目的 克隆和構(gòu)建攜帶人低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)質(zhì)粒PTRE-HIF-1α。方法 以缺氧的肝癌細(xì)胞株HepG2總RNA為模板，進(jìn)行RT-巢式PCR，獲得HIF-1α的cDNA，克隆入Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)質(zhì)粒PTRE2hyg，酶切重組子鑒定。將構(gòu)建好的PTRE-HIF-1α用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)入HepG2Tet-on細(xì)胞，在強(qiáng)力霉素的作用下，用RT-PCR及Western blot法鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá)。結(jié)果 擴(kuò)增出HIF-1α的cDNA測(cè)序結(jié)果與Genbank記載完全一致，并成功克隆入PTRE2hyg，將反應(yīng)質(zhì)粒PTRE-HIF-1α轉(zhuǎn)入HepG2Tet-on細(xì)胞，可以完整有效表達(dá)HIF-1α且受強(qiáng)力霉素的調(diào)控。結(jié)論 成功克隆和構(gòu)建攜帶HIF-1α基因的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)質(zhì)粒PTRE-HIF-1α，并證明其表達(dá)能在HepG2Tet-on細(xì)胞中受強(qiáng)力霉素調(diào)控。
目的對(duì)單純皰疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素進(jìn)行基因擴(kuò)增，克隆構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡ TK/As。方法從單純皰疹病毒Ⅱ型（HSVⅡ）Sav株感染的Hep2細(xì)胞上清液中提取HSV2基因組DNA，以此為模板，用PCR方法擴(kuò)增胸苷激酶（TK）基因，將擴(kuò)增的片段克隆入載體pcDNA3中，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。限制性核酸內(nèi)切酶酶切pcDNA3/HSVⅡTK,得到目的基因TK，將其克隆于已構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3/As上。結(jié)果HSVⅡTK基因全部編碼區(qū)為1 128 bp，基因序列與genebank中報(bào)道相符。新質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡTK/As經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶(BamH Ⅰ,Hind Ⅲ)酶切后得到700 bp(As)及1000 bp(HSVⅡTK)相應(yīng)基因片段。結(jié)論本研究成功構(gòu)建pcDNA3/HSVⅡTK/As真核表達(dá)質(zhì)粒。
目的 制備抗人大腸癌免疫毫微球，并觀察其活性及療效。方法 抗人大腸癌單克隆抗體SC3Ab通過異型雙功能交聯(lián)劑SPDP與載5-Fu人血清白蛋白毫微球［HSA(5-Fu)-NS］偶聯(lián)，制成抗人大腸癌免疫毫微球SC3Ab-HSA(5-Fu)-NS。使用凝集試驗(yàn)及免疫熒光檢測(cè)其活性，光鏡和電鏡下觀察其與大腸癌細(xì)胞SW1116的特異性結(jié)合。MTT法檢測(cè)該免疫毫微球的體外殺傷性。于人大腸癌裸鼠模型上分別使用SC3Ab-HSA(5-Fu)NS、HSA(5-Fu)NS及5-Fu，檢測(cè)三者的腫瘤抑制率。結(jié)果 SC3Ab-HSA(5-Fu)-NS具有單抗活性，能與大腸癌細(xì)胞特異結(jié)合；其體外殺傷SW1116細(xì)胞IC50值為24.6 μg/ml，與HSA(5-Fu)-NS(345.3 μg/ml)及5-Fu(325.6 μg/ml)相比，明顯降低；體內(nèi)腫瘤抑制率比HSA(5-Fu)NS及5-Fu明顯增強(qiáng)(P＜0.001)。 結(jié)論 SC3Ab-HSA(5-Fu)-NS具有免疫活性，對(duì)大腸癌細(xì)胞有主動(dòng)靶向性，體內(nèi)外均具有比HSA(5-Fu)-NS及5-Fu更強(qiáng)的抗癌效果。
目的 在大腸桿菌高效表達(dá)人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)。方法 用PCR從人胎兒腦cDNA文庫(kù)擴(kuò)增血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）cDNA，得到517bp的DNA片段。擴(kuò)增片段重組到M13mP18中，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為VEGF165cDNA。將該片段重組到PRL621溫控表達(dá)質(zhì)粒中，在大腸桿菌表達(dá)20kd的重組蛋白。結(jié)果 該表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的35%，其N-端15個(gè)氨基酸序列與天然VEGF165蛋白相應(yīng)序列一致。結(jié)論 工程菌TG1/PRL621/VEGF高效表達(dá)人VEGF165蛋白質(zhì)。
