目的 探討應用多孔高密度聚乙烯（Medpor）作為再造耳支架對先天性小耳或后天耳廓缺失患者進行再造的可行性。 方法 1999年2月～2004年2月收治61例耳廓缺失患者，男38例，女23例；年齡5～61歲。先天性小耳40例，其中雙側1例，單側39例；外傷后耳廓缺損21例，其中雙側6例，單側15例。應用耳后軟組織擴張法，以Medpor為支架行耳廓再造術。手術分二期，一期為耳后皮膚軟組織擴張器置入術；二期為耳廓再造術。以耳后擴張皮瓣或擴張的耳后瘢痕瓣和乳突區(qū)皮下組織筋膜瓣包裹Medpor支架，再造耳廓。 結果 61例耳廓再造術患者均痊愈出院，獲隨訪6個月～5年1個月，平均2.8年。其中49例（80.3%）患者對手術結果滿意，7例（11.5％）認為再造耳手術效果尚可，3例（4.9%）發(fā)生了支架外露，對手術效果不滿意，2例（3.3%）于術后6個月行自體肋軟骨移植，置換Medpor支架。 結論 擴張法耳廓再造術中，對不適合、不能或不愿取用自體肋軟骨作為再造耳支架的患者，應用Medpor耳支架，是一種較為安全、簡便及可行的方法。
對半面萎縮的治療采用改良自體脂肪顆粒移植技術，提 高脂肪成活率，減少術后脂肪液化、壞死、吸收等并發(fā)癥。方法 1999 年3月～2004年10月，治療31例穩(wěn)定期半面萎縮患者。男12例，女19例；年齡19～28歲,平均 23５歲。根據(jù)半面萎縮范圍不同分成3型，輕度萎縮9例，中度萎縮19例，重度萎縮3例。 根據(jù)以往研究結果和文獻的總結分析，在脂肪的獲取和移植上，采用低位供區(qū)、低壓抽取、 低速離心和多點、多隧道、多層面放射狀注射移植。經(jīng)術前、術后正位、側位45°及90°照 片比較，以及術后表情是否自然，局部有無硬塊和囊腫，患者感覺舒適度等評價標準，并根 據(jù)隨訪結果決定是否需再次手術。結果術后31例均達到面部外形基本 對稱。1次注射15例，2次13例，3次3例。第3次注射后較第2次效果好，第2次注射比第1次效果好，且注射量逐次減少。下頜部注射量8~14 ml，平均11 ml；頰部注射量15~25 ml， 平均20 ml；顴部注射5~10ml，平均75 ml；額部注射量18~20 ml，平均19 ml?；颊唠S 訪3～5年，未發(fā)現(xiàn)感染、硬結、皮下包塊、囊腫或其他并發(fā)癥?；紓绕つw色素增生明顯減輕。與傳統(tǒng)治療方法比較，自體脂肪顆粒注射移植治療能達滿意面 部對稱，且無供區(qū)損傷及受區(qū)并發(fā)癥，是治療半面萎縮一種較理想的手術方法。
目的 觀察家豬骨髓間充質(zhì)干細胞 (marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 在體外誘導條件下成骨分化的特征及相關基因的表達。方法 選取3月齡雌性長白豬6頭，無菌條件下于脛骨近端抽取骨髓15 ml。采用密度梯度離心法并根據(jù)細胞貼壁特性對MSCs進行分離、純化，倒置相差顯微鏡觀察原代細胞生長情況，于培養(yǎng)第7天計算MSCs百分比含量及群體倍增值。將第1代細胞置于含1×10-8 mmol/L 地塞米松(dexamethasone, Dex)、10 mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate, β-GP)和82 μg/ml 抗壞血酸(ascorbic acid, Asc)的成骨誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d，作為實驗組；DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)作為對照組。分別行細胞形態(tài)學觀察、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)組織化學染色、鈣沉積和細胞增殖測定，采用實時定量PCR分析成骨分化的相關基因表達。結果 原代MSCs特征：培養(yǎng)第1天，有核細胞大部分由懸浮的圓形血源性細胞組成；第3天換液棄除非貼壁細胞，MSCs克隆開始形成，細胞呈成纖維細胞樣生長；第7天，鏡下觀察到大小不一的克隆。細胞在培養(yǎng)后12～14 d基本長滿，原代細胞群體倍增值平均為13。MSCs成骨分化：誘導培養(yǎng)14 d實驗組細胞形態(tài)由成纖維細胞樣變成立方體樣，而對照組細胞始終保持成纖維細胞樣。培養(yǎng)5 d，對照組細胞計數(shù)為11 723±4 040，實驗組為10 276±5 513，二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，實驗組誘導培養(yǎng)14 d，ALP染色呈強陽性，21 d鈣沉積明顯增加 (P＜0.01)。實驗組MSCs成骨相關基因：核心結合因子α1 (core binding factor α1, Cbfα1)、osterix、ALP、Ⅰ型膠原、骨連接素(osteonectin, ON)、骨鈣素(osteocalcin, OC)表達逐漸增強；Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明顯；與第7天比較，第21天osterix和OC基因表達明顯上調(diào) (P＜0.05)；第14天，Ⅰ型膠原表達也上調(diào) (P＜0.05)。結論 密度梯度離心法分離的豬MSCs，在體外誘導條件下能通過上調(diào)分化特異基因表達向成骨細胞分化。
