目的 研究在缺氧條件下A549細胞對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)遷移及微血管形成的影響。方法 A549細胞在常氧組(21%O2)、缺氧組(2%O2)、無氧組(0%O2)中培養(yǎng)24 h后,通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法檢測細胞增殖、免疫細胞化學技術(shù)檢測細胞內(nèi)低氧誘導因子1α(HIF-1α)蛋白量以確定缺氧模型建立是否成功。隨后取常氧組、缺氧組的A549細胞上清液、HUVEC細胞培養(yǎng)液干預HUVEC,用細胞劃痕實驗、微絲綠色熒光染色方法觀察各組HUVEC的遷移情況及偽足形成,體外HUVEC三維培養(yǎng)技術(shù)觀察血管形成情況。結(jié)果 與常氧組比較,缺氧組A549細胞的生長狀態(tài)好,增殖明顯;無氧組A549細胞生長狀態(tài)差,細胞數(shù)量減少;缺氧組及無氧組A549細胞均有HIF-1α表達,且缺氧組表達更加明顯。與細胞培養(yǎng)液干預組比較,缺氧上清液干預組和常氧上清液干預組A549細胞的HUVEC均有不同程度的遷移、偽足結(jié)構(gòu)形成及血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成,且前者較后者明顯。結(jié)論 缺氧環(huán)境下A549細胞生長狀態(tài)良好,增殖明顯,而無氧環(huán)境下則不利于A549細胞的生長。缺氧環(huán)境下A549細胞能促進HUVEC的遷移、偽足形成及血管形成。
目的 探討不可分型流感嗜血桿菌（NTHi）作用于呼吸道上皮細胞株（A549），表達前炎癥細胞因子的變化及其干預措施。方法 用NTHi、NTHi+紅霉素（10 mg/L）、NTHi+慶大霉素（100 mg/L）、NTHi+地塞米松（100 μmol/L）分別感染A549細胞，用核因子κB（NF-κB）抑制劑二硫氨基甲酸吡啶（PDTC，200 μmol/L）預處理NTHi感染的A549細胞，24 h后觀察細胞的形態(tài)學改變，并檢測上清液中白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平和細胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達。結(jié)果 NTHi作用A549細胞24 h后，引起部分上皮細胞變形、死亡。NTHi能顯著誘導A549細胞株分泌IL-8、表達ICAM-1，紅霉素能夠抑制其誘導作用；慶大霉素具有殺滅NTHi作用，但不能抑制IL-8分泌和ICAM-1表達；地塞米松能抑制A549分泌IL-8，降低ICAM-1的表達，但不能殺滅NTHi。PDTC（200 μmol/L）能阻斷A549細胞在NTHi作用后IL-8的高表達。TNF-α在各組培養(yǎng)上清中均不能檢測到。結(jié)論 NTHi顯著誘導人肺上皮細胞系表達前炎癥因子，該作用可能通過NF-κB通路。紅霉素在殺滅NTHi的同時還具有抗炎作用。
目的 探討用小RNA 干擾抑制Ku80 基因表達以提高A549 肺癌細胞的放射敏感性。方法 設計并化學合成Ku80 siRNA, 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的A549 肺癌細胞。利用RT-PCR 和Western blot分別從mRNA 和蛋白質(zhì)水平對轉(zhuǎn)染后的細胞Ku80 基因表達情況進行測定, 同時上述轉(zhuǎn)染的細胞分別照射2、4、6、8 及10 Gy, 利用克隆形成實驗測定放射敏感性的變化。結(jié)果 RT-PCR 檢測顯示在A549 肺癌細胞轉(zhuǎn)染Ku80 siRNA 后24、48 和72 h 三個時間點Ku80 mRNA 含量減少, Western blot 分析顯示在轉(zhuǎn)染48 和72 h 兩個時間點Ku80 蛋白含量減少, 與對照組比較有統(tǒng)計學差異( P lt;0. 05) 。克隆形成實驗提示A549 肺癌細胞轉(zhuǎn)染Ku80 siRNA 后放射敏感性增強。結(jié)論 Ku80 siRNA 轉(zhuǎn)染A549 肺癌細胞后能夠有效抑制Ku80 基因表達, 提高其放射敏感性。
目的 觀察單免疫球蛋白白細胞介素1受體相關(guān)蛋白（SIGIRR）對高遷移率族蛋白B1（HMGB1）誘導的人肺泡上皮細胞株A549炎性反應的影響。方法 構(gòu)建含有SIGIRR cDNA全長的真核表達載體pCDNA3.1（+），瞬時轉(zhuǎn)染人Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞，使SIGIRR在A549細胞中過表達，采用Western blot和RT-PCR法檢測其表達。HMGB1刺激A549細胞后，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染前后核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄活性的改變，ELISA檢測轉(zhuǎn)染前后炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）蛋白表達水平的變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染SIGIRR表達載體的A549細胞，其SIGIRR表達量顯著上升。