目的 通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實現(xiàn)其蛋白的體外表達。 方法 從幼年大鼠的脊髓組織中，通過RT-PCR技術(shù)獲得Nogo-66、 NEP1-40基因，將目的基因通過基因連接反應(yīng)與T載體連接，重組質(zhì)粒進行基因序列測序，構(gòu)建PQE30-GST和目的基因的高表達質(zhì)粒，異丙基βD硫代半乳糖(isopropylthiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達，Ni柱純化，Western-blot法檢測純化的目的蛋白。 結(jié)果 成功獲得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因，加上兩端的酶切位點和保護性堿基，大小分別為215 bp和137 bp。序列測序顯示基因突變率為0，表達質(zhì)粒構(gòu)建雙酶切(BamH Ⅰ-和Hind Ⅲ)可見目的基因的條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，獲得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40，相對分子質(zhì)量分別為33.2×103和30.3×103。蛋白純化結(jié)果理想，經(jīng)Westernblot分析證實抗原性正確。 結(jié)論 Nogo-66、NEP1-40蛋白可通過基因工程手段獲得體外高效表達，這將對其功能的研究及脊髓損傷疫苗的研究提供基礎(chǔ)。
目的 探討NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）基因修飾對神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）移植后存活和分化的影響。 方法 從孕18 d Wistar大鼠胚胎大腦皮質(zhì)中分離獲得原代NSCs并進行體外培養(yǎng)。采用慢病毒載體將NEP1-40基因?qū)氲?代NSCs內(nèi)完成NEP1-40基因修飾。將30只成年雌性SD大鼠在T9水平進行脊髓右側(cè)半切后隨機分為脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）組（B組）、NSCs移植組（C組）、NEP1-40基因修飾NSCs組（D組），每組各10只，傷后7 d在損傷局部分別植入NSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NSCs懸液及NEP1-40基因修飾的NSCs；另取10只SD大鼠僅行T9椎板切除設(shè)為假手術(shù)組（A組）。移植后8周，取損傷段脊髓組織行辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）神經(jīng)示蹤、巢蛋白（Nestin）免疫熒光染色及神經(jīng)絲蛋白200（neurofilament 200，NF-200）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫組織化學(xué)染色，評價神經(jīng)纖維再生情況及移植細胞存活和分化情況。 結(jié)果 移植后8周，A、B、C、D組HRP陽性染色神經(jīng)纖維束分別為（85.17 ± 6.97）、（12.17 ± 2.79）、（33.58 ± 5.47）、（59.25 ± 7.75）個，B、C、D組顯著少于A組（P lt; 0.01）；但C、D組顯著高于B組，D組顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。Nestin免疫熒光染色示，A組未見明顯Nestin熒光信號，B組僅可見少量散在熒光信號，C、D組有較強熒光信號。免疫組織化學(xué)染色定量分析示，NF-200陽性細胞數(shù)及MBP積分吸光度（IA）值A(chǔ)組最高，D組次之，C組較少，B組最少，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；GFAP陽性細胞數(shù)B組最多，D組次之，C組較少，A組最少，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；C、D組間NF-200、GFAP、MBP陽性細胞百分比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 NEP1-40基因修飾對NSCs移植后的分化無明顯誘導(dǎo)性，但能促進移植細胞存活、分化及神經(jīng)元軸突再生，為研究NSCs移植治療SCI提供了新思路。
【摘 要】 目的 構(gòu)建NEP1-40（Nogo extra cellular peptide residues 1-40）基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細胞奠定基礎(chǔ)，并實現(xiàn)在細胞中高效、穩(wěn)定表達。 方法 從含有 NEP1-40 基因的 cDNA 文庫中，利用PCR 方法釣取NEP1-40 基因編碼區(qū)片段。將目的基因與酶切線性化的載體pGC-FU 進行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR 鑒定，再對PCR 鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒和兩種輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，包裝成慢病毒，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞后熒光表達情況，采用Western blot 檢測NEP1-40 及綠色熒光蛋白融合蛋白表達情況。 結(jié)果 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明成功獲取NEP1-40 基因cDNA 克隆，測序提示慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒連接構(gòu)建正確；熒光表達檢測顯示293T 細胞中產(chǎn)生慢病毒顆粒；Western blot 顯示NEP1-40 在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。 結(jié)論 成功構(gòu)建NEP1-40 基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染目的細胞后從分子水平探討NEP1-40 基因功能奠定了實驗基礎(chǔ)。
目的通過慢病毒載體將 NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）及神經(jīng)營養(yǎng)因子 3（neurotrophin 3，NT-3）雙基因轉(zhuǎn)染入神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）內(nèi)進行表達，探討 NEP1-40 及 NT-3 雙基因轉(zhuǎn)染 NSCs 的可行性，為 NSCs 體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。方法將 SD 大鼠胚胎室管膜區(qū) NSCs 采用空載慢病毒載體（A 組）、NEP1-40 慢病毒載體（B 組）、NT-3 慢病毒載體（C 組）及 NEP1-40 和 NT-3 慢病毒載體（D 組）進行轉(zhuǎn)染，以未轉(zhuǎn)染病毒的細胞作為對照組（E 組）。用感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為 5、10、15 的慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染 24、48、72 h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)熒光表達情況，確定慢病毒載體的最佳 MOI 和收樣時間。再分別通過實時熒光定量 PCR 及 Western blot，檢測轉(zhuǎn)染后細胞中 NEP1-40 及 NT-3 基因的表達，以及細胞和培養(yǎng)基中 NEP1-40 及 NT-3 蛋白的表達。結(jié)果熒光顯微鏡觀察示，MOI 為 10 時 NEP1-40 和 NT-3 基因慢病毒載體在 NSCs 內(nèi)轉(zhuǎn)染率最高，最佳時間為轉(zhuǎn)染 48 h 時。實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測示，B、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量和蛋白相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量和蛋白相對表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A、B 組間和 C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論通過慢病毒載體可將 NEP1-40 及 NT-3 雙基因成功轉(zhuǎn)染入 NSCs 內(nèi)，在 NSCs 內(nèi)穩(wěn)定表達，且兩種目的基因在表達過程中無相互拮抗或促進作用。