目的 探討缺氧缺血性腦損傷(hypoxia ischemia brain damage, HIBD)時缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α, HIF 1α）表達與神經(jīng)元凋亡的相關性，探索HIF-1α在神經(jīng)元凋亡中的作用及對損傷神經(jīng)修復重建的意義。方法 新生10 d SD大鼠40只，隨機分為對照組和實驗組，每組20只。實驗組在乙醚麻醉下行右側頸總動脈結扎，氮氧混合氣（92%氮氣、8%氧氣 ）缺氧2.5h，即為HIBD模型；對照組分離頸總動脈，不結扎，不作缺氧處理。分別于術后4、8、24、48及72h處死兩組動物取腦組織，應用免疫組織化學法檢測HIF-1α、活化的半胱天冬氨酸酶3（cleaved caspase 3，CC3）的表達，應用TUNEL檢測凋亡細胞。結果 實驗組HIF-1α蛋白表達在術后4h明顯升高，8 h達高峰，24h后下降；CC3蛋白于術后4 h開始表達，8 h有少量表達，24h明顯升高，48h及72h維持較高 水平。對照組各時間點HIF-1α和CC3均有極少量弱陽性表達。實驗組HIF-1α和CC3蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。TUNEL染色顯示實驗組術后隨時間延長陽性細胞數(shù)逐漸增多，72h達高峰；但對照組TUNEL陽性細胞極少。兩組比較差 異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結論 HIF-1α與促凋亡蛋白CC3表 達趨勢相反， HIF-1α對新生兒HIBD神經(jīng)元可能具有保護作用，可望對缺氧缺血神經(jīng)的修復重建發(fā)揮一定作用。
目的 探討體外快速培養(yǎng)犬膀胱平滑肌細胞的方法及觀察膀胱 平滑肌細胞在脫細胞小腸黏膜下層（small intestinal submucosa, SIS）上的生長狀況， 為構建組織工程膀胱平滑肌組織提供實驗依據(jù)。方法 分別采用酶消化 法和組織塊培養(yǎng)法分離、獲取和原代培養(yǎng)犬膀胱平滑肌細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的 生長情況，透射電鏡觀察細胞的超微結構，免疫組織化學染色進行細胞鑒定。將犬膀胱平滑 肌細胞接種到SIS支架材料上，于復合培養(yǎng)5、7及9d 取材，行蘇木素染色、石蠟切片HE 染色和掃描電鏡觀察膀胱平滑肌細胞在SIS上的生長狀況。以細胞SIS復合培養(yǎng)組為實驗組 ，以膀胱平滑肌細胞為對照組，每組各設9孔，分別于接種后3、5及7d取材，酶消化后收集 細胞并計數(shù)。結果酶消化法原代培養(yǎng)獲取犬膀胱平滑肌細胞數(shù)量 多， 細胞生長速度快，形態(tài)良好，培養(yǎng)5d細胞在培養(yǎng)瓶底生長匯合。組織塊培養(yǎng)法接種3d見長 梭形的膀胱平滑肌細胞從植塊邊緣萌出，獲取的細胞數(shù)量較少。透射電鏡下見膀胱平滑肌細 胞胞質(zhì)中有特征性細肌絲和細胞膜的密斑。抗α-肌動蛋白免疫組織化學染色胞漿呈棕黃色 陽性反應。膀胱平滑肌細胞在SIS表面能黏附、生長和增殖。體外復合培養(yǎng)5d后，膀胱平滑 肌細胞鋪滿SIS表面，呈單層細胞結構。7、9d細胞形態(tài)與5d相似。實驗組3、5及7d的細 胞計數(shù)分別為（16.85±0.79）×105、（39.74±2.16）×105及（37.15±2.02）×10 5個，對照組分別為（19.43±0.54）×105、（34.50±1.85）×105及（33.07±1.31 ）×105個。兩組5d細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 酶消化法原代培養(yǎng)膀胱平滑肌細胞可提供大量活性良好的種子細胞。SIS支持膀胱平滑 肌細胞黏附和生長，可為構建組織工程膀胱平滑肌組織提供良好支架。
目的 探索自體全層皮膚移植成活過程中表皮干細胞隨微環(huán)境的改變而變化的規(guī)律，為表皮干細胞的臨床應用提供理論依據(jù)。方法Wistar大鼠42只，于背部制作1.5 cm×1.5 cm自體全層皮膚原位移植模型。按取材時間點隨機分成7組（G1～G7組）,每組6只，分別為術后第1、3、5、7、14、21和30天；各組術前取材作對照。在各時間點大體觀察移植皮片情況；于手術前、后各時間點切取皮片組織標本，行HE染色和免疫組織化學染色，觀察組織學變化及整合素β1和基因物質(zhì)p63陽性細胞變化。結果 術后第3天，G5、G6組各有1只動物移植皮片周圍感染，其他各組移植皮片均成活良好。G1~G4組細胞水腫，炎性細胞浸潤，纖維細胞逐漸增多，G5~G7組上皮化程度越來越高，纖維細胞含量越來越少。