目的 探索建立受體針對(duì)供體抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)入自殺基因誘導(dǎo)移植耐受的可行性。方法 供體鼠脾細(xì)胞免疫受體鼠，再分離、純化經(jīng)供體鼠抗原刺激受體鼠T淋巴細(xì)胞，將其作有限稀釋為單個(gè)T淋巴細(xì)胞，再分別以不同濃度飼養(yǎng)細(xì)胞、ConA、IL-2等條件，促使T淋巴細(xì)胞分裂、增殖，構(gòu)建受體針對(duì)供體抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆。結(jié)果 ①受體針對(duì)供體抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆穩(wěn)定建立； ②不同免疫組間克隆生成率的差異有顯著性意義（t＞t0.05）； 無或單純飼養(yǎng)細(xì)胞孔無克隆生長(zhǎng)； ConA刺激有少數(shù)克隆生成； 克隆生成率與IL-2刺激濃度可能相關(guān)。結(jié)論 成熟T淋巴細(xì)胞，在一定條件下仍可發(fā)生分裂和增殖，形成克隆。通過供體脾細(xì)胞抗原特異性刺激，提示最終篩選出的T淋巴細(xì)胞克隆具有針對(duì)供體抗原的免疫反應(yīng)性。
采用牛磺膽酸鈉復(fù)制大鼠急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)模型，動(dòng)態(tài)觀察其血漿腫瘤壞死因子α(TNFα)含量、血清脂肪酶含量和胰腺病理改變等，以及抗腫瘤壞死因子α單克隆抗體(TNFα MCAb)的治療對(duì)它們的作用，并與假手術(shù)組比較。結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)無異常改變，無動(dòng)物死亡。AHNP組腹水量、血清脂肪酶及血漿TNFα水平均較假手術(shù)組顯著增加，胰腺病理改變明顯；經(jīng)TNFα MCAb治療后，血漿TNFα水平未見升高，而血清脂肪酶下降，腹水積聚減少，胰腺病理改變減輕，動(dòng)物死亡率顯著下降。由此提示，TNFα在AHNP發(fā)病機(jī)理中起重要作用，TNFα MCAb對(duì)AHNP大鼠有一定的治療作用。
溫?zé)崧?lián)合化療、放療及免疫治療有協(xié)同抗癌作用，并能減輕對(duì)正常組織的副作用。本實(shí)驗(yàn)選擇絲裂霉素C(MMC)及5-氟脲嘧啶(5-Fu)聯(lián)合溫?zé)狍w外作用于人胃癌細(xì)胞株(MGC-803)，檢測(cè)其作用后活癌細(xì)胞百分計(jì)數(shù)、克隆形成率及存活分?jǐn)?shù)，以觀察溫?zé)崧?lián)合MMC或5-Fu的細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明：溫?zé)崧?lián)合MMC有協(xié)同抗癌作用，且隨溫度的升高其作用逐漸增強(qiáng)，與單純加溫組比較有顯著性差異(Plt;0.01)；而溫?zé)崧?lián)合5-Fu無協(xié)同抗癌作用，但與單純加溫組比較，在較低溫度(37℃)時(shí)有顯著性差異(Plt;0.01)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。
為探討CD28單克隆抗體在移植免疫中的作用，以混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和大鼠同種異體甲狀旁腺移植為模型，觀察mAbCD28在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的作用。結(jié)果：mAbCD28在體外可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)可以延長(zhǎng)甲狀旁腺移植物的存活時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：mAbCD28可以阻斷CD28-B7之間共刺激信號(hào)的傳遞，并在同種異體大鼠甲狀旁腺移植中起到免疫抑制作用。
作者采用上皮細(xì)胞膜抗原單克隆抗體(EMA)免疫組化ABC法對(duì)65例胃癌患者有無骨髓微小轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果：從38例患者骨髓中發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞檢出率為58.46%(38/65)，而且該38例陽(yáng)性患者綜合治療前后陽(yáng)性結(jié)果有顯著變化(t=2.77 Ｐ＜0.005)。由此表明，此項(xiàng)技術(shù)不但能早期確定胃癌有無血行和骨髓轉(zhuǎn)移，而且對(duì)指導(dǎo)臨床綜合治療也有重要的意義。
目的 測(cè)定食管鱗狀細(xì)胞癌組織中人叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）的基因表達(dá)水平，為食管癌的免疫治療提供依據(jù)。 方法 基于TaqMan熒光探針技術(shù)，構(gòu)建克隆載體pMD 18-T-FOXP3，作為定量模板，建立檢測(cè)FOXP3信使核糖核酸（mRNA）含量的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法，在GeneAmp 7500型檢測(cè)儀上測(cè)定42例食管鱗癌組織和30例正常對(duì)照組織中FOXP3 mRNA的含量。 結(jié)果 食管鱗癌組織FOXP3 mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組織［(72.20±23.10)×104拷貝/μg RNA vs.(0.68±0.34)×104拷貝/μg RNA；Plt;0.05］。 結(jié)論 成功建立了人FOXP3基因mRNA表達(dá)含量的熒光定量檢測(cè)方法，F(xiàn)OXP3在食管鱗癌組織中的表達(dá)較正常對(duì)照組織增高。