華西醫(yī)學(xué)期刊出版社
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找到 作者 包含"朱金海" 3條結(jié)果
  • 人肝細(xì)胞生長因子修飾的BMSCs 對大鼠同種異體肝移植免疫排斥的影響

    目的 觀察肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)修飾的BMSCs 對大鼠同種異體肝移植后免疫排斥反應(yīng)的影響,探討其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。 方法 3 ~ 4 周齡清潔級雄性SD 大鼠8 只,體重75 ~ 85 g,用于分離培養(yǎng)BMSCs;成年清潔級雄性SD 大鼠64 只,體重200 ~ 250 g,作為供體;成年清潔級雄性Wistar 大鼠64 只,體重230 ~ 280 g,作為受體。建立穩(wěn)定的同種異體肝移植動物模型并隨機(jī)分為4 組(n=16),A、B、C、D 組分別立即經(jīng)門靜脈注入1 mL 生理鹽水、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/ 綠色熒光蛋白、1 mL 細(xì)胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/hHGF。術(shù)后作實驗動物生存曲線分析;術(shù)后7 d 檢測實驗動物肝功能,并取肝臟組織行病理組織學(xué)觀察,RT-PCR 檢測肝組織內(nèi)hHGF mRNA 表達(dá),ELISA 法檢測血清中hHGF、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 細(xì)胞因子的表達(dá),TUNEL 法檢測肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況,免疫組織化學(xué)方法檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在肝組織內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果 D 組生存時間顯著高于A、B、C 組(P lt; 0.01);B、C 組生存時間明顯高于A 組(P lt; 0.01),但B、C 組間生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。RT-PCR 示檢測D 組肝組織內(nèi)有hHGF mRNA 表達(dá),ELISA 檢測血清中hHGF 水平達(dá)(6.2 ± 1.0)ng/mL。相比B、C 組,D 組療效更顯著,肝功能明顯改善,病理學(xué)無急性排斥反應(yīng)或僅為輕度;IL-2、IFN-γ 水平降低,IL-4、IL-10 水平升高,細(xì)胞凋亡明顯減少,PCNA 表達(dá)顯著升高,除IL-4 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)外,其余指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 通過門靜脈輸注BMSCs/hHGF 至大鼠同種異體肝移植模型能成功誘導(dǎo)免疫耐受。與單純應(yīng)用BMSCs 相比,BMSCs/hHGF在移植肝局部形成高濃度hHGF 免疫抑制微環(huán)境,能更顯著抑制急性排斥反應(yīng),延長移植受體存活時間。BMSCs/hHGF的免疫抑制作用與誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞偏移、減少肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖有關(guān)。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:44 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 慢病毒介導(dǎo)人肝細(xì)胞生長因子基因感染BMSCs 的實驗研究

    目的 構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因的慢病毒,感染大鼠BMSCs,建立穩(wěn)定表達(dá)hHGF 的BMSCs/hHGF 細(xì)胞。 方法 從含hHGF 基因的質(zhì)粒pcDNA-hHGF 中,用PCR 法獲取hHGF 全長基因,與慢病毒載體pGC-E1 分別進(jìn)行Age Ⅰ酶切,產(chǎn)物定向連接,轉(zhuǎn)化后行PCR 鑒定和測序,構(gòu)建hHGF 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 介導(dǎo)慢病毒載體三質(zhì)粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒超濾離心濃縮,實時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá),確定最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection,MOI)值,以最佳MOI 值感染細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測感染效率,ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平,RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)果 實驗成功構(gòu)建攜帶hHGF 基因的慢病毒,滴度達(dá)1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs,最佳MOI 值為10。流式細(xì)胞儀檢測感染效率達(dá)98%,且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達(dá)強烈的綠色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子,術(shù)后5 d 達(dá)高峰,達(dá)40.5 ng/mL,這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細(xì)胞,可獲得長期穩(wěn)定的表達(dá),并持續(xù)分泌hHGF 因子。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:48 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 大鼠改良式原位肝移植手術(shù)技巧探討

    目的 探討建立穩(wěn)定大鼠原位肝移植模型的手術(shù)操作技巧。 方法 成年雄性SD 大鼠200 只,體重200 ~ 250 g;成年雄性Wistar 大鼠60 只,體重230 ~ 280 g,供體體重小于受體約30 g。其中SD 大鼠為供、受體的同基因肝移植70 只(SD-SD 組),SD、Wistar 分別為供、受體的同種異體肝移植60 只(SD-Wistar 組)。采用改良二袖套法行大鼠原位肝移植,充分暴露第一肝門,不翻動肝臟先行門靜脈灌注;在體一步法離斷肝上下腔靜脈,不帶膈肌環(huán);吻合肝上下腔靜脈采用單線連續(xù)縫合;雙線牽引法安裝門靜脈袖套。術(shù)后充分補液維持大鼠血液動力學(xué)穩(wěn)定。 結(jié)果 供體手術(shù)時間(38.2 ± 2.5)min,受體手術(shù)時間(45.6 ± 3.5)min,無肝期(15.1 ± 2.2)min,手術(shù)成功率93%,1 周存活率92%,與傳統(tǒng)二袖套法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。SD-SD 組手術(shù)成功64 只,受體存活時間2 ~ 9 個月,平均145 d;術(shù)后約3 d 肝功能恢復(fù)正常,肝組織病理無明顯變化。SD-Wistar 組手術(shù)成功57 只,受體存活時間8 ~ 20 d,平均10.5 d;大鼠于術(shù)后3 ~ 5 d 出現(xiàn)急性排斥反應(yīng),未經(jīng)處理后均死亡。 結(jié)論 改良式肝移植操作簡便,成功率高,可為大鼠原位肝移植實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。

    發(fā)表時間:2016-09-01 09:19 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
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