各組整合素β-1陽性細胞率低于基因物質(zhì)p63，但隨觀察時間延長變化規(guī)律相似。陽性細胞在移植皮片中的排列結構紊亂，分布到表皮各層，從G6組開始逐漸集中于表皮的基底層和毛囊隆突部，但在表皮的其他各層仍然有陽性細胞。G1組陽性細胞率開始逐漸減少，G2組達到最低，然后逐漸增加，G1～G3組手術前、后比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；G4組接近術前（P＞0.05）；G6組達到最高峰后逐漸降低，G5～G7組手術前、后比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 表皮干細胞在自體全層皮片移植成活過程中，數(shù)量逐漸減少后增加,至超過正常，后又逐漸減少；在分布上開始紊亂，幾乎分布表皮各層，后又趨向正常規(guī)律性變化。
目的 研究堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子1(insulinlike growth factor 1，IGF-1)單獨或聯(lián)合作用于人胚半月板細胞，探討半月板組織工程種子細胞大量擴增最佳作用組合及濃度。方法 無菌條件下取健康婦女意外流產(chǎn)并自愿捐獻的4個月人胚半月板，體外分離、培養(yǎng)半月板纖維軟骨細胞，用Ⅱ型膠原免疫組織化學染色和Aggrecan免疫熒光染色檢測其性狀。取第3代細胞貼壁后使用血清饑餓法同步化細胞，加入IGF-1（1、10、50、100 μg/L）、TGF-β1(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/L)、bFGF(5、10、50、100、200 μg/L)作用于半月板細胞,每樣本設8個復孔和陰性對照組，分別于作用后48 h和72 h采用MTT法檢測軟骨細胞增殖情況，以確定各生長因子最佳效應濃度。同法設7個組，每組8個復孔，分別為：陰性對照組、bFGF最佳效應濃度組(50 μg/L)、TGF-β1最佳效應濃度組(5 μg/L)、IGF-1最佳效應濃度組（50 μg/L）、bFGF 和TGF-β1最佳效應濃度聯(lián)用組、bFGF和IGF-1最佳效應濃度聯(lián)用組、TGF-β1和IGF-1最佳效應濃度聯(lián)用組，48 h和72 h用MTT比色法得出吸光度（A）值并分析軟骨細胞的增殖效應。結果 第3代半月板細胞擴增前后細胞均表達Ⅱ型膠原和Aggrecan蛋白。48 h和72 h 50 μg/L IGF-1，5 μg/L TGF-β1及50 μg/L bFGF濃度組與對照組相比均具有促細胞增殖作用，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；此即為各生長因子最佳效應濃度。生長因子聯(lián)用：bFGF 50 μg/L與IGF-1 50 μg/L聯(lián)用、IGF-150 μg/L與TGF-β1 5 μg/L聯(lián)用具有協(xié)同效應，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)； bFGF 50 μg/L與TGF-β1 5 μg/L聯(lián)用無協(xié)同效應，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論 bFGF、TGF-β1、IGF-1單獨使用均可體外擴增人胚半月板細胞，最佳效應濃度聯(lián)用時bFGF/IGF-1、IGF-1/TGF-β1的擴增效果優(yōu)于各自單獨使用，可用于體外大量擴增種子細胞。
目的 探討新型多孔β磷酸三鈣（β tricalcium phosphate,β-TCP）作為骨組織工程支架材料的應用效果。方法 將兔骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs ）與β-TCP復合培養(yǎng)，實驗組于24孔培養(yǎng)板中每孔加入3 mm×3 mm×3 mm的β-TCP小塊與細胞混合培養(yǎng)，對照組單純接種細胞。培養(yǎng)后至10 d內(nèi)行倒置相差顯微鏡觀察，第6天行掃描電鏡觀察細胞生長情況并與對照組比較；復合培養(yǎng)3、6、9、12 d MTT法測定細胞增殖情況并與對照組比較以判斷其細胞相容性。通過不同濃度(100%、50%、10%、1%、0)的βTCP浸提液對細胞增殖的影響檢驗其細胞毒性。將MSCs誘導為成骨細胞，并與βTCP復合修復兔橈骨1.5 cm大段骨缺損，術后2、6、12周分別取材通過組織學、X線片和放射性核素骨掃描(emission computed tomograph, ECT)檢驗其成骨效果。結果 MSCs細胞接種后4 h可見部分細胞貼壁，12 h后完全貼壁，細胞呈多角形、梭形；8～10 d后匯成單層，實驗組細胞生長與對照組相似。第6天倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察可見細胞黏附性良好。MTT法測定示實驗組與對照組各時間點吸光度（A）值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各時間點不同濃度β-TCP的細胞毒性均為0級。組織學、X線片和ECT均顯示復合材料能夠修復兔橈骨的大段骨缺損，且體內(nèi)降解速率與骨的形成速率一致。結論新型多孔β-TCP具有獨特的三維立體結構，優(yōu)良的理化性質(zhì)，是一種良好的骨組織工程支架材料。