HMGB1刺激后，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，而轉(zhuǎn)染SIGIRR表達載體后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性下降。ELISA實驗結(jié)果表明，過表達SIGIRR的A549細胞在接受HMGB1刺激后其炎癥因子TNF-α及IL-1β蛋白表達水平明顯低于對照組。結(jié)論 SIGIRR表達上調(diào)可以抑制HMGB1誘導的A549細胞產(chǎn)生炎癥因子TNF-α和IL-1β。A549細胞轉(zhuǎn)染前后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的改變提示SIGIRR的抗炎作用可能與其參與NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控有關(guān)。
目的 研究慢性阻塞性肺疾病急性加重( AECOPD) 患者中不同基因型副流感嗜血桿菌( HPI) 的分布及其對氣道上皮細胞株A549 的影響。方法 以2010 年至2011 年間中山大學附屬第三醫(yī)院住院的AECOPD 患者為研究對象, 采集痰標本培養(yǎng)HPI, 所得菌株采用隨機引物聚合酶鏈反應( RAPD) 進行基因分型, 并與氣道上皮細胞株A549 共同培養(yǎng), 作用不同時間后取細胞培養(yǎng)上清行白細胞介素6( IL-6) 、IL-8 的檢測, 并通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。結(jié)果 入組80 例AECOPD 患者, 按癥狀分為3 型, 共培養(yǎng)HPI 15 株, 培養(yǎng)陽性率18.8% 。1 型與3 型兩組間細菌陽性率比較有顯著差異。所得菌株與A549 上皮細胞共培養(yǎng)后IL-8、IL-6 分泌水平均較對照組明顯升高, 且與時間呈正相關(guān)。所得菌株采用RAPD 法可分為4 種基因型, RAPD Ⅲ型與A549 上皮細胞共培養(yǎng)后, 12 h 和 24 h 的IL-8 分泌水平均高出其他組。各組經(jīng)顯微鏡觀察均未見明顯細胞形態(tài)學變化, 且HPI 未進入細胞。結(jié)論 不同臨床類型AECOPD 患者痰HPI 培養(yǎng)陽性率不同。HPI 無法進入氣道上皮細胞胞內(nèi), 可能是胞外感染菌, 但能夠引起氣道上皮細胞炎癥因子表達持續(xù)升高, 而且不同基因型毒力不同。 HPI 可能是COPD 急性加重的致病菌之一。
目的觀察單免疫球蛋白白細胞介素1受體相關(guān)蛋白(SIGIRR)對香煙煙霧提取物(CSE)刺激的小鼠肺泡上皮細胞株A549炎性反應的影響。 方法將A549細胞分為過表達SIGIRR組和對照組。構(gòu)建含有SIGIRR cDNA全長的真核表達載體pcDNA3.1(+), 瞬時轉(zhuǎn)染小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞, 使SIGIRR在A549細胞中過表達, 采用半定量Western blot和RT-PCR法檢測其表達。以CSE刺激對照組及過表達SIGIRR組中A549細胞后, ELISA法檢測白細胞介素6(IL-6)水平, 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測環(huán)氧化酶2(COX-2)表達水平, 化學發(fā)光法檢測活性氧(ROS)釋放水平的變化。 結(jié)果轉(zhuǎn)染SIGIRR表達載體的A549細胞其SIGIRR表達量顯著上升。對照組經(jīng)CSE刺激后, COX-2表達、ROS釋放、IL-6釋放水平均顯著增高, 而過表達SIGIRR組的A549細胞經(jīng)CSE刺激后, COX-2表達較對照組降低, ROS釋放較對照組降低, IL-6釋放水平也明顯低于對照組(P<0.05)。 結(jié)論SIGIRR表達上調(diào)可以抑制CSE誘導的A549細胞產(chǎn)生ROS、COX-2及IL-6, 提示SIGIRR表達上調(diào)可能對吸煙所致呼吸道炎癥具有抑制作用。
目的 研究轉(zhuǎn)染叉頭蛋白O1(FOXO1)后A549細胞基因表達譜的改變,為深入探討FOXO1在急性肺損傷中的作用機制提供線索。 方法 應用腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激A549細胞,應用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法將真核表達載體GV230-FOXO1轉(zhuǎn)染入經(jīng)TNF-α誘導的A549細胞,再提取細胞的總RNA,應用基因芯片技術(shù)進行分析。 結(jié)果 成功構(gòu)建并驗證了FOXO1真核表達載體,提取了高質(zhì)量的mRNA進行芯片分析,并通過RNA質(zhì)量控制(RNA QC)驗證。芯片分析結(jié)果顯示差異表達基因中上調(diào)的基因有317個,下調(diào)的基因有237個。這些差異表達的基因功能涉及細胞增殖、凋亡、分化等多個方面。 結(jié)論 應用基因芯片技術(shù)可成功篩選轉(zhuǎn)染FOXO1基因后A549細胞的差異表達基因。FOXO1在急性肺損傷中可能通過改變細胞的增殖、凋亡與分化等水平來影響疾病的進程。
