目的 椎間盤(pán)退行性變的生物學(xué)治療方法是骨科學(xué)研究熱點(diǎn)，尋找一種有效誘導(dǎo)BMSCs 向椎間盤(pán)細(xì)胞分化的方法成為應(yīng)用細(xì)胞移植治療椎間盤(pán)退變的必要前提。探討重組質(zhì)粒 pcDNA3.1IE-SOX9Flag 體外轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)兔BMSCs 向類髓核細(xì)胞分化的影響。 方法 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。取1 月齡新西蘭大白兔骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，體外誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化并鑒定；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。將第3 代BMSCs 隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-SOX9Flag 重組質(zhì)粒，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag 轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，72 h 后加入濃度為500 mg/L 的G418 篩選7 d 后，改為濃度200 mg/L 的G418 維持篩選壓力并培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。取各組BMSCs 采用RT-PCR 檢測(cè)SOX9和Ⅱ型膠原基因（Col2al）的mRNA 表達(dá)，Western blot 檢測(cè)SOX9 蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅱ型膠原的表達(dá)。 結(jié)果 BMSCs 成骨誘導(dǎo)7 d 后ALP 染色呈陽(yáng)性；CD44 表達(dá)陽(yáng)性，CD34 和CD45 表達(dá)陰性。成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs，72 h 后轉(zhuǎn)染效率為34.32% ± 1.75%；轉(zhuǎn)染2 周后BMSCs 形態(tài)改變，呈多角形或橢圓形，細(xì)胞體積增大，增殖速度減緩，與椎間盤(pán)髓核細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)十分接近。RT-PCR 鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SOX9 mRNA 和Col2al mRNA 表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組均為陰性。Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組SOX9 基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)。轉(zhuǎn)染組BMSCs 的Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性。 結(jié)論 SOX9 基因真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染兔BMSCs，被轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化，為進(jìn)一步研究應(yīng)用BMSCs 移植治療椎間盤(pán)退行性變奠定了理論基礎(chǔ)。
目的 髓核細(xì)胞衰老凋亡是椎間盤(pán)退行性變的病理基礎(chǔ)，探討髓核細(xì)胞表型分子及延緩髓核細(xì)胞衰老退變的機(jī)制。 方法 原代培養(yǎng)8 ～ 10 周齡雄性SD 大鼠髓核細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定髓核細(xì)胞表型分子低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、HIF-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）及Ⅱ型膠原表達(dá)。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞沉默p53、p21 后行RT-PCR 及Western blot檢測(cè)沉默效率，siRNA 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞衰老相關(guān)β 半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal）染色檢測(cè)髓核細(xì)胞衰老變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)髓核細(xì)胞周期變化，MTT 法生長(zhǎng)曲線分析髓核細(xì)胞增殖變化。 結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示髓核細(xì)胞表達(dá)HIF-1α、HIF-1β、MMP-2 及Ⅱ型膠原。第35 代髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53、p21 siRNA 后RT-PCR 及Western blot 檢測(cè)示p53、p21 表達(dá)明顯受到抑制。第35 代髓核細(xì)胞SA-β-gal 染色陽(yáng)性率明顯高于第1 代髓核細(xì)胞（P lt; 0.001）；正常第35 代髓核細(xì)胞經(jīng)p53 siRNA（p53 轉(zhuǎn)染組）和p21 siRNA（p21 轉(zhuǎn)染組）轉(zhuǎn)染后，SA-β-gal 陽(yáng)性率明顯低于正常第35 代髓核細(xì)胞（正常組）和加入脂質(zhì)體LipofectaminTM 2000 而無(wú)siRNA 的第35 代髓核細(xì)胞（陰性對(duì)照組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.001）。細(xì)胞周期分析顯示，p53 轉(zhuǎn)染組及p21 轉(zhuǎn)染組G1 期百分比均明顯低于正常組和陰性對(duì)照組（P lt; 0.05），S 期百分比明顯高于正常組和陰性對(duì)照組（P lt; 0.05）。MTT 生長(zhǎng)曲線顯示轉(zhuǎn)染p53、p21 siRNA 后可促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖。 結(jié)論 沉默p53、p21 基因可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而抑制髓核細(xì)胞衰老退變，改善椎間盤(pán)退變過(guò)程；沉默p53、p21基因可能是潛在的治療椎間盤(pán)退行性變的方法。