目的 建立人骨髓間充質(zhì)干細胞（human marrow mesenchymalstem cells ,hMSCs）體外低氧培養(yǎng)及向成骨細胞分化的生物模型，研究其生物學特征，為骨組織工程提供實驗依據(jù)。方法 采用人淋巴細胞分離液分離健康成人hMSCs，DMEM-LG（含20％胎牛血清）中培養(yǎng)，10～14 d后傳代培養(yǎng)。取第2代細胞，根據(jù)培養(yǎng)氧濃度及培養(yǎng)基類型分為4組：正常氧組（20％O.2加DMEM-LG，A組）、低氧組（1％O.2加DMEM-LG，B組）、正常氧成骨誘導組（20％O.2加條件培養(yǎng)基，C組）及低氧成骨誘導組（1％O.2加條件培養(yǎng)基，D組），通過細胞計數(shù)、細胞增殖測定（MTT法）、集落形成檢測、RT-PCR檢測、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測及茜素紅染色，研究低氧環(huán)境對hMSCs生物學行為的影響。結果 與A組相比，B組及D組中的hMSCs有較高的增殖速度，并且不受條件培養(yǎng)基的影響，比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。B組中的hMSCs生成的集落逐漸增多，A組9 d后生成的集落數(shù)基本不發(fā)生變化。D組培養(yǎng)的hMSCs 的ALP活性逐漸增高，但明顯低于C組，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。定量RT-PCR檢測，C組ALP、骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白及骨粘連蛋白mRNA表達量明顯增加（P＜0.01)。培養(yǎng)4周后，與其他3組相比，C組可見到明顯的鈣鹽沉積和染成紅色的鈣結節(jié)。結論 低氧使hMSCs增殖率增加，集落形成能力增強，抑制向成骨細胞分化。
目的 探討自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)活性多肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）體外定向誘導成骨的能力，評價BMP-2活性多肽的成骨誘導性及誘導成骨的劑量依賴性 方法取4周齡Wistar大鼠分離培養(yǎng)MSCs，傳至第3代時改用條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入濃度為300、200、100、50及0 μg/ml的BMP2活性多肽，并依次記為A、B、C、D和E組。細胞培養(yǎng)至5、10、15及20 d，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，測定鈣含量，采用實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)檢測Ⅰ型膠原、骨橋蛋白 (osteopontin，OPN) 及骨鈣素（osteocalcin，OCN） mRNA的表達，檢測不同濃度BMP2活性多肽體外誘導成骨的能力。結果 倒置相差顯微鏡下觀察，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，培養(yǎng)細胞由長梭形轉變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?。隨條件培養(yǎng)基中BMP-2活性多肽濃度的增加，細胞發(fā)生成骨樣改變的時間提前。ALP活性和鈣含量檢測顯示，A組和B組較其他組增加明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A、B組間比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。FQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度條件培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，Ⅰ型膠原、OPN和OCN mRNA在各組均有表達。Ct值表明其表達量的大小順序為A、B、C、D組，E組無表達，A組和B組的Ct值明顯大于C組和D組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。結論 BMP-2活性多肽能有效地促進MSCs向成骨方向分化，其誘導作用存在劑量依賴關系，最佳誘導劑量為200 μg/ml。