目的 評價紅芪多糖 -1（HPS-1）對人肺癌 A549 細胞氧自由基（ROS）、谷胱甘肽（GST）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）以及脂肪酸過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）表達的影響。 方法 人肺腺癌 A549 細胞經(jīng)低、中、高（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L）不同劑量 HPS-1 處理不同時間后，MTT 法檢測細胞細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，化學熒光法檢測細胞內(nèi) ROS，比色法檢測細胞上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 水平。 結(jié)果 不同劑量 HPS-1 均具有抑制人肺腺癌 A549 細胞增殖的作用，且具有時間、劑量依賴性（P<0.05）。不同劑量 HPS-1 具有誘導人肺腺癌 A549 細胞凋亡的作用，且具有時間、劑量依賴性（P<0.05）。HPS-1 可促進人肺腺癌 A549 細胞 ROS、MDA 的上調(diào)（P<0.05），隨著作用時間的延長，上調(diào)作用降低；可促進 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR 的下調(diào)（P<0.05），隨著 HPS-1 干預時間的延長，下調(diào)作用降低。 結(jié)論 HPS-1 具有抑制人肺腺癌 A549 細胞增殖、誘導人肺腺癌 A549 細胞凋亡的作用。機制可能與其調(diào)控人肺腺癌 A549 細胞氧化/抗氧化能力比例的作用有關(guān)。
目的 探究干擾 RNA（shRNA）敲低非小細胞肺癌（NSCLC）A549 細胞雌激素受體 α（ERα）基因后對 A549 細胞生物學活性及裸鼠腫瘤生長的影響。方法 采用 shRNA 敲低 A549 細胞中的 ERα 基因，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測敲低后的基因表達與蛋白表達，克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力，RT-PCR 檢測相關(guān)增殖蛋白 Ki-67 和 PCNA 的表達，流式細胞檢測細胞凋亡率；Transwell 實驗檢測細胞的侵襲能力，Western blot 檢測上皮型鈣黏蛋白（E-cad）和神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cad）的表達。對照組和轉(zhuǎn)染 ERα-shRNA1 的 A549 細胞分別注射到裸鼠皮下，構(gòu)建移植瘤，免疫組織化學檢測腫瘤組織中 Ki-67 與 N-cad 的表達。結(jié)果 與對照組相比，轉(zhuǎn)染 ERα-shRNA1 和 ERα-shRNA2 后，ERα 的 mRNA 和蛋白表達量均明顯下調(diào)（均 P<0.05），采用干擾效率高的 shRNA1 進行后續(xù)實驗。A549 細胞轉(zhuǎn)染 ERα-shRNA1 后，集落形成率較對照組顯著下調(diào)（P<0.05），細胞凋亡比率明顯升高（P<0.05），Ki-67 和 PCNA 的表達顯著下調(diào)（P<0.05），侵襲細胞數(shù)目明顯減少，E-cad 表達升高，N-cad 表達降低（均 P<0.05）。裸鼠成瘤實驗結(jié)果表明干擾 ERα 的表達可顯著抑制腫瘤的生長（P<0.05），下調(diào) Ki-67 與 N-cad 的陽性細胞比率（均 P<0.05）。結(jié)論 敲低 ERα 抑制了 A549 細胞的生長、運動能力及裸鼠移植瘤的發(fā)生和發(fā)展。
目的 探究活體成像系統(tǒng)（IVIS）在原位肺癌模型的建立及評價中的應用，并探討其應用前景。方法 將穩(wěn)定表達熒光素酶的A549細胞經(jīng)尾靜脈注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)，在細胞注射后第7、14和21天腹腔注射發(fā)光底物D-熒光素鉀鹽，利用IVIS采集熒光值，使用IVIS Spectrum測量熒光值，動態(tài)分析原位肺癌生長情況。最后利用蘇木精–伊紅染色分析各時間點裸鼠肺組織形態(tài)。結(jié)果 通過尾靜脈注射A549細胞的方式成功建立了原位肺癌動物模型，IVIS無創(chuàng)、實時、動態(tài)地連續(xù)監(jiān)測了活體動物的原位肺癌發(fā)展的熒光數(shù)值，與蘇木精–伊紅染色的結(jié)果具有一致性，腫瘤體積與熒光強度相關(guān)系數(shù)為0.7996（P<0.01），具有一定的相關(guān)性。結(jié)論 IVIS靈敏度高，特異性好，操作簡單，無放射性，能夠?qū)υ环伟┻M行無創(chuàng)、實時、動態(tài)的監(jiān)測，具有重要的科學意義和應用前景。