摘要: 目的 在大鼠心肌梗死部位植入微囊化重組中華倉(cāng)鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO ) 細(xì)胞, 觀察其分泌的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(V EGF) 是否可以促進(jìn)心肌梗死部位的血管新生, 改善心功能。 方法 通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建可以分泌V EGF 的重組CHO 細(xì)胞系, 用微囊包裹, 觀察微囊內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分泌情況。制備大鼠心肌梗死模型, 隨機(jī)將48 只8 周齡SD 雄性大鼠分成微囊化細(xì)胞移植組(MC2CHO 組)、單純細(xì)胞移植組(CHO 組)、空微囊移植組(MC 組) 和無(wú)血清培養(yǎng)基移植組(對(duì)照組) , 每組12 只。移植3 周后檢測(cè)心功能改善情況, 病理切片觀察微囊結(jié)構(gòu)及囊內(nèi)細(xì)胞存活情況, 注射部位微血管計(jì)數(shù)比較促血管新生效果。 結(jié)果 體外檢測(cè)可見(jiàn)重組CHO 細(xì)胞在微囊生長(zhǎng)迅速, 第8 d 時(shí)培養(yǎng)上清中V EGF 達(dá)3 852 pgouml;m l; 移植3 周后MC2CHO 組左心室大小和心功能明顯好于其它3 組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0. 05) ; 局部微血管密度MC2CHO 組較CHO 組、MC 組和對(duì)照組明顯增加(22. 3±3. 1 vs. 15. 6±2.8, 11. 4±2. 5 和13. 2±2. 7 個(gè)ouml;每高倍視野, P lt; 0. 05) ; 組織學(xué)檢查可見(jiàn)微囊結(jié)構(gòu)完整, 內(nèi)有存活且具有分泌功能的CHO 細(xì)胞?！〗Y(jié)論 微囊化重組CHO 細(xì)胞移植可促進(jìn)大鼠心肌梗死后血管新生, 改善心功能。
目的 胰島的純度和活性對(duì)胰島移植治療糖尿病的療效有很大影響。探討一種大鼠胰島分離純化的新方法，以獲得高純度、高產(chǎn)量、活性好的胰島。 方法 選取健康成年雄性SD 大鼠10 只，體重250 ～ 300 g，逆行膽總管灌注Ⅴ型膠原酶溶液，38℃水浴消化約15 min 后，采用兩種方法純化胰島細(xì)胞：A 組采用Ficoll 400 不連續(xù)密度梯度液，B 組采用Ficoll-Paque? PLUS 溶液。行雙硫腙（dithizone，DTZ）染色鑒定胰島并計(jì)算胰島當(dāng)量（islet equivalent quantity，IEQ）、胰島純度，錐蟲(chóng)藍(lán)染色檢測(cè)胰島活性。取B 組胰島用海藻酸鈉- 聚左賴氨酸- 海藻酸鈉（alginate/poly-Llysine/ alginate，APA）包裹制備胰島微囊，體外靜止葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微囊化和未微囊化胰島的生物學(xué)活性。 結(jié)果 DTZ 染色示胰島呈猩紅色，有圓形、橢圓形和不規(guī)則形，胰島邊緣清晰，大部分直徑為50 ～ 300 μm。A、B組IEQ 值分別為338.04 ± 76.61 和834.80 ± 54.00，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。A、B 組胰島純度分別為88.31% ± 2.67% 和95.63% ± 1.96%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。A、B 組胰島活率分別為67.40% ± 5.15% 和86.05% ± 2.52%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。胰島APA 微囊囊形呈完整圓形，大小均勻，微囊直徑為1.5 ～ 2.0 mm，每個(gè)微囊中包裹1 ～ 3 個(gè)胰島。葡萄糖刺激釋放胰島素實(shí)驗(yàn)顯示，未微囊化胰島和微囊化胰島在低糖下的胰島素分泌濃度分別為（5.53 ±1.64） ng/ mL 和（4.76 ± 0.26）ng/mL，高糖下分別為（11.95 ± 2.07）ng/mL 和（14.34 ± 3.18）ng/mL，高糖刺激下胰島素釋放量為低糖刺激的2 倍多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；兩組的刺激指數(shù)分別為2.16 ± 0.30 和3.01 ± 0.59，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 Ficoll-Paque? PLUS 溶液作為純化液分離純化胰島的方法具有操作簡(jiǎn)便、胰島產(chǎn)量高、純度高等優(yōu)點(diǎn)，獲得的胰島經(jīng)微囊化或未微囊化體外培養(yǎng)均有良好活性。
目的 對(duì)微膠囊技術(shù)及其在骨科疾病方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。 方法 廣泛查閱近年相關(guān)文獻(xiàn)，介紹微膠囊技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)及其在骨科疾病上的應(yīng)用。 結(jié)果 較全面地對(duì)微膠囊技術(shù)的材料、制備方法、性能評(píng)價(jià)、緩釋性能、免疫隔離和可包裹的細(xì)胞系進(jìn)行了回顧，分析了其作為骨科藥物和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的載體，用于促進(jìn)骨愈合，基因治療骨腫瘤、骨感染和骨軟骨再生的作用。 結(jié)論 微膠囊可以作為骨科藥物和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的載體，治療骨科相關(guān)疾病。
