻璃化凍存的組織工程肌腱植入大鼠體內(nèi)修復(fù)跟腱缺損,未引起明顯免疫排斥反應(yīng),對(duì)肝、腎及心血管功能無明顯影響。
目的 研究大鼠BMSCs 與小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)復(fù)合后,施加動(dòng)態(tài)應(yīng)變刺激能否使BMSCs 在體外分化為肌腱細(xì)胞(tenocytes,TCs)。 方法 取1 周齡SD 大鼠骨髓,采用貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,并用多向分化誘導(dǎo)法和流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行鑒定。用生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)行SIS 的拉伸破壞實(shí)驗(yàn),計(jì)算SIS 的彈性應(yīng)變。將分離純化后的第2 代BMSCs 以2.5 × 105 個(gè)/cm2 細(xì)胞密度種植于3 cm × 1 cm 大小的SIS 上,形成BMSCs-SIS復(fù)合物,固定于應(yīng)變培養(yǎng)裝置對(duì)其進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)2 d 后,施加應(yīng)變刺激(拉伸頻率為0.02 Hz,作用時(shí)間為15 min/h、12 h/d,應(yīng)變幅度為5%)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5 d,作為實(shí)驗(yàn)組;BMSCs-SIS 復(fù)合物持續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)作為對(duì)照組;采用組織塊法分離培養(yǎng)SD 大鼠鼠尾TCs,用第2 代TCs 與SIS 復(fù)合,相同條件下靜態(tài)培養(yǎng)作為陽性對(duì)照組。掃描電鏡觀察應(yīng)變培養(yǎng)后BMSCs 形態(tài)變化,ELISA 法檢測培養(yǎng)后細(xì)胞上清液中2 種TCs 標(biāo)志蛋白Scleraxis 和Tenomodulin 的含量。 結(jié)果 分離培養(yǎng)的SD 大鼠BMSCs 經(jīng)多向分化誘導(dǎo)后,可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,且流式細(xì)胞儀檢測示表面標(biāo)志抗原CD34、CD45 為陰性,CD90 為陽性,符合BMSCs 生物學(xué)特性。SIS 拉伸破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SIS 平均彈性應(yīng)變?yōu)?9.5%。掃描電鏡觀察示實(shí)驗(yàn)組材料上細(xì)胞具有類TCs 形態(tài);ELISA 法檢測示,實(shí)驗(yàn)組應(yīng)變培養(yǎng)后細(xì)胞上清液中Scleraxis 和Tenomodulin 含量分別為(3.56 ± 0.91)μmol/L 和(4.27 ± 1.10)μmol/L,陽性對(duì)照組分別為(14.73 ± 2.30)μmol/L 和(10.65 ± 1.51)μmol/L,對(duì)照組分別為(0.23 ± 0.14)μmol/L 和(0.16 ± 0.10)μmol/L;3 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 適當(dāng)?shù)膽?yīng)變刺激培養(yǎng)可在體外誘導(dǎo)BMSCs 向TCs 方向分化,尚需進(jìn)一步研究最佳的應(yīng)變刺激誘導(dǎo)條件。