【摘 要】 目的 構(gòu)建NEP1-40（Nogo extra cellular peptide residues 1-40）基因慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞奠定基礎(chǔ)，并實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中高效、穩(wěn)定表達(dá)。 方法 從含有 NEP1-40 基因的 cDNA 文庫(kù)中，利用PCR 方法釣取NEP1-40 基因編碼區(qū)片段。將目的基因與酶切線性化的載體pGC-FU 進(jìn)行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行菌落PCR 鑒定，再對(duì)PCR 鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒和兩種輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，包裝成慢病毒，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光表達(dá)情況，采用Western blot 檢測(cè)NEP1-40 及綠色熒光蛋白融合蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明成功獲取NEP1-40 基因cDNA 克隆，測(cè)序提示慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒連接構(gòu)建正確；熒光表達(dá)檢測(cè)顯示293T 細(xì)胞中產(chǎn)生慢病毒顆粒；Western blot 顯示NEP1-40 在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。 結(jié)論 成功構(gòu)建NEP1-40 基因慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后從分子水平探討NEP1-40 基因功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。