目的 探討微囊化神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）基因修飾的NIH3T3細(xì)胞復(fù)合組織工程真皮的可行性及其對(duì)急性創(chuàng)面愈合的影響。 方法 構(gòu)建分泌型NGF真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1＋/NGF并導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，將此細(xì)胞包入海藻酸鈉多聚賴氨酸海藻酸鈉微囊中培養(yǎng)。以Ⅰ、Ⅲ型膠原為基質(zhì)、人成纖維細(xì)胞和制備好的微囊為種子細(xì)胞，用組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)合微囊的組織工程真皮，體外培養(yǎng)1周后行羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）測(cè)定，ELISA法測(cè)定其分泌功能，組織形態(tài)學(xué)觀察。以豬背部急性全層創(chuàng)面為模型，按移植物不同分為5組：NGF- NIH3T3微囊真皮組(A組)、NIH3T3微囊真皮組(B組)、空囊真皮組(C組)、NGF（5 ng/ml）＋膠原膜組(D組)和空白對(duì)照組(E組)，觀察創(chuàng)面再上皮化及愈合速度和愈合時(shí)間。 結(jié)果 轉(zhuǎn)NGF基因微囊復(fù)合組織工程真皮后體外培養(yǎng)6周，仍穩(wěn)定分泌NGF（124.32 pg/ml），體外培養(yǎng)1周后，組織工程真皮中NGF-NIH3T3微囊組Hyp含量為69.68±6.20 mg/g，較空白對(duì)照組增加約2倍以上。移植治療急性創(chuàng)面，A組平均愈合時(shí)間為25±2 d，B組為34±3 d，C組為34±2 d，D組為33±2 d，E組為40±3 d，A組創(chuàng)面愈合時(shí)間平均至少縮短約10 d，提高了創(chuàng)面愈合的速度。 結(jié)論 將分泌NGF微囊復(fù)合組織工程真皮后可提高組織工程真皮的質(zhì)量，并促進(jìn)急性創(chuàng)面的愈合。
目的 建立能穩(wěn)定分泌人內(nèi)皮抑素(hES)的基因工程細(xì)胞系，觀察內(nèi)皮抑素（ES）蛋白和hES的表達(dá)。方法 以hES重組質(zhì)粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增獲得hES基因片段，且在基因前加信號(hào)肽序列，將其定向插入真核表達(dá)載體綠色熒光蛋白（pEGFP-N1)）質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES；利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染到人胚胎腎細(xì)胞(HeK-293)細(xì)胞中, G418 篩選后得到陽(yáng)性克隆hES/293，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中ES蛋白的表達(dá)；用海澡酸鈉殼聚糖(ACA)微囊包裹hES/293細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，Western blot法檢測(cè)包裹后培養(yǎng)液上清中hES的表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES經(jīng)限制性核對(duì)內(nèi)切酶HindⅢ和限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ雙酶切得到4700堿基對(duì)(bp)和600 bp 2條帶；PCR擴(kuò)增出600 bp條帶；測(cè)序結(jié)果與NCBI上序列比對(duì)軟件（BLAST）比對(duì)，同源性達(dá)到100%。pEGFP-N1-ES轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞，經(jīng)G418 篩選后獲得陽(yáng)性克隆，選取篩選的10株單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行Western blot分析，在相對(duì)分子質(zhì)量為20times;103 處出現(xiàn)蛋白條帶。在ACA微囊內(nèi)hES/293細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)逐漸長(zhǎng)大，充滿整個(gè)囊內(nèi)空間。培養(yǎng)3、7、21、35 d時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量為20times;103處出現(xiàn)蛋白條帶。結(jié)論 重組pEGFP-N1-ES真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞后可有效的表達(dá)hES蛋白，并能分泌到細(xì)胞外；微囊化hES/293細(xì)胞產(chǎn)生的ES蛋白可以自由擴(kuò)散出微囊膜外，并呈持續(xù)性表達(dá)。
本研究探討海藻酸鈉-多聚鳥(niǎo)氨酸-海藻酸(A-PLO-A)和海藻酸鋇-多聚鳥(niǎo)氨酸-海藻酸(B-PLO-A)兩種新型微囊作為細(xì)胞移植載體的效果。兩種微囊包裹小鼠肝細(xì)胞后,植入D-氨基半乳糖腹腔注射法制備的急性肝衰竭模型大鼠體內(nèi),觀察大鼠死亡率,檢測(cè)微囊內(nèi)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝的情況,以及能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。實(shí)驗(yàn)分為A-PLO-A空微囊、B-PLO-A空微囊、移植游離的肝細(xì)胞、A-PLO-A微囊化肝細(xì)胞、B-PLO-A微囊化肝細(xì)胞五組。研究結(jié)果表明,單純的空微囊對(duì)肝衰大鼠病情無(wú)緩解作用,移植后兩個(gè)空囊移植組3 d死亡率均達(dá)到了100%。游離肝細(xì)胞組、A-PLO-A微囊化肝細(xì)胞組和B-PLO-A微囊化肝細(xì)胞組大鼠的ALT、AST、ALB水平均有所恢復(fù),4周時(shí)微囊移植組的上述指標(biāo)均優(yōu)于游離肝細(xì)胞組,說(shuō)明微囊化肝細(xì)胞移植有效緩解了肝臟損傷的程度,治療效果好于游離肝細(xì)胞組。微囊化肝細(xì)胞組大鼠的存活率明顯高于空囊移植組和游離肝細(xì)胞移植組;4周后回收的微囊表面光滑,無(wú)細(xì)胞包裹,無(wú)纖維化。研究結(jié)果提示基于多聚鳥(niǎo)氨酸的海藻酸微囊物理穩(wěn)定性和生物相容性良好,適合作為肝細(xì)胞體內(nèi)移植的載體。
探討微囊微環(huán)境對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激基因表達(dá)影響及外源性抗氧化物質(zhì)干預(yù)效果。采用靜電液滴法制備微囊化細(xì)胞,real-time PCR法檢測(cè)不同培養(yǎng)方式下血紅素加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶-A1(GST-A1)表達(dá);通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性、ELISA法檢測(cè)白蛋白含量,比較還原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)后指標(biāo)變化。結(jié)果顯示,培養(yǎng)第6 d和第16 d時(shí),微囊細(xì)胞中HO-1基因表達(dá)水平分別為同天數(shù)下平面細(xì)胞的4.9倍和3.1倍,GST-A1表達(dá)分別為平面細(xì)胞的11.2倍和33倍(P＜0.05);添加5~10 mmol/L NAC后,微囊化細(xì)胞活性較對(duì)照組增加40%~70%,白蛋白水平增加20%~30%(P＜0.05),而GSH在10 mmol/L時(shí)可使囊內(nèi)細(xì)胞活性增加20%~55%,白蛋白水平增加15%(P＜0.05)。結(jié)果提示微囊內(nèi)存在氧化應(yīng)激因素誘導(dǎo)基因表達(dá)改變,NAC和GSH能緩解其對(duì)細(xì)胞的抑制作用。
微囊泡(MVs)是指從細(xì)胞表面脫落或分泌的小圓球形膜樣結(jié)構(gòu), 含有母細(xì)胞來(lái)源脂質(zhì)、蛋白和遺傳物質(zhì)。近年來(lái), MVs作為細(xì)胞間信息傳遞的新途徑正逐漸引起學(xué)者們關(guān)注。干細(xì)胞來(lái)源MVs通過(guò)細(xì)胞內(nèi)化作用可轉(zhuǎn)移生物活性物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞, 在組織損傷模型中可重編程損傷組織細(xì)胞表型, 促進(jìn)組織再生和修復(fù)。其作用機(jī)制與MVs富含生物活性脂質(zhì)、抗凋亡因子、生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子, 轉(zhuǎn)移mRNA和調(diào)控miRNA到損傷組織細(xì)胞, 調(diào)控靶細(xì)胞功能有關(guān)。因此, 開(kāi)發(fā)干細(xì)胞來(lái)源MVs應(yīng)用于組織再生和修復(fù)治療, 可作為一種安全有效的無(wú)細(xì)胞治療策略。
目的探索細(xì)胞骨架解聚劑細(xì)胞松弛素D（Cyt D）和穩(wěn)定劑Jasplakinolide（Jasp）通過(guò)改構(gòu)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)對(duì)LPS作用后網(wǎng)格蛋白/微囊介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（VE-Cad）胞吞、膜VE-Cad表達(dá)和血管通透性的影響。 方法采用CRL-2922細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組均于組別對(duì)應(yīng)的時(shí)點(diǎn)檢測(cè)（空白對(duì)照組任意時(shí)點(diǎn)皆可）。①將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、LPS-1 h組及LPS-4 h組，觀察細(xì)胞骨架。②將細(xì)胞分為L(zhǎng)PS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，檢測(cè)網(wǎng)格蛋白/Cav1與VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad的表達(dá)水平。③將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，檢測(cè)單層細(xì)胞的累積熒光透過(guò)率。 結(jié)果①空白對(duì)照組中肌動(dòng)蛋白呈均勻散在分布，細(xì)胞骨架無(wú)明顯的聚合；LPS-1 h組中細(xì)胞骨架發(fā)生明顯的聚合，張力絲形成；LPS-4 h組中細(xì)胞骨架解聚，張力絲消失。②與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組中網(wǎng)格蛋白與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高（P<0.05），且膜VE-Cad的表達(dá)水平降低（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組中網(wǎng)格蛋白與VE-Cad的共沉淀水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），且膜VE-Cad的表達(dá)水平升高（P<0.05）。③與空白對(duì)照組比較，LPS-1 h組和LPS-4 h組的累積熒光透過(guò)率均較高（P<0.05）；與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組的累積熒光透過(guò)率較高（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組的累積熒光透過(guò)率較低（P<0.05）。 結(jié)論LPS作用后細(xì)胞骨架先發(fā)生聚合然后解聚，這種改構(gòu)促使VE-Cad胞吞途徑從由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到由微囊介導(dǎo)。
目的觀察探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性微囊泡（hUMSC-MV）對(duì)高糖誘導(dǎo)下大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法體外培養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠RGC；超速離心法分離提取并鑒定hUMSC-MV；觀察hUMSC-MV與RGC的內(nèi)化作用。實(shí)驗(yàn)分為正常RGC對(duì)照組（A組）、高糖對(duì)照組（B組）、正常共培養(yǎng)組（C組）、高糖共培養(yǎng)組（D組）進(jìn)行。A組細(xì)胞正常培養(yǎng)，B組細(xì)胞為33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)，C組細(xì)胞為hUMSC-MV培養(yǎng)，D組細(xì)胞為33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培養(yǎng)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8試劑盒測(cè)定各組RGC活性；采用膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）測(cè)量各組RGC凋亡率。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)各組RGC內(nèi)B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。 結(jié)果超速離心法提取的hUMSC-MV形態(tài)為單個(gè)或成簇的圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu)，直徑約為100～1000 nm。hUMSC-MV表面高表達(dá)CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達(dá)CD49f、第二型人類白血球抗原、CD34、CD45。大鼠RGC與hUMSCs-MV良好內(nèi)化。CCK-8及Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，B組細(xì)胞活性低于A、C、D組（F=107.92，P=0.000），B組細(xì)胞凋亡率高于A、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=382.11，P=0.000）。RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，B、D組RGC內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）以及Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達(dá)（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）均高于A、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步兩兩比較，D組RGC內(nèi)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)以及裂解的Caspase-3蛋白表達(dá)均高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論hUMSC-MV可通過(guò)降低高糖誘導(dǎo)下大鼠RGC內(nèi)Bax、Caspase-3的表達(dá)及活化，增加Bcl-2表達(dá)發(fā)揮對(duì)RGC損傷的保護(